专题05 基因工程的基本过程（期中真题汇编，山东专用）高二生物下学期

专题05 基因工程的基本过程 一、单选题 1．（24-25高二下·山东青岛·期中）水稻的B基因仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。科研人员设计实验获得了能在卵细胞中表达的B基因植株，过程如图。其中启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子，潮霉素抗性基因只在植物细胞中表达，Luc基因是荧光素酶基因。下列说法正确的是（    ） A．可从正常水稻精子和卵细胞中获得B基因的转录产物以获取目的基因 B．农杆菌转化法适用于双子叶植物和裸子植物，不能用于单子叶植物 C．过程①的筛选可以加入卡那霉素或潮霉素，但过程②只能加入潮霉素进行筛选 D．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的植株卵细胞是否发出荧光 2．（24-25高二下·山东菏泽·期中）下图为利用基因工程技术生产人生长激素的部分过程示意图，已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。下列说法错误的是（    ） A．质粒A通常需要经过限制酶处理，以便与目的基因结合 B．工程菌的构建过程中，a点的位置决定了目的基因的插入位置 C．将完成导入的细菌B接种在含氨苄青霉素培养基上，能生长的是导入质粒A的细菌 D．重组质粒导入细菌B后，在含四环素的培养基上能生长的细菌是工程菌 3．（24-25高二下·山东潍坊·期中）新城疫病毒(NDV)是一种可侵染肿瘤细胞的病毒。科研人员将编码猪α-(抗原的基因植入NDV获得了一种重组病毒，该病毒能使被感染肿瘤细胞表面表达猪α-Gla抗原，从而引发人体强烈的免疫反应。下列说法正确的是（    ） A．NDV和肿瘤细胞均属于生命系统最基本的结构层次 B．NDV可作为载体将目的基因送入肿瘤细胞 C．对NDV的基因进行改造使其在肿瘤细胞表达出猪α-Cla抗原属于蛋白质工程 D．在肿瘤细胞表面检测到猪a-Cla抗原即说明该重组病毒可用于治疗肿瘤 4．（24-25高二下·山东菏泽·期中）利用下图质粒和目的基因构建基因表达载体，为高效连接和筛选，结合表格中质粒上限制酶识别位点，推测目的基因上游和下游含有的限制酶识别位点组合可以为（　　） 限制酶 识别序列和切割位点 限制酶 识别序列和切割位点 XbaI 5'-T↓TCGAG-3' SacI 5'-C↓TCGAG-3' SmaI 5'-CCC↓GGG-3' HindIII 5'-A↓AGCTT-3' EcoRI 5'-A↓AATTT-3' BclI 5'-G↓AATTC-3' ①XbaI和SacI  ②SacI和EcoRI  ③XbaI和HindIII  ④SmaI和SacI  ⑤HindIII和EcoRI  ⑥XbaI和BclI A．③⑤ B．①③⑤ C．②③⑤⑥ D．①②③⑤⑥ 5．（24-25高二下·山东菏泽·期中）牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是一种单链RNA病毒，牛病毒性腹泻就是由BVDV引起的传染病。BVDV中结构蛋白E0和E2是主要抗原，据此科研人员利用基因工程制备了E2-E0融合基因，如图所示。为保证融合基因表达产物具有正确结构，科研人员制备出了牛乳腺生物反应器，从而获得E2-E0融合蛋白疫苗。下列说法错误的是（　　） A．在构建E2-E0融合基因之前，需先利用PCR技术直接从感染病毒的牛的细胞中获取目的基因 B．若要通过设计引物在E0基因的右侧添加限制酶的识别序列，应该添加在R2的5'端 C．E2-E0融合基因转录的模板链是B链 D．在导入牛的受精卵之前需要在E2基因的左侧加上在乳腺细胞中特异性表达的基因的启动子等调控序列 6．（24-25高二下·山东日照·期中）科研人员通过农杆菌转化法将鱼的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果植株。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化后能促进T-DNA的加工和转移，下列叙述错误的是（    ） A．构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和III来切割质粒 B．应在抗冻基因上游添加千禧果细胞中管家基因的启动子 C．在含有卡那霉素的培养基存活的农杆菌不一定含有抗冻基因 D．可用抗原—抗体杂交技术检测抗冻基因在转基因千禧果中的表达量 二、非选择题 7．（24-25高二下·山东菏泽·期中）基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。基本启动子没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子是含有特定碱基序列的DNA片段，很多增强子具有组织特异的活性，作用机理如图1所示。 (1)由图可知，增强子位于基本启动子的_______（填“上游”、“下游”或“上游或下游”）。根据启动子的作用推测，增强子是影响了________，从而激活基本启动子驱动基因转录。 (2)增强子、控制特定蛋白合成基因_______（填“必须”、“非必须”）位于同一条染色体上，增强子在不同组织中的活性______（填“相同”、“不一定相同”或“不同”）。 (3)“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图2），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图3），若观察到报告基因只在某些特定器官特异表达，鉴定出捕获载体的插入位点后再检测即可确定是否为该器官特异表达的基因。 ①增强子捕获载体除了包含图2所述结构外，还必须有_____。用______法将构建的“增强子捕获载体”导入斑马鱼受精卵，受体细胞选用受精卵的原因是_________（至少答出两点）。 ②若观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测__________。 8．（24-25高二下·山东枣庄·期中）幽门螺杆菌（Hp）可导致慢性胃炎等疾病，该菌的Ipp20基因编码其特有的抗原蛋白质，研究者欲利用基因工程制备Hp疫苗，用于预防幽门螺杆菌感染。如图表示基本操作流程，如表表示所用质粒上4种限制酶的识别序列及切割位点。 限制酶 BamHI XhoI SphI XbaI 识别序列切割位点 G↓CTAGC ↓TCGAG GCATG↓C C↓CATGG (1)质粒的基本组成单位是______，其中终止子的作用是________。 (2)限制酶SphI切割其识别序列产生的黏性末端是5'-_________-3'。构建基因表达载体时，为了确保将Ipp20基因正确连接在质粒上，最好选用_______酶切割Ipp20基因和质粒。 (3)将重组质粒导入大肠杆菌常用Ca2+处理，使其处于________的生理状态。后续采用影印法筛选出含有目的基因的大肠杆菌。用无菌毡布压在培养基A的菌落上，带出菌种，平移并压在培养基B上，培养一段时间后的结果，其中数字表示不同的菌落。根据以上步骤分析，培养基A中添加的抗生素是________，培养基A中的菌落中含有Ipp20基因的大肠杆菌形成的菌落是________（填数字）。 9．（24-25高二下·山东聊城·期中）多肉植物因其观赏性和耐旱易培的特点受到人的喜爱。研究人员以叶插繁殖能力强的多肉植物长寿花为实验材料，通过使用改良的“切-浸-芽”（CDB）方法实现了多肉植物的遗传转化和基因编辑，为多肉植物的遗传改良开辟了新途径。图1和图2分别表示利用常规转化法和CDB法在长寿花中递送基因的示意图。回答下列问题。 (1)无菌操作是图1操作成功的关键，诱导愈伤组织的固体培养基应采用______法灭菌。若①过程在诱导生芽的培养基上未形成芽但分化出了根，原因可能是生长素与细胞分裂素用量的比值______（填“偏高”或“偏低”），该过程还需要提供光照，目的是_______。 (2)为测试CDB法能否对长寿花实现遗传转化，研究人员用携带增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因）和除草剂抗性基因（bar基因）的农杆菌K599侵染外植体B，再将被侵染的外植体B放入充满湿润土壤的培养箱中培养。紫外灯下，实现遗传转化的转基因芽表现为______；农杆菌侵染植物细胞时可将外源基因递送到外植体B细胞中的原因是_____。 (3)为确定CDB法能否用于传递基因编辑工具，研究人员构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体，已知PDS蛋白缺失会导致植株白化。鉴定导入转基因长寿花B中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是______，依据是_____。 (4)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是：______。 一、单选题 1．（24-25高二下·山东泰安·期中）为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列说法错误的是（    ） A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上 B．利用物质K和氨苄青霉素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落 C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株 D．培养基中细胞分裂素和生长素的浓度、比例都会影响植物细胞的发育方向 2．（24-25高二下·山东青岛·期中）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到斑马鱼的DNA，最终筛选获得纯合G品系斑马鱼。为研究GFP基因插入的位置，依据插入位点的上下游序列设计了引物1、2，依据GFP基因上下游序列设计了引物3、4，各引物的位置如图1所示。将杂合G品系斑马鱼相互交配，提取子代所有个体的DNA，选取不同的引物组合进行PCR并电泳，得到电泳结果的类型如图2或图3所示。下列说法正确的是（    ） A．图2的电泳结果是选择了引物3、4得到的 B．为验证GFP基因插入方向是否正确可以选择引物1、3 C．图3的电泳结果是选择了引物1、3或引物2、4得到的 D．图2中代表纯合野生型个体的是1，图3中代表纯合G品系个体的是3 3．（2024·山东泰安·二模）凝胶阻滞试验（EMSA）的基本原理是：荧光标记的DNA与蛋白质结合后分子量增大，电泳后通过荧光检测可在相应位置显示出阻滞条带。已知O2蛋白通过与ZmGRAS11基因启动子区的motif序列结合来调控ZmGRAS11基因的表达，科学家为证实motif序列是与O2蛋白结合的关键序列，利用荧光标记的motif序列作为指示探针，无荧光标记的motif序列（WT）和无荧光标记的突变motif序列（M1～M6）作为7种竞争探针，进行EMSA试验，实验结束后进行荧光检测，结果如下图所示，下列说法错误的是（    ） 注：“+”表示加入相应物质；“-”表示未加入相应物质；竞争探针足够多 A．图中“？”是指荧光标记的指示探针 B．泳道3无阻滞条带的原因是O2蛋白全部与WT探针结合 C．在竞争探针中引入突变可评估突变对竞争探针与O2蛋白结合的影响 D．突变对探针M4～M6与O2蛋白结合能力影响相对较小的是M4、M5 二、不定项选择题 4．（24-25高二下·山东聊城·期中）苹果切开后颜色会加深的现象称为“褐变”，“褐变”是由于多酚氧化酶催化多酚类物质生成褐色素所致。培育抗褐变转基因苹果的操作流程如图。下列叙述正确的是（    ） A．图中的目的基因为多酚氧化酶基因，标记基因为卡那霉素抗性基因 B．目的基因的表达依赖上游的启动子，标记基因的表达则不需要启动子 C．步骤①是获得转基因苹果的核心工作，一般需要限制酶和DNA聚合酶的参与 D．可通过PCR技术检测苹果的染色体DNA上是否成功插入了目的基因 三、非选择题 5．（24-25高二下·山东德州·期中）炎症性肠病（IBD）是一种易导致结肠癌的慢性疾病，患者肠道内会产生硫代硫酸盐，且生成量与疾病严重程度呈正相关。科研人员将如图所示的基因表达载体导入大肠杆菌中制成智能工程菌，用于IBD的诊断。正常的LacZ基因编码的LacZ酶可使大肠杆菌菌落在含X-gal（无色）的培养基上呈现蓝色。突变基因A-LacZ无法表达LacZ酶，而B-sgRNA能使突变基因A-LacZ恢复正常序列。 注：启动子P为硫代硫酸盐诱导激活启动子；启动子Pc为持续表达启动子。 (1)将图示基因表达载体导入大肠杆菌时，需用______处理，目的是______。 (2)给小鼠饲喂智能工程菌后，在小鼠______中收集工程菌，然后将工程菌接种在含______的培养基中，若______，则说明小鼠患IBD。 (3)单克隆抗体是治疗IBD的有效药物。科研人员用单克隆抗体A基因构建特定基因表达载体，并导入大肠杆菌制成智能工程菌用于IBD的治疗。请在下图中完善基因表达载体的组成_______。 6．（24-25高二下·山东潍坊·期中）研究发现，雌果蝇在胚胎时期会切除dsx基因内部序列N转录出的mRNA片段，而雄果蝇无此切除功能。蓖麻毒素A(RTA)是一种能引起果蝇死亡的蛋白质，科研人员利用RTA基因和序列N构建N-RTA基因，研发雌性特异性致死基因系统。dsx 和RTA 基因结构如图，stop 表示终止密码子对应的DNA序列。 (1)启动子的作用是________________。图中X、Y、Z代表碱基对数目，若X=20,Y=80,Z=50,则自然状态下果蝇中dsx基因表达产物分子量较大的是_____________（填“雌果蝇”或“雄果蝇”)，雌雄果蝇的dsx基因表达产物最多相差_______个氨基酸。 (2)为了获得雌性特异性致死基因系统，在改造RTA基因时，序列N应插入_____________(填“位点1”或“位点2”),理由是_____________。 (3)科研人员将N-RTA基因与质粒重组后导入经_____________处理的大肠杆菌中进行扩增，然后再导入果蝇。对重组质粒进行扩增时用大肠杆菌而不用PCR,原因是_________________。 7．（24-25高二下·山东·期中）科研人员将OSNL（4个基因Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。 (1)可以将OSNL四个基因通过逆转录病毒导入孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的CEFs细胞，逆转录病毒的作用是______。 (2)诱导CEFs细胞形成iPGCs细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是______。 (3)将iPGCs细胞注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中得到的子代，体现iPGCs细胞具有______。子代相互交配产生了具有黑羽鸡表型特征的个体。该实验流程中用到的生物技术有______（答出2点即可）。 (4)随着诱导iPS细胞技术的成熟，诱导iPS细胞在医学上的应用优于胚胎干细胞的原因是______。（答出一条即可） 8．（24-25高二下·山东德州·期中）噬菌体展示抗体技术是一种通过基因工程将抗体基因片段与噬菌体外壳蛋白基因融合，使抗体片段展示于噬菌体表面，并结合高通量筛选技术获得高亲和力抗体的方法。VH基因和VL基因控制抗体重链可变区和轻链可变区，将VH基因和VL基因形成融合基因后，与噬菌体质粒PCOMB3X连接形成基因表达载体，借助辅助噬菌体在大肠杆菌中组装成新的噬菌体，并将单链抗体展示在噬菌体的外壳上，从而制备高通量的单克隆抗体。 (1)RT-PCR是以RNA为模板，扩增得到cDNA的方法，该方法需要的酶有______。若要获得VH基因和VL基因，需从免疫的动物体内的______（填“B淋巴细胞”或“T淋巴细胞”）中提取RNA，扩增得到VH基因和VL基因。 (2)获得VH基因和VL基因后，需通过重叠延伸PCR将VH基因和VL基因融合成SCFV（单链抗体）基因，两个基因之间通过一段柔性肽基因序列连接，并在融合基因的两端添加限制酶切序列，以便插入质粒PCOMB3X中。VH基因和VL基因的引物设计及连接后的融合基因如图1。据图分析，限制酶序列应添加在引物______的______（填“5'”或“3'”）端，柔性肽基因序列应添加在引物______上，且两个引物上添加的序列应为______（填“相同”或“互补”）序列。 (3)噬菌体质粒PCOMB3X的部分元件组成如图2。PⅢ蛋白基因编码的PⅢ蛋白是噬菌体的主要吸附蛋白，位于噬菌体尾端，其羧基端与DNA结合，氨基端伸出噬菌体外。PⅢ信号肽位于PⅢ蛋白氨基端，能引导PⅢ蛋白分泌到噬菌体外壳上。为保证SCFV能正确表达，且能随PⅢ蛋白分泌到噬菌体外壳上，应将SCFV基因插入______（填“PⅢ信号肽基因和PⅢ蛋白基因之间”或“PⅢ蛋白基因和终止子之间”）。将质粒与SCFV基因用限制酶和DNA连接酶进行处理，对大肠杆菌进行转化后，在大肠杆菌的培养基中加入氨苄青霉素，筛选得到的大肠杆菌______（填“一定”或“不一定”）含有SCFV，原因是______。 一、单选题 1．（24-25高二下·山东青岛·期中）Cre/loxP酶系统是由Cre酶和loxP序列两部分组成，该系统可以在DNA的特定位点上执行碱基序列的删除、插入以及重组等，从而实现基因的定点编辑。loxP位点是一段长为34bp的DNA序列，具有方向性，Cre酶能有效识别loxP序列并从特定位置切割，部分过程如图所示。下列说法错误的是（    ） A．Cre酶处理时具有限制酶和DNA连接酶的功能 B．为检测基因编辑是否成功，可用PCR扩增并进行电泳检测 C．两个loxP位点分别位于两条不同的染色体上时，Cre酶能引起染色体变异 D．Cre酶切割一个DNA分子上两个同向排列的loxP位点，保留片段1，实现基因编辑 2．（24-25高二下·山东·期中）转基因抗病毒木瓜运用了“病原体衍生抗性”原理，将木瓜环斑病毒（RNA病毒）的外壳蛋白基因（CP基因）经处理后由农杆菌转入木瓜基因组中，赋予木瓜植株对木瓜环斑病毒的抵抗力。下列叙述错误的是（　　） A．对CP基因进行处理需要用到逆转录酶和脱氧核苷酸 B．处理后的CP基因需构建基因表达载体，以保障其表达 C．通过农杆菌转化法将Ti质粒的部分片段整合到木瓜基因组 D．若在木瓜植株检测到CP基因，则说明其具有抗病毒能力 二、不定项选择题 3．（24-25高二下·山东日照·期中）肝脏合成的抗凝血酶Ⅲ是抗凝系统中最重要的成分，可抑制凝血酶生成，具有很强的抗凝活性，临床上可用抗凝血酶Ⅲ来治疗获得性和自发性的深静脉血栓。利用乳腺生物反应器和膀胱生物反应器来生产抗凝血酶Ⅲ，可使该药物的生产成本大大降低。下列叙述正确的是（    ） A．与正常人相比，肝病患者凝血速度更快，患血栓的风险更高 B．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和时间的限制 C．可通过PCR技术检测动物的染色体DNA上是否插入了抗凝血酶Ⅲ基因 D．与膀胱生物反应器相比，大肠杆菌作为受体细胞更易获得有活性的抗凝血酶Ⅲ 4．（24-25高二下·山东枣庄·期中）下图表示某基因表达载体中的潮霉素抗性基因和psy基因，有关叙述正确的是（    ） A．潮霉素抗性基因可以作为标记基因用于筛选 B．启动子的转录产物为mRNA的起始密码子 C．转录过程RNA聚合酶沿3'→5'方向读取模板链的碱基序列 D．潮霉素抗性基因和psy基因以同一条链为模板进行转录 三、非选择题 5．（24-25高二下·山东青岛·期中）基因敲除又称基因打靶，其原理如图所示：将构建好的打靶质粒导入特定细胞，打靶质粒上的A′、B′序列分别与细胞基因组DNA上的A、B序列发生交换（同源重组），使得目的基因被阳性标记基因替换，从而实现目的基因的敲除。已知同源重组的几率较低，也可能偶尔发生非同源重组（此时阳性和阴性标记基因均插入基因组DNA，而目的基因也仍在基因组DNA上）而导致基因敲除失败，阳性和阴性标记基因均只有位于基因组DNA上时才能表达。 (1)将打靶质粒导入特定动物细胞的方法是_______。动物减数分裂过程中，可能发生类似于上述阳性标记基因替换目的基因的过程，推测应在_______时期。 (2)现有两种标记基因，新霉素抗性基因neoR和疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk。导入新霉素抗性基因后，动物细胞对G418（氨基糖苷类抗生素）有抗性，没导入的没有抗性；HSV-tk的表达产物可使无毒的丙氧鸟苷转变为有毒的核苷酸，从而杀死细胞。在设计打靶质粒时，应以_____作为阳性标记基因，以________作为阴性标记基因。在培养基中添加________，以此筛选出基因敲除成功的细胞。 (3)成纤维生长因子1（FGF1）是一种内源性蛋白类激素，研究表明FGF1具有降低血糖的作用。FGF1可能通过提升胰岛素敏感性降低血糖水平但不能直接降低血糖水平，也可能直接具有降低血糖水平的作用。欲设计实验探究FGF1降低血糖浓度的原理，需敲除正常小鼠的_____基因作为模型小鼠进行实验。 6．（2024·山东泰安·模拟预测）为了将某纳米抗体和增强型绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题: (1)分别进行PCR扩增F1片段与F2片段时，配制的两个反应体系中不同的有______________。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R序列可能为________。 A．5′ATGGTG……CAACCA3′ B．5′TGGTTG……CACCAT3′ C．5′GACGAG……CTGCAG3′ D．5′CTGCAG……CTCGTC3′ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1-P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题05 基因工程的基本过程 一、单选题 1．D 2．D 3．B 4．C 5．A 6．A 二、非选择题 7．【答案】(1) 上游或下游 RNA聚合酶与基本启动子的识别和结合 (2) 非必须 不一定相同 (3) 标记基因、复制原点 显微注射 体积大，易操作；全能性高，易培养成完整个体 其他器官细胞中，G和H两个基因是否转录出相应的mRNA或是否翻译出相应的蛋白质 8．【答案】(1) 脱氧核苷酸 基因转录停止的区域（或终止转录） (2) CATG XhoI、XbaI (3) 能吸收周围环境中DNA 潮霉素 3、5 9．【答案】(1) 高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） 偏高 诱导形成叶绿素，有利于进行光合作用 (2) 发出绿色荧光 外源基因插入到农杆菌Ti质粒上的T-DNA后可转移到被侵染的外植体B细胞中，并与外植体B细胞的染色体DNA整合到一起 (3) 观察植株是否表现出白化性状 PDS基因缺失会导致植株白化，出现白化苗则说明通过基因编辑技术实现了PDS基因的敲除 (4)不需要植物组织培养技术、操作简单、培养周期短 一、单选题 1．B 2．B 3．D 二、不定项选择题 4．D 三、非选择题 5．【答案】(1) Ca2+ 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (2) 粪便 X-gal 出现蓝色的菌落 (3) 6．【答案】(1) RNA聚合酶识别和结合位点，驱动转录 雌果蝇 10 (2) 位点1 插入位点1时，只有雌性果蝇能表达完整的RTA蛋白导致死亡；插入位点2时，无论雌性还是雄性果蝇均能表达完整的RTA蛋白导致死亡 (3) Ca2+ PCR不能扩增出环状DNA分子 7．【答案】(1)作为载体，将OSNL四个外源基因送入CEFs细胞中 (2)诱导CEFs细胞形成iPGCs细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术 (3) 全能性 基因工程、动物细胞培养 (4)①iPS细胞可以用成体细胞直接诱导而成，避免破坏胚胎所引起的伦理问题；②iPS细胞可以来源于病人自身体细胞，移植回病人体内可避免免疫排斥 8．【答案】(1) 逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶 B淋巴细胞 (2) 1和8 4和5 互补 (3) PⅢ信号肽基因和PⅢ蛋白基因之间 不一定 若导入的是质粒PCOMB3X，而不是重组质粒，则不含SCFV 一、单选题 1．D 2．D 二、不定项选择题 3．AB 4．AC 三、非选择题 5．【答案】(1) 显微注射法 减数第一次分裂的前期 (2) 新霉素抗性基因（neoR） 疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk） G418和丙氧鸟苷 (3)胰岛素基因和FGF1基因 6．【答案】(1)模板（片段F1、片段F2）、引物 (2)CD (3)限制酶和DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题05 基因工程的基本过程 一、单选题 1．（24-25高二下·山东青岛·期中）水稻的B基因仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。科研人员设计实验获得了能在卵细胞中表达的B基因植株，过程如图。其中启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子，潮霉素抗性基因只在植物细胞中表达，Luc基因是荧光素酶基因。下列说法正确的是（    ） A．可从正常水稻精子和卵细胞中获得B基因的转录产物以获取目的基因 B．农杆菌转化法适用于双子叶植物和裸子植物，不能用于单子叶植物 C．过程①的筛选可以加入卡那霉素或潮霉素，但过程②只能加入潮霉素进行筛选 D．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的植株卵细胞是否发出荧光 【答案】D 【分析】1、基因工程的基本操作程序： （1）、目的基因的获取：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。 （2）、基因表达载体的构建：①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA；②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端；③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 （3）、将目的基因导入受体细胞。 （4）、目的基因的检测和表达：首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术；其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交；最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交；有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 2、分析题图：图中①表示将目的基因导入农杆菌，②表示采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，之后再采用植物组织培养技术获得转基因植株。 【详解】A、由题意可知，水稻的B基因仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录，所以不能从正常水稻卵细胞中获得B基因的转录产物，A错误； B、农杆菌转化法适用于大多数双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物也有一定的适用性（只是相对较难 ），并非不能用于单子叶植物，B错误； C、过程①是将重组载体导入农杆菌，载体上有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，潮霉素抗性基因只在植物细胞中表达，所以过程①筛选只能加入卡那霉素；过程②是农杆菌转化水稻愈伤组织，T−DNA上带有潮霉素抗性基因，过程②只能加入潮霉素筛选，C错误。 D、由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D正确。 故选D。 2．（24-25高二下·山东菏泽·期中）下图为利用基因工程技术生产人生长激素的部分过程示意图，已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。下列说法错误的是（    ） A．质粒A通常需要经过限制酶处理，以便与目的基因结合 B．工程菌的构建过程中，a点的位置决定了目的基因的插入位置 C．将完成导入的细菌B接种在含氨苄青霉素培养基上，能生长的是导入质粒A的细菌 D．重组质粒导入细菌B后，在含四环素的培养基上能生长的细菌是工程菌 【答案】D 【分析】图示表示将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的过程。质粒A上含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，构建基因表达载体后，破坏了质粒A的抗氨苄青霉素基因，但抗四环素基因正常，所以导入重组质粒或普通质粒的大肠杆菌都能抗四环素，但导入重组质粒的大肠杆菌不能抗氨苄青霉素。 【详解】A、质粒A通常需要经过限制酶处理，使其出现与目的基因两端相同的黏性末端，以便与目的基因结合，A正确； B、根据题意可知，a点为目的基因与质粒的结合点，因此工程菌的构建过程中，a点的位置决定了目的基因的插入位置，B正确； C、根据图示可知，质粒A上含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，构建基因表达载体后，破坏了质粒A的氨苄青霉素抗性基因，但四环素抗性基因正常，因此将完成导入的细菌B接种在含氨苄青霉素培养基上，能生长的是导入质粒A的细菌，C正确； D、由于质粒A和重组质粒上都有抗四环素基因，因此重组质粒导入细菌B后，在含四环素的培养基上能生长的细菌不一定是工程菌，也可能是导入了质粒A的细菌，D错误。 故选D。 3．（24-25高二下·山东潍坊·期中）新城疫病毒(NDV)是一种可侵染肿瘤细胞的病毒。科研人员将编码猪α-(抗原的基因植入NDV获得了一种重组病毒，该病毒能使被感染肿瘤细胞表面表达猪α-Gla抗原，从而引发人体强烈的免疫反应。下列说法正确的是（    ） A．NDV和肿瘤细胞均属于生命系统最基本的结构层次 B．NDV可作为载体将目的基因送入肿瘤细胞 C．对NDV的基因进行改造使其在肿瘤细胞表达出猪α-Cla抗原属于蛋白质工程 D．在肿瘤细胞表面检测到猪a-Cla抗原即说明该重组病毒可用于治疗肿瘤 【答案】B 【分析】题干描述了新城疫病毒（NDV）能侵染肿瘤细胞，科研人员通过将编码猪 α - Gla 抗原的基因植入 NDV，得到重组病毒 。此重组病毒可让被感染的肿瘤细胞表面表达猪 α - Gla 抗原，而该抗原能引发人体强烈免疫反应。这为后续从病毒作为载体送基因、基因工程应用及病毒治疗肿瘤可行性等角度设置问题做铺垫。 【详解】A、生命系统最基本的结构层次是细胞，NDV 是病毒，没有细胞结构，不属于生命系统最基本的结构层次，A 错误； B、由题意 “科研人员将编码猪 α - (抗原的基因植入 NDV 获得了一种重组病毒，该病毒能使被感染肿瘤细胞表面表达猪 α - Gla 抗原” 可知，NDV 可作为载体将目的基因（编码猪 α - Gla 抗原的基因）送入肿瘤细胞，B 正确； C、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。对 NDV 的基因进行改造使其在肿瘤细胞表达出猪 α - Gla 抗原，这是将外源基因导入病毒，不属于对现有蛋白质进行改造或制造新蛋白质，不属于蛋白质工程，C 错误； D、在肿瘤细胞表面检测到猪 α - Gla 抗原，只能说明重组病毒成功将目的基因导入肿瘤细胞并表达，但不能说明该重组病毒可用于治疗肿瘤，还需要进一步验证其引发的免疫反应是否能有效杀伤肿瘤细胞等，D 错误。 故选B。 4．（24-25高二下·山东菏泽·期中）利用下图质粒和目的基因构建基因表达载体，为高效连接和筛选，结合表格中质粒上限制酶识别位点，推测目的基因上游和下游含有的限制酶识别位点组合可以为（　　） 限制酶 识别序列和切割位点 限制酶 识别序列和切割位点 XbaI 5'-T↓TCGAG-3' SacI 5'-C↓TCGAG-3' SmaI 5'-CCC↓GGG-3' HindIII 5'-A↓AGCTT-3' EcoRI 5'-A↓AATTT-3' BclI 5'-G↓AATTC-3' ①XbaI和SacI  ②SacI和EcoRI  ③XbaI和HindIII  ④SmaI和SacI  ⑤HindIII和EcoRI  ⑥XbaI和BclI A．③⑤ B．①③⑤ C．②③⑤⑥ D．①②③⑤⑥ 【答案】C 【分析】限制酶是可以识别附着核酸链上的特定核苷酸序列,并对每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的-类酶，又称限制性核酸内切酶，化学本质为蛋白质。 【详解】①XbaI 和 SacI，这两种酶切割产生的黏性末端相同，会导致目的基因和质粒自身环化以及目的基因与质粒反向连接，①错误； ②SacI 和 EcoRI，位于启动子和终止子之间，且不破坏标记基因和复制原点，用这两种酶切割，便于连接和筛选，②正确； ③XbaI 和 HindIII，这两种酶切割产生的黏性末端不同，可避免质粒自身环化，切割位点合适，能保证目的基因正确插入和表达，且只破坏卡那霉素抗性基因，便于筛选，③正确； ④ SmaI 限制酶会破坏复制原点，不利于目的基因稳定存在，④错误； ⑤HindIII 和 EcoRI，这两种酶切割产生的黏性末端不同，能避免质粒自身环化，切割位点在合适区域，能保证目的基因正确插入和表达，且只破坏卡那霉素抗性基因，便于筛选，⑤正确； ⑥ XbaI 和 BclI，BclI 的识别序列和切割位点与 EcoRI 切割后产生的黏性末端相同（都有 -AATT- ），所以目的基因用XbaI 和 BclI切割，质粒用XbaI 和EcoRI 切割，采用了双酶切，能保证目的基因正确连接，也便于后续筛选，⑥正确。 故选C。 5．（24-25高二下·山东菏泽·期中）牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是一种单链RNA病毒，牛病毒性腹泻就是由BVDV引起的传染病。BVDV中结构蛋白E0和E2是主要抗原，据此科研人员利用基因工程制备了E2-E0融合基因，如图所示。为保证融合基因表达产物具有正确结构，科研人员制备出了牛乳腺生物反应器，从而获得E2-E0融合蛋白疫苗。下列说法错误的是（　　） A．在构建E2-E0融合基因之前，需先利用PCR技术直接从感染病毒的牛的细胞中获取目的基因 B．若要通过设计引物在E0基因的右侧添加限制酶的识别序列，应该添加在R2的5'端 C．E2-E0融合基因转录的模板链是B链 D．在导入牛的受精卵之前需要在E2基因的左侧加上在乳腺细胞中特异性表达的基因的启动子等调控序列 【答案】A 【分析】基因工程制备融合蛋白疫苗的关键步骤： 1、目的基因获取：牛病毒性腹泻病毒（BVDV）为单链 RNA 病毒，其结构蛋白基因（E2、E0）位于RNA上。 2、基因表达载体构建：需在目的基因上游添加组织特异性启动子（如乳腺细胞启动子），确保目的基因定向表达。 3、导入受体细胞：常用牛受精卵作为受体细胞，通过显微注射法导入重组载体。 【详解】A、BVDV的遗传物质为RNA，而PCR技术的模板为DNA。直接利用 PCR 从细胞中获取目的基因无法实现，应从感染病毒的牛细胞中提取病毒RNA →逆转录获得cDNA →以cDNA为模板进行PCR扩增目的基因，A错误； B、若要通过设计引物在E0基因的右侧添加限制酶的识别序列，应该添加在R2的5'端，B正确； C、转录的方向应为模板链的3'→5'，当以B链为模板时，正好与转录方向相同，C正确； D、乳腺生物反应器需目的基因在乳腺细胞中特异性表达，因此需在目的基因（E2-E0）上游添加乳腺细胞特异性启动子等调控元件，确保目的基因在乳腺组织中高效表达，D正确。 故选A。 6．（24-25高二下·山东日照·期中）科研人员通过农杆菌转化法将鱼的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果植株。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化后能促进T-DNA的加工和转移，下列叙述错误的是（    ） A．构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和III来切割质粒 B．应在抗冻基因上游添加千禧果细胞中管家基因的启动子 C．在含有卡那霉素的培养基存活的农杆菌不一定含有抗冻基因 D．可用抗原—抗体杂交技术检测抗冻基因在转基因千禧果中的表达量 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、限制酶Ⅱ切割会破坏Vir区的基因，影响T-DNA的加工和转移，因此不能选择限制酶Ⅱ来切割质粒，A错误； B、实验目的是将鱼的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果植株，所以应在抗冻基因上游添加千禧果细胞中管家基因的启动子，使抗冻基因在千禧果细胞中表达，B正确； C、在含有卡那霉素的培养基存活的农杆菌不一定含有抗冻基因，也可能该质粒中不含目的基因，C正确； D、基因的表达产物是蛋白质，故可用抗原—抗体杂交技术检测抗冻基因在转基因千禧果中的表达量，D正确。 故选A。 二、非选择题 7．（24-25高二下·山东菏泽·期中）基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。基本启动子没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子是含有特定碱基序列的DNA片段，很多增强子具有组织特异的活性，作用机理如图1所示。 (1)由图可知，增强子位于基本启动子的_______（填“上游”、“下游”或“上游或下游”）。根据启动子的作用推测，增强子是影响了________，从而激活基本启动子驱动基因转录。 (2)增强子、控制特定蛋白合成基因_______（填“必须”、“非必须”）位于同一条染色体上，增强子在不同组织中的活性______（填“相同”、“不一定相同”或“不同”）。 (3)“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图2），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图3），若观察到报告基因只在某些特定器官特异表达，鉴定出捕获载体的插入位点后再检测即可确定是否为该器官特异表达的基因。 ①增强子捕获载体除了包含图2所述结构外，还必须有_____。用______法将构建的“增强子捕获载体”导入斑马鱼受精卵，受体细胞选用受精卵的原因是_________（至少答出两点）。 ②若观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测__________。 【答案】(1) 上游或下游 RNA聚合酶与基本启动子的识别和结合 (2) 非必须 不一定相同 (3) 标记基因、复制原点 显微注射 体积大，易操作；全能性高，易培养成完整个体 其他器官细胞中，G和H两个基因是否转录出相应的mRNA或是否翻译出相应的蛋白质 【分析】1、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 2、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动转录。基因工程中，目的基因需要插入启动子和终止子之间。 【详解】（1）由图1可知，增强子可位于基本启动子的上游或下游，从图中能看到增强子位置不固定，可在基本启动子两侧 。启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录，推测增强子是影响了RNA聚合酶与基本启动子的识别和结合，从而激活基本启动子驱动基因转录，增强子通过与特定蛋白质结合等方式，协助RNA聚合酶与基本启动子结合。 （2）增强子、控制特定蛋白合成基因非必须位于同一条染色体上，增强子可通过空间结构等远距离调控基因表达，不一定在同一条染色体 。因为很多增强子具有组织特异的活性，所以增强子在不同组织中的活性不一定相同 ，不同组织中与增强子结合的特定蛋白质等存在差异，影响其活性。 （3）①基因表达载体的必备元件有启动子、目的基因、终止子、标记基因等，增强子捕获载体除图2结构外，还必须有标记基因 ，用于筛选含有载体的细胞；还需要有复制原点以便进行DNA复制。将载体导入斑马鱼受精卵常用显微注射法；选用受精卵作为受体细胞，原因是受精卵细胞全能性高，易发育成个体；受精卵体积大，便于操作；受精卵含有的营养物质丰富，利于外源基因整合和表达，保证载体能有效整合并使报告基因在个体发育中表达。 ②要确定基因G和H是否为心脏特异表达基因，应检测基因G和H在该动物心脏组织中的表达情况及在其他器官中的表达情况，即检测基因G和H其他器官细胞中，G和H两个基因是否转录出相应的mRNA或是否翻译出相应的蛋白质，若它们在心脏中表达，而在其他器官中不表达，则可能是心脏特异表达基因 。 8．（24-25高二下·山东枣庄·期中）幽门螺杆菌（Hp）可导致慢性胃炎等疾病，该菌的Ipp20基因编码其特有的抗原蛋白质，研究者欲利用基因工程制备Hp疫苗，用于预防幽门螺杆菌感染。如图表示基本操作流程，如表表示所用质粒上4种限制酶的识别序列及切割位点。 限制酶 BamHI XhoI SphI XbaI 识别序列切割位点 G↓CTAGC ↓TCGAG GCATG↓C C↓CATGG (1)质粒的基本组成单位是______，其中终止子的作用是________。 (2)限制酶SphI切割其识别序列产生的黏性末端是5'-_________-3'。构建基因表达载体时，为了确保将Ipp20基因正确连接在质粒上，最好选用_______酶切割Ipp20基因和质粒。 (3)将重组质粒导入大肠杆菌常用Ca2+处理，使其处于________的生理状态。后续采用影印法筛选出含有目的基因的大肠杆菌。用无菌毡布压在培养基A的菌落上，带出菌种，平移并压在培养基B上，培养一段时间后的结果，其中数字表示不同的菌落。根据以上步骤分析，培养基A中添加的抗生素是________，培养基A中的菌落中含有Ipp20基因的大肠杆菌形成的菌落是________（填数字）。 【答案】(1) 脱氧核苷酸 基因转录停止的区域（或终止转录） (2) CATG XhoI、XbaI (3) 能吸收周围环境中DNA 潮霉素 3、5 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的 DNA 是否插入目的基因−−PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA−−PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质−−抗原−抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）质粒的化学本质是环状DNA，质粒的基本组成单位是脱氧（核糖）核苷酸，构建的重组表达载体中终止子的作用是终止转录。 （2）据表可知限制酶SphI可识别CCATGG序列，且在CC之间切割，所以产生的黏性末端为CATG。基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因等，选择的限制酶应在质粒中存在识别位点，根据图示，筛选菌落时利用含有不同抗生素的选择培养基，据此可知应选择的限制酶是XbaI、XhoI，图中质粒上XhoI和XbaI酶切后会去掉一个标记基因，且黏性末端不同，可避免质粒的自身环化和随意连接，故适合做载体的质粒。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌时，常用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞壁的通透性增大，使之容易吸收周围环境中DNA分子。据图可知，目的基因的插入会破坏氯霉素抗性基因，但不会破坏潮霉素抗性基因，因此可将受体细胞接种到含有潮霉素的培养基A上，据图可知，符合要求的为3、5，依据是XhoI和XbaI酶切后切除掉了氯霉素抗性基因。 9．（24-25高二下·山东聊城·期中）多肉植物因其观赏性和耐旱易培的特点受到人的喜爱。研究人员以叶插繁殖能力强的多肉植物长寿花为实验材料，通过使用改良的“切-浸-芽”（CDB）方法实现了多肉植物的遗传转化和基因编辑，为多肉植物的遗传改良开辟了新途径。图1和图2分别表示利用常规转化法和CDB法在长寿花中递送基因的示意图。回答下列问题。 (1)无菌操作是图1操作成功的关键，诱导愈伤组织的固体培养基应采用______法灭菌。若①过程在诱导生芽的培养基上未形成芽但分化出了根，原因可能是生长素与细胞分裂素用量的比值______（填“偏高”或“偏低”），该过程还需要提供光照，目的是_______。 (2)为测试CDB法能否对长寿花实现遗传转化，研究人员用携带增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因）和除草剂抗性基因（bar基因）的农杆菌K599侵染外植体B，再将被侵染的外植体B放入充满湿润土壤的培养箱中培养。紫外灯下，实现遗传转化的转基因芽表现为______；农杆菌侵染植物细胞时可将外源基因递送到外植体B细胞中的原因是_____。 (3)为确定CDB法能否用于传递基因编辑工具，研究人员构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体，已知PDS蛋白缺失会导致植株白化。鉴定导入转基因长寿花B中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是______，依据是_____。 (4)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是：______。 【答案】(1) 高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） 偏高 诱导形成叶绿素，有利于进行光合作用 (2) 发出绿色荧光 外源基因插入到农杆菌Ti质粒上的T-DNA后可转移到被侵染的外植体B细胞中，并与外植体B细胞的染色体DNA整合到一起 (3) 观察植株是否表现出白化性状 PDS基因缺失会导致植株白化，出现白化苗则说明通过基因编辑技术实现了PDS基因的敲除 (4)不需要植物组织培养技术、操作简单、培养周期短 【分析】植物组织培养原理是植物细胞具有全能性，即已分化的细胞仍然具有发育成完整植株的潜能。过程：外植体（离体的植物组织、器官或细胞）经过脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再经过再分化形成根、芽等器官，进而发育成完整植株。植物激素的比例影响器官分化，生长素与细胞分裂素用量比值偏高利于生根，偏低利于生芽。 【详解】（1）诱导愈伤组织的固体培养基应采用高压蒸汽灭菌法灭菌，这是常用的对培养基进行灭菌的方法，可以有效杀灭各种微生物及其芽孢，保证培养基的无菌状态。在植物组织培养中，生长素与细胞分裂素用量的比值会影响植物器官的分化。若在诱导生芽的培养基上未形成芽但分化出了根，原因是生长素与细胞分裂素用量的比值偏高。因为当生长素比例相对较高时，有利于根的分化，而抑制芽的形成。该过程提供光照的目的是诱导叶绿素的形成，使植物能够进行光合作用合成有机物，为植物的生长发育提供物质和能量基础。 （2）因为农杆菌K599携带增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因），所以在紫外灯下，实现遗传转化的转基因芽表现为发出绿色荧光，这是绿色荧光蛋白基因表达的结果。农杆菌侵染植物细胞时可将外源基因递送到外植体B细胞中的原因是农杆菌Ti质粒上的T - DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。这样携带目的基因的T-DNA就能够进入植物细胞并稳定存在和表达。 （3）鉴定导入转基因长寿花B中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察植株是否表现出白化性状。依据是已知PDS蛋白缺失会导致植株白化，若导入的基因编辑载体成功发挥作用，PDS基因被敲除，那么植株就会因为PDS蛋白缺失而表现为白化；若植株未出现白化现象，则说明基因编辑载体未成功发挥作用。 （4）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是：不需要植物组织培养技术，直接形成转基因芽、培养周期短、操作简单。 一、单选题 1．（24-25高二下·山东泰安·期中）为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列说法错误的是（    ） A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上 B．利用物质K和氨苄青霉素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落 C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株 D．培养基中细胞分裂素和生长素的浓度、比例都会影响植物细胞的发育方向 【答案】B 【分析】1、农杆菌转化法的具体过程：（1）利用土壤的Ti质粒构建基因表达载体，即将目的基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上。（2）将整合了目的基因的Ti质粒导入土壤农杆菌细胞内。（3）利用土壤农杆菌感染植物细胞，该过程实际上是将含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒导入植物细胞内。（4）含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒进入植物细胞后，可以把自己的一段基因整合到细胞核中的染色体上，这段基因中包含了目的基因。 2、原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。 3、农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力；Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。 4、转化：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因（基因G）插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，A正确； B、农杆菌属于原核生物，含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，故不会出现农杆菌的蓝色菌落，B错误； C、根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确； D、提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值，有利于诱导生芽，降低培养基中细胞分裂素和生长素的比值，有利于生芽，所以培养基中细胞分裂素和生长素的浓度、比例都会影响植物细胞的发育方向，D正确。 故选B。 2．（24-25高二下·山东青岛·期中）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到斑马鱼的DNA，最终筛选获得纯合G品系斑马鱼。为研究GFP基因插入的位置，依据插入位点的上下游序列设计了引物1、2，依据GFP基因上下游序列设计了引物3、4，各引物的位置如图1所示。将杂合G品系斑马鱼相互交配，提取子代所有个体的DNA，选取不同的引物组合进行PCR并电泳，得到电泳结果的类型如图2或图3所示。下列说法正确的是（    ） A．图2的电泳结果是选择了引物3、4得到的 B．为验证GFP基因插入方向是否正确可以选择引物1、3 C．图3的电泳结果是选择了引物1、3或引物2、4得到的 D．图2中代表纯合野生型个体的是1，图3中代表纯合G品系个体的是3 【答案】B 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、若选择引物3、4进行PCR，由于GFP基因已整合到斑马鱼DNA中，纯合G品系斑马鱼有两个GFP基因，会扩增出两条大小相同的条带，杂合G品系斑马鱼有一个GFP基因，会扩增出一条条带，纯合野生型个体无GFP基因，无条带。图2中1无条带，2、3有一条条带，符合选择引物1、2对杂合G品系斑马鱼相互交配子代进行PCR的结果，而不是引物3、4，A错误； B、 如果选择引物1、3，若GFP基因插入方向正确，能进行PCR扩增得到条带；若插入方向错误，引物1和3无法正常结合到DNA上进行扩增，无条带，所以可以验证GFP基因插入方向是否正确，B正确； C、若选择引物1、3或引物2、4，对于纯合G品系斑马鱼会扩增出两条不同大小的条带，杂合G品系斑马鱼会扩增出三条条带（两条不同大小的来自插入GFP基因的片段，一条来自未插入的片段），纯合野生型个体有一条条带。图3中1有一条条带，2有三条条带，3有两条条带，不符合引物1、3或引物2、4的扩增结果，C错误； D、由前面分析可知，图2中1无条带，代表纯合野生型个体；图3中3有两条条带，代表杂合G品系个体，纯合G品系个体应是有两条相同大小条带的情况，图3中无符合的，D错误。 故选B。 3．（2024·山东泰安·二模）凝胶阻滞试验（EMSA）的基本原理是：荧光标记的DNA与蛋白质结合后分子量增大，电泳后通过荧光检测可在相应位置显示出阻滞条带。已知O2蛋白通过与ZmGRAS11基因启动子区的motif序列结合来调控ZmGRAS11基因的表达，科学家为证实motif序列是与O2蛋白结合的关键序列，利用荧光标记的motif序列作为指示探针，无荧光标记的motif序列（WT）和无荧光标记的突变motif序列（M1～M6）作为7种竞争探针，进行EMSA试验，实验结束后进行荧光检测，结果如下图所示，下列说法错误的是（    ） 注：“+”表示加入相应物质；“-”表示未加入相应物质；竞争探针足够多 A．图中“？”是指荧光标记的指示探针 B．泳道3无阻滞条带的原因是O2蛋白全部与WT探针结合 C．在竞争探针中引入突变可评估突变对竞争探针与O2蛋白结合的影响 D．突变对探针M4～M6与O2蛋白结合能力影响相对较小的是M4、M5 【答案】D 【分析】凝胶阻滞试验，又叫DNA迁移率变动的实验，是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。该方法用来研究DNA与特异性蛋白的相互作用，通常是放射性标记的DNA片段与纯化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。与游离DNA相比，蛋白质-DNA复合物的迁移率将降低，因此，与游离DNA相对应，人们将观察到带中的“阻滞”。 【详解】A、泳道1，没有加O2蛋白和竞争探针以及“?”，且只有一条指示探针条带，说明图中“?”是指荧光标记的指示探针，A正确； B、泳道3，加入了O2蛋白和无荧光标记的竞争探针WT探针以及荧光标记的指示探针，只有一条指示探针条带，且于泳道1的指示探针条带宽度相同，说明O2蛋白没有与荧光标记的指示探针结合，都与无荧光标记的竞争探针WT探针结合了，所以观察不到阻滞条带，B正确； C、O2蛋白与荧光标记的指示探针结合越多阻滞条带就会越宽，指示探针条带就会越窄，而对于加入无荧光标记的突变竞争探针会竞争性的与O2蛋白结合，从而使指示探针的条带会变宽，阻滞条带就会变窄，且突变的竞争探针与O2蛋白结合能力越强，阻滞条带就会越窄，因此在竞争探针中引入突变可评估突变对竞争探针与O2蛋白结合的影响，C正确； D、加入突变竞争探针M4、M5、M6的泳道，M6的阻滞条带最窄，说明突变的竞争探针中M6与O2蛋白结合能力最强，即M6发生的突变，对其与O2蛋白结合影响相对较小，D错误。 故选D。 二、不定项选择题 4．（24-25高二下·山东聊城·期中）苹果切开后颜色会加深的现象称为“褐变”，“褐变”是由于多酚氧化酶催化多酚类物质生成褐色素所致。培育抗褐变转基因苹果的操作流程如图。下列叙述正确的是（    ） A．图中的目的基因为多酚氧化酶基因，标记基因为卡那霉素抗性基因 B．目的基因的表达依赖上游的启动子，标记基因的表达则不需要启动子 C．步骤①是获得转基因苹果的核心工作，一般需要限制酶和DNA聚合酶的参与 D．可通过PCR技术检测苹果的染色体DNA上是否成功插入了目的基因 【答案】D 【分析】题图分析：过程①为构建目的基因表达的载体，过程②为获取受体细胞，过程③为将目的基因导入受体细胞，过程④为脱分化，过程⑤为再分化。 【详解】A、要想获得抗褐变的转基因苹果，应以抑制多酚氧化酶表达的基因作为目的基因，同时以卡那霉素抗性基因作为标记基因，A错误； B、启动子的作用是驱动基因的转录，目的基因的表达依赖上游的启动子，标记基因表达也需要启动子，B错误； C、过程①表示基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，一般需要限制酶和DNA连接酶的参与，C错误； D、检测苹果的染色体DNA上是否成功插入了目的基因可利用PCR技术，若插入成功，则可扩增出相应的基因（电泳中有相应的条带），D正确。 故选D。 三、非选择题 5．（24-25高二下·山东德州·期中）炎症性肠病（IBD）是一种易导致结肠癌的慢性疾病，患者肠道内会产生硫代硫酸盐，且生成量与疾病严重程度呈正相关。科研人员将如图所示的基因表达载体导入大肠杆菌中制成智能工程菌，用于IBD的诊断。正常的LacZ基因编码的LacZ酶可使大肠杆菌菌落在含X-gal（无色）的培养基上呈现蓝色。突变基因A-LacZ无法表达LacZ酶，而B-sgRNA能使突变基因A-LacZ恢复正常序列。 注：启动子P为硫代硫酸盐诱导激活启动子；启动子Pc为持续表达启动子。 (1)将图示基因表达载体导入大肠杆菌时，需用______处理，目的是______。 (2)给小鼠饲喂智能工程菌后，在小鼠______中收集工程菌，然后将工程菌接种在含______的培养基中，若______，则说明小鼠患IBD。 (3)单克隆抗体是治疗IBD的有效药物。科研人员用单克隆抗体A基因构建特定基因表达载体，并导入大肠杆菌制成智能工程菌用于IBD的治疗。请在下图中完善基因表达载体的组成_______。 【答案】(1) Ca2+ 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (2) 粪便 X-gal 出现蓝色的菌落 (3) 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）将基因表达载体导入大肠杆菌时，需用Ca2+处理，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （2）给小鼠饲喂智能工程菌后，在小鼠粪便中收集工程菌。当小鼠患IBD时，启动子P会让B-sgRNA基因表达，从而使突变基因A-LacZ恢复正常序列，即LacZ基因会编码蛋白质使大肠杆菌菌落在含X-gal（无色）的培养基上呈现蓝色（出现蓝色菌落），从而记录下曾经患过IBD的情况。 （3）基因表达载体一般包括启动子、目的基因(单克隆抗体A基因)和终止子。启动子P用于启动目的基因的转录，终止子用于终止转录，基因表达载体的组成如下： 。 6．（24-25高二下·山东潍坊·期中）研究发现，雌果蝇在胚胎时期会切除dsx基因内部序列N转录出的mRNA片段，而雄果蝇无此切除功能。蓖麻毒素A(RTA)是一种能引起果蝇死亡的蛋白质，科研人员利用RTA基因和序列N构建N-RTA基因，研发雌性特异性致死基因系统。dsx 和RTA 基因结构如图，stop 表示终止密码子对应的DNA序列。 (1)启动子的作用是________________。图中X、Y、Z代表碱基对数目，若X=20,Y=80,Z=50,则自然状态下果蝇中dsx基因表达产物分子量较大的是_____________（填“雌果蝇”或“雄果蝇”)，雌雄果蝇的dsx基因表达产物最多相差_______个氨基酸。 (2)为了获得雌性特异性致死基因系统，在改造RTA基因时，序列N应插入_____________(填“位点1”或“位点2”),理由是_____________。 (3)科研人员将N-RTA基因与质粒重组后导入经_____________处理的大肠杆菌中进行扩增，然后再导入果蝇。对重组质粒进行扩增时用大肠杆菌而不用PCR,原因是_________________。 【答案】(1) RNA聚合酶识别和结合位点，驱动转录 雌果蝇 10 (2) 位点1 插入位点1时，只有雌性果蝇能表达完整的RTA蛋白导致死亡；插入位点2时，无论雌性还是雄性果蝇均能表达完整的RTA蛋白导致死亡 (3) Ca2+ PCR不能扩增出环状DNA分子 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。据图可知雌果蝇在胚胎时期会切除dsx基因内部序列N转录出的mRNA片段，而雄果蝇无此切除功能，所以雌果蝇切除N序列的同时会把第一个stop点切除，即雌果蝇会把Z段基因表达，而雄果蝇的基因表达会在第一个stop点停止，即只表达X段基因，Z＞X，所以自然状态下果蝇中dsx基因表达产物分子量较大的是雌果蝇。Z-X=30对碱基，由于DNA的3对碱基能够表达出一个氨基酸，所以雌雄果蝇的dsx基因表达产物最多相差10个氨基酸。 （2）在改造RTA基因时，序列N应插入位点1可以获得雌性特异性致死基因系统，因为插入位点1时，只有雌性果蝇能表达完整的RTA蛋白导致死亡；插入位点2时，无论雌性还是雄性果蝇均能表达完整的RTA蛋白导致死亡。 （3）科研人员将N-RTA基因与质粒重组后导入经Ca2+处理的大肠杆菌中进行扩增，然后再导入果蝇。对重组质粒进行扩增时用大肠杆菌而不用PCR，原因是PCR不能扩增出环状DNA分子，现实中扩增环状DNA需要用限制酶切割后，在用DNA连接酶连接起来，得到环状产物。 7．（24-25高二下·山东·期中）科研人员将OSNL（4个基因Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。 (1)可以将OSNL四个基因通过逆转录病毒导入孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的CEFs细胞，逆转录病毒的作用是______。 (2)诱导CEFs细胞形成iPGCs细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是______。 (3)将iPGCs细胞注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中得到的子代，体现iPGCs细胞具有______。子代相互交配产生了具有黑羽鸡表型特征的个体。该实验流程中用到的生物技术有______（答出2点即可）。 (4)随着诱导iPS细胞技术的成熟，诱导iPS细胞在医学上的应用优于胚胎干细胞的原因是______。（答出一条即可） 【答案】(1)作为载体，将OSNL四个外源基因送入CEFs细胞中 (2)诱导CEFs细胞形成iPGCs细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术 (3) 全能性 基因工程、动物细胞培养 (4)①iPS细胞可以用成体细胞直接诱导而成，避免破坏胚胎所引起的伦理问题；②iPS细胞可以来源于病人自身体细胞，移植回病人体内可避免免疫排斥 【分析】胚胎干细胞（ES细胞）具有自我更新及多向分化潜能，为发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。iPS细胞技术是借助基因导入技术将某些特定因子基因导入动物或人的体细胞，以将其重编程或诱导为ES细胞样的细胞，即iPS细胞。 【详解】（1）OSNL四个基因是目的基因，孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的CEFs细胞是受体细胞，通过逆转录病毒将目的基因导入受体细胞中，逆转录病毒的作用是作为载体，将OSNL四个外源基因送入CEFs细胞中。 （2）诱导CEFs细胞形成iPCEFs细胞的技术是将已经分化的CEFs细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术。 （3）将iPGCS细胞到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，通过体外胚胎培养技术，得到的子代中会出现iPGCs发育为生殖器官的个体，体现iPGCs细胞具有全能性。这样的个体会产生含黑羽基因配子，相互交配产生了具有黑羽鸡表型特征的个体。该实验流程中用到的生物技术有基因工程、动物细胞培养和体外胚胎培养（答出2点即可）。 （4）随着诱导iPS细胞技术的成熟，诱导iPS细胞在医学上的应用优于胚胎干细胞的原因是有：①iPS细胞可以从成体细胞直接诱导而成，避免破坏胚胎所引起的伦理问题；②iPS细胞可以来源于病人自身体细胞，移植回病人体内可避免免疫排斥。 8．（24-25高二下·山东德州·期中）噬菌体展示抗体技术是一种通过基因工程将抗体基因片段与噬菌体外壳蛋白基因融合，使抗体片段展示于噬菌体表面，并结合高通量筛选技术获得高亲和力抗体的方法。VH基因和VL基因控制抗体重链可变区和轻链可变区，将VH基因和VL基因形成融合基因后，与噬菌体质粒PCOMB3X连接形成基因表达载体，借助辅助噬菌体在大肠杆菌中组装成新的噬菌体，并将单链抗体展示在噬菌体的外壳上，从而制备高通量的单克隆抗体。 (1)RT-PCR是以RNA为模板，扩增得到cDNA的方法，该方法需要的酶有______。若要获得VH基因和VL基因，需从免疫的动物体内的______（填“B淋巴细胞”或“T淋巴细胞”）中提取RNA，扩增得到VH基因和VL基因。 (2)获得VH基因和VL基因后，需通过重叠延伸PCR将VH基因和VL基因融合成SCFV（单链抗体）基因，两个基因之间通过一段柔性肽基因序列连接，并在融合基因的两端添加限制酶切序列，以便插入质粒PCOMB3X中。VH基因和VL基因的引物设计及连接后的融合基因如图1。据图分析，限制酶序列应添加在引物______的______（填“5'”或“3'”）端，柔性肽基因序列应添加在引物______上，且两个引物上添加的序列应为______（填“相同”或“互补”）序列。 (3)噬菌体质粒PCOMB3X的部分元件组成如图2。PⅢ蛋白基因编码的PⅢ蛋白是噬菌体的主要吸附蛋白，位于噬菌体尾端，其羧基端与DNA结合，氨基端伸出噬菌体外。PⅢ信号肽位于PⅢ蛋白氨基端，能引导PⅢ蛋白分泌到噬菌体外壳上。为保证SCFV能正确表达，且能随PⅢ蛋白分泌到噬菌体外壳上，应将SCFV基因插入______（填“PⅢ信号肽基因和PⅢ蛋白基因之间”或“PⅢ蛋白基因和终止子之间”）。将质粒与SCFV基因用限制酶和DNA连接酶进行处理，对大肠杆菌进行转化后，在大肠杆菌的培养基中加入氨苄青霉素，筛选得到的大肠杆菌______（填“一定”或“不一定”）含有SCFV，原因是______。 【答案】(1) 逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶 B淋巴细胞 (2) 1和8 4和5 互补 (3) PⅢ信号肽基因和PⅢ蛋白基因之间 不一定 若导入的是质粒PCOMB3X，而不是重组质粒，则不含SCFV 【分析】噬菌体展示技术利用了基因工程技术，将目的基因（外源蛋白基因）插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随噬菌体外壳蛋白基因的表达而表达，最终使得噬菌体获得目的基因控制的性状；基因工程的基本步骤包括目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）第一步：分析RT - PCR的酶需求。RT - PCR过程包含逆转录（RNA→cDNA）和PCR扩增（cDNA→大量DNA）两个阶段。逆转录需要逆转录酶，PCR扩增需要热稳定的TaqDNA聚合酶（因PCR循环有高温变性步骤，普通DNA聚合酶会失活）。 第二步：分析RNA的来源细胞。VH基因和VL基因对应抗体的可变区，抗体由B淋巴细胞（浆细胞）合成，因此需从B淋巴细胞中提取含VH、VL基因的mRNA（T淋巴细胞不合成抗体，无对应mRNA）。 （2）第一步：确定限制酶序列的添加位置。PCR中，引物与模板链互补结合，DNA合成方向为5’→3’，引物的3’端是延伸起点，5’端为游离端。为使扩增后的基因两端含限制酶切割位点，限制酶序列需加在引物的5’端（若加在3’端会干扰引物与模板的互补配对）。引物与模板链的3’端结合，故要使用引物1和8，才能将SCFV基因的全部序列扩增出来。 第二步：确定柔性肽基因序列的添加引物。VH基因和VL基因通过柔性肽基因连接，需在连接两者的引物上添加柔性肽序列。结合图1，VH基因的下游引物是引物4，VL基因的上游引物是引物5，因此柔性肽基因序列应加在引物4和引物5上。 第三步：分析柔性肽序列的关系。重叠延伸PCR中，两段引物上的柔性肽序列需互补，才能在扩增时通过碱基配对将VH和VL基因连接为一个整体。 （3）第一步：确定SCFV基因的插入位置。PⅢ信号肽的功能是引导PⅢ蛋白分泌到菌体外，为使SCFV随PⅢ蛋白分泌，需将SCFV基因插入PⅢ信号肽基因和PⅢ蛋白基因之间（若插入其他位置，无法借助PⅢ信号肽的引导作用）。 第二步：分析筛选结果的不确定性。质粒pCOMB3X自身含氨苄青霉素抗性基因（Ampr），若导入大肠杆菌的是未插入SCFV的空质粒（质粒自身环化后仍含Ampr），也能在含氨苄青霉素的培养基中存活。因此，筛选到的大肠杆菌不一定含SCFV。 一、单选题 1．（24-25高二下·山东青岛·期中）Cre/loxP酶系统是由Cre酶和loxP序列两部分组成，该系统可以在DNA的特定位点上执行碱基序列的删除、插入以及重组等，从而实现基因的定点编辑。loxP位点是一段长为34bp的DNA序列，具有方向性，Cre酶能有效识别loxP序列并从特定位置切割，部分过程如图所示。下列说法错误的是（    ） A．Cre酶处理时具有限制酶和DNA连接酶的功能 B．为检测基因编辑是否成功，可用PCR扩增并进行电泳检测 C．两个loxP位点分别位于两条不同的染色体上时，Cre酶能引起染色体变异 D．Cre酶切割一个DNA分子上两个同向排列的loxP位点，保留片段1，实现基因编辑 【答案】D 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 【详解】A、据题意和题图信息可知，Cre酶能有效识别loxP序列并从特定位置切割，与限制酶的功能类似，同时能将切割后的一个片段连接成环状片段1，与DNA连接酶的功能类似，A正确； B、为检测基因编辑是否成功，可通过PCR扩增编辑区域的DNA并进行电泳分析，可验证片段是否被删除或重组，B正确； C、若两个loxP位点位于不同染色体，Cre酶介导的切割和重连会导致染色体易位（非同源染色体间片段交换），属于染色体结构变异，C正确； D、Cre酶切割一个DNA分子上两个同向排列的loxP位点，片段1自身环化且带有待敲除基因，因此保留片段2，从而实现基因编辑，D错误。 故选D。 2．（24-25高二下·山东·期中）转基因抗病毒木瓜运用了“病原体衍生抗性”原理，将木瓜环斑病毒（RNA病毒）的外壳蛋白基因（CP基因）经处理后由农杆菌转入木瓜基因组中，赋予木瓜植株对木瓜环斑病毒的抵抗力。下列叙述错误的是（　　） A．对CP基因进行处理需要用到逆转录酶和脱氧核苷酸 B．处理后的CP基因需构建基因表达载体，以保障其表达 C．通过农杆菌转化法将Ti质粒的部分片段整合到木瓜基因组 D．若在木瓜植株检测到CP基因，则说明其具有抗病毒能力 【答案】D 【分析】农杆菌转化法：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的 Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。据此如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、木瓜环斑病毒是RNA病毒，其基因的本质是RNA，须经逆转录合成DNA以后才能导入到真核细胞的基因组中，A正确； B、经逆转录处理后合成DNA还需构建基因表达载体以后才能在植物细胞内表达，B正确； C、农杆菌转化法Ti质粒上的T-DNA部分才能转移到木瓜基因组中，C正确； D、若在木瓜植株检测到CP基因，则说明基因导入成功，但不一定表达成功，不一定抗病毒能力，D错误。 故选D。 二、不定项选择题 3．（24-25高二下·山东日照·期中）肝脏合成的抗凝血酶Ⅲ是抗凝系统中最重要的成分，可抑制凝血酶生成，具有很强的抗凝活性，临床上可用抗凝血酶Ⅲ来治疗获得性和自发性的深静脉血栓。利用乳腺生物反应器和膀胱生物反应器来生产抗凝血酶Ⅲ，可使该药物的生产成本大大降低。下列叙述正确的是（    ） A．与正常人相比，肝病患者凝血速度更快，患血栓的风险更高 B．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和时间的限制 C．可通过PCR技术检测动物的染色体DNA上是否插入了抗凝血酶Ⅲ基因 D．与膀胱生物反应器相比，大肠杆菌作为受体细胞更易获得有活性的抗凝血酶Ⅲ 【答案】AB 【分析】转基因生产药物是将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵，发育成的雌性个体产生的乳汁中含有所需的药物。 【详解】A、由题意可知，抗凝血酶Ⅲ由肝脏合成，因此肝脏有严重疾病的人，其血液中抗凝血酶Ⅲ比正常人的低，凝血速度更快，患血栓的风险更高，A正确； B、乳腺生物反应器只能从哺乳期雌性动物的乳汁中获得产物，膀胱生物反应器可以不论动物的性别和是否正处于生殖期，因此用膀胱生物反应器生产抗凝血酶Ⅲ的优势在于不受转基因动物的性别、年龄的限制，B正确； C、PCR技术只能检测抗凝血酶Ⅲ基因是否导入细胞，不能检测是否为染色体上的基因，C错误； D、大肠杆菌为原核生物，缺少内质网、高尔基体对其加工，不易获得有活性的抗凝血酶Ⅲ，D错误。 故选AB。 4．（24-25高二下·山东枣庄·期中）下图表示某基因表达载体中的潮霉素抗性基因和psy基因，有关叙述正确的是（    ） A．潮霉素抗性基因可以作为标记基因用于筛选 B．启动子的转录产物为mRNA的起始密码子 C．转录过程RNA聚合酶沿3'→5'方向读取模板链的碱基序列 D．潮霉素抗性基因和psy基因以同一条链为模板进行转录 【答案】AC 【分析】转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，该过程主要在细胞核中进行，需要RNA聚合酶参与。 【详解】A、潮霉素抗性基因可以作为标记基因用于筛选，筛选出含有目的基因的受体细胞，A正确； B、启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，使转录开始，启动子不对应mRNA的起始密码子，B错误； C、转录过程RNA聚合酶沿3'→5'方向读取模板链的碱基序列，而子链的延伸方向为5'→3'，C正确； D、根据图中潮霉素抗性基因和psy基因的启动子和终止子的位置可知，潮霉素抗性基因转录方向向左，psy基因转录方向向右，二者以不同的子链为模板进行转录，D错误。 故选AC。 三、非选择题 5．（24-25高二下·山东青岛·期中）基因敲除又称基因打靶，其原理如图所示：将构建好的打靶质粒导入特定细胞，打靶质粒上的A′、B′序列分别与细胞基因组DNA上的A、B序列发生交换（同源重组），使得目的基因被阳性标记基因替换，从而实现目的基因的敲除。已知同源重组的几率较低，也可能偶尔发生非同源重组（此时阳性和阴性标记基因均插入基因组DNA，而目的基因也仍在基因组DNA上）而导致基因敲除失败，阳性和阴性标记基因均只有位于基因组DNA上时才能表达。 (1)将打靶质粒导入特定动物细胞的方法是_______。动物减数分裂过程中，可能发生类似于上述阳性标记基因替换目的基因的过程，推测应在_______时期。 (2)现有两种标记基因，新霉素抗性基因neoR和疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk。导入新霉素抗性基因后，动物细胞对G418（氨基糖苷类抗生素）有抗性，没导入的没有抗性；HSV-tk的表达产物可使无毒的丙氧鸟苷转变为有毒的核苷酸，从而杀死细胞。在设计打靶质粒时，应以_____作为阳性标记基因，以________作为阴性标记基因。在培养基中添加________，以此筛选出基因敲除成功的细胞。 (3)成纤维生长因子1（FGF1）是一种内源性蛋白类激素，研究表明FGF1具有降低血糖的作用。FGF1可能通过提升胰岛素敏感性降低血糖水平但不能直接降低血糖水平，也可能直接具有降低血糖水平的作用。欲设计实验探究FGF1降低血糖浓度的原理，需敲除正常小鼠的_____基因作为模型小鼠进行实验。 【答案】(1) 显微注射法 减数第一次分裂的前期 (2) 新霉素抗性基因（neoR） 疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk） G418和丙氧鸟苷 (3)胰岛素基因和FGF1基因 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）将质粒导入动物细胞的方法是显微注射法。阳性标记基因替换目的基因的过程属于基因重组（同源重组），图中阳性标记基因替换目的基因，类似于减数第一次分裂前期的交叉互换。 （2）根据题干信息，新霉素抗性基因neoR可使细胞获得对新霉素的抗性，应以新霉素抗性基因neoR作为阳性标记基因，目的基因是被敲除不需要的基因，操作后目的基因应该与阴性标记基因连接在打靶质粒上，故以疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk作为阴性标记基因，便于对基因组DNA进行筛选。导入新霉素抗性基因后，动物细胞对G418（氨基糖苷类抗生素）有抗性，没导入的没有抗性；HSV-tk的表达产物可使无毒的丙氧鸟苷转变为有毒的核苷酸，从而杀死细胞。因此在培养基中添加G418和丙氧鸟苷，以此筛选出基因敲除成功的细胞。 （3）FGF1可能通过提升胰岛素敏感性降低血糖水平但不能直接降低血糖水平，也可能直接具有降低血糖水平的作用，若设计实验探究FGF1降低血糖浓度的原理，需敲除正常小鼠的胰岛素基因和FGF1基因作为模型小鼠进行实验。对模型小鼠施用FGF1，研究FGF1的作用。 6．（2024·山东泰安·模拟预测）为了将某纳米抗体和增强型绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题: (1)分别进行PCR扩增F1片段与F2片段时，配制的两个反应体系中不同的有______________。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R序列可能为________。 A．5′ATGGTG……CAACCA3′ B．5′TGGTTG……CACCAT3′ C．5′GACGAG……CTGCAG3′ D．5′CTGCAG……CTCGTC3′ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1-P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 【答案】(1)模板（片段F1、片段F2）、引物 (2)CD (3)限制酶和DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 【分析】据题图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，因此引物F2-F含有EGFP基因右侧部分碱基序列，引物F1-R含有AnB1基因左侧部分序列。 【详解】（1）PCR反应体系需要引物、酶、脱氧核苷酸、模板和缓冲液（一般缓冲液中要添加Mg2+）等。分别进行PCR扩增F1片段与F2片段时，配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。 （2）AB、根据思路分析，并结合图2中两基因序列可知，碱基序列5′ATGGTG……CAACCA3′、5′TGCTTG……CACCAT3′在EGFP基因序列左侧、AnB1基因序列右侧部分，不能达到扩增的目的，AB错误； CD、而碱基序列5′GACGAC……CTGCAG3′、5′CTGCAG……CTCGTC3′在AnBI基因左侧部分、在EGFP基因右侧部分，能达到扩增的目的，CD正确。 故选CD。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。 （4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可以低于30，A错误； B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 故选ABC。 （5）EGFP长度为720bp，AnBI长度为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物FI-F和F2-R进行了PCR扩增,其大小应接近两基因之和，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $