2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

1. 简述动物细胞融合的原理和方法。 2. 简述出单克隆抗体的制备过程，理解两次筛选的作用。 3. 理解单克隆抗体在诊断、治疗疾病中的应用。 第2章 细胞工程 第2节 动物细胞工程 二 动物细胞融合技术与单克隆抗体 A细胞 B细胞 A原生质体 B原生质体 正在融合的原生质体 杂种细胞 愈伤组织 杂种植株 移栽后的植株 ① ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 思考 那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢? 植物体细胞杂交技术的优势: 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育了植物新品种。 温故知新：植物体细胞杂交技术 温故知新：人—鼠细胞荧光标记融合实验 该实验说明： 细胞膜具有流动性 一、动物细胞融合 1.概念： 指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 2.原理： 细胞膜具有一定的流动性 3.结果： 形成杂交细胞 4.诱导方法： 物理法 电融合法等 化学法 聚乙二醇（PEG）融合法 生物法 灭活病毒诱导法 动物细胞融合特有 细胞核的融合 →具有原来两个或多个细胞的遗传信息。 6. 结果： 形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞。 5.融合实质及完成的标志： 一、动物细胞融合 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？ 2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？ 细胞核的融合 融合完成的标志： 某种病毒 紫外线 灭活 丧失感染活性(不感染细胞) 保留抗原结构(诱导细胞融合) 思考 一、动物细胞融合 8. 应用： 7.意义： 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。 至今，种间、属间、科间、甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。 生物种类 细胞来源 成功年代 酵母菌—鸡 原生质体—血红细胞 1975年 人—胡萝卜 腹水癌细胞—原生质体 1976年 人—小鼠 纤维肉瘤细胞—畸胎瘤细胞 1978年 (1)细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。 (2)利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞融合前的 处理方法 诱导细胞融合 的方法 细胞融合成功 的标志 意义 主要用途 细胞膜具有一定的流动性 植物细胞的全能性 细胞膜具有一定的流动性 用果胶酶和纤维素酶去壁 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞 电融合法、高Ca2+-高pH融合法； 离心法、聚乙二醇（PEG）融合法 聚乙二醇（PEG）融合法、 电融合法、灭活病毒诱导法 再生出细胞壁 细胞核的融合 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 获得完整的杂种植株 主要用于制造单克隆抗体 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较 归纳.小结 二、单克隆抗体及其应用 1.早期获得抗体的方法 产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、反应不灵敏 反复 注射 动物体内 抗原 多种浆细胞 多种抗体（血清） 每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体 体内产生的特异性抗体多达百万种 向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。 缺点： 二、单克隆抗体及其应用 2.单克隆抗体的制备思路 每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的淋巴细胞，形成细胞群。 每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 单一B淋巴细胞 单一B淋巴细胞群 选择 克隆 产生 大量纯度高特异性强的抗体 （单克隆抗体） 一个正常的B淋巴细胞不可能无限增殖的。 怎样才能使B细胞在产生抗体的同时，具备无限增殖能力呢？ 单个细胞 无性繁殖 化学性质单一，特异性强 单： 克隆： 抗体： 二、单克隆抗体及其应用 2.单克隆抗体的制备思路 动物细胞融合 动物细胞培养 单克隆抗体 【资料】1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案： 一种B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体） 骨髓瘤细胞（癌细胞）能在体外无限增殖 杂交瘤细胞 既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体 单克隆抗体：由单个B淋巴细胞经过克隆(无限增殖)，形成基因型相同的细胞群，由这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。 二、单克隆抗体及其应用 3.单克隆抗体的制备过程 诱导融合 免疫动物 注射特定的抗原 将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合 培养骨髓瘤细胞 从脾中提取 多种B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 (1)用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。 能产生抗体， 但不能大量增殖 不能产生抗体，但能大量增殖 PEG融合法、 电融合法、 灭活病毒诱导法 二、单克隆抗体及其应用 3.单克隆抗体的制备过程 (既能迅速大量增殖，又能产生抗体) (2)用特定的选择培养基(培养基中加入氨基蝶呤)进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 多种杂交细胞 杂交瘤细胞 第一次筛选 3种 B-B细胞 瘤-瘤细胞 B-瘤细胞 √ 资料卡:细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不断分裂增殖。如果它的D途径被阻断的话，它会因不能合成DNA而死亡。 思考 若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种?需要的是? 二、单克隆抗体及其应用 3.单克隆抗体的制备过程 杂交瘤细胞 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 (3)对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 检测原理:抗原一抗体杂交技术 ①将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个进行培养(克隆化培养)； ②一段时间后，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体(抗原抗体能结合即为阳性孔); ③阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3~4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。 二、单克隆抗体及其应用 用培养液 稀释培养 杂交瘤细胞(多种) 每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞 抗体检测呈 阳性的杂交瘤细胞 克隆化培养与抗体检测 多孔细胞培养板 二、单克隆抗体及其应用 3.单克隆抗体的制备过程 注射到小鼠腹腔内 体外培养 细胞培养液提取 小鼠腹水中提取 单克隆抗体 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 (4)将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养， 或注射到小鼠腹腔内增殖。 (5)从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。 特异性强， 灵敏度高， 可大量制备 二、单克隆抗体及其应用 4.单克隆抗体的制备过程中两次筛选的比较 项目 第一次筛选 第二次筛选 筛选 原因 目的 筛选 方法 筛选出杂交瘤细胞 筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞 用特定的选择培养基（HAT培养基）筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 克隆培养、抗体检测：用多孔细胞培养板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞 归纳.小结 大量单克隆抗体 第二次筛选：克隆化培养、抗体检测 多种杂交细胞及未融合的细胞 杂交瘤细胞 第一次筛选：用特定的选择培养基 骨髓瘤细胞 诱导融合 分泌特异抗体的杂交瘤细胞 已免疫的B淋巴细胞 动物细胞融合技术 动物细胞培养技术 (既能大量繁殖，又能产生抗体) 给小鼠注射特定抗原 细胞膜的流动性 细胞增殖 单克隆抗体的制备过程 提取 体外培养 注射到小鼠腹腔 二、单克隆抗体及其应用 二、单克隆抗体及其应用 【资料1】用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。 怀孕后，人体内的激素会发生较大改变，如绒毛膜促性腺激素的含量会大大增加，制备抗人绒毛膜促性腺激素的单克隆抗体来检测其尿液判断是否怀孕。 原理：抗原和抗体能够特异性结合 思考.讨论 二、单克隆抗体及其应用 【资料2】使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体一药物偶联物（antibody-drugconjugate，ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。 思考.讨论 二、单克隆抗体及其应用 1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。 药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。 2.除了细胞毒素外，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？ ①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗； ②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。 3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势? ①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高; 生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒; ②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。 思考.讨论 二、单克隆抗体及其应用 5.单克隆抗体的优点 (1)能准确地识别抗原的细微差异 (2)与特定抗原发生特异性结合 (3)可以大量制备 (1)广泛用作诊断试剂 利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。 (2)运载药物：如抗体-药物偶联物(ADC) 生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤。 (单抗导向，药物为弹头) 优点：位置准确、疗效高、副作用小 (3)直接用于治疗疾病 6.单克隆抗体的应用 单克隆抗体制备过程相关知识点检测 （1）该过程中应用到的技术_______________________________________ （2）原理_______________________________________ （3）注射特定抗原的目的______________________________________________ （4）诱导融合的方法______________________________________ 动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________ （5）第一次筛选的目的______________________ 第一次如何筛选___________________________ 筛选原理____________________________________________________ （6）杂交瘤细胞的特点__________________________________ 动物细胞融合、动物细胞培养 细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖 用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 灭活病毒诱导法 筛选获得杂交瘤细胞 用特定的选择培养基进行筛选 在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 既能迅速大量增殖，又能产生抗体 （7）第二次筛选的目的________________________________________________ 如何筛选________________________________________________________ 选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即__________________________________ （8）抗体检测原理_______________________________________ （9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________ （10）如何获取单克隆抗体 ①体外培养___________________________ ②小鼠腹腔内培养_________________________ （11）单克隆抗体的优点_____________________________ 获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选） 分泌的抗体能与特定的抗原结合 抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定） 在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖 从细胞培养液中获取 从小鼠腹水中获取 能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备 阳 单克隆抗体制备过程相关知识点检测 课堂小结 两个过程 动物细胞融合过程 单克隆抗体制备过程 三个“一” 一个诱导细胞融合的新方法 ——灭活病毒 一个新细胞 ——杂交瘤细胞 一个优势 ——单克隆抗体特异性强、灵敏度高、 可大量制备的优势 动物细胞融合技术与单克隆抗体 一、概念检测 1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ） A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性 B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合 C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞 D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株 C 2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ） A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒 B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体 C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞 D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为 单克隆抗体 A 练习与应用P51 二、拓展应用 练习与应用P51 假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。 可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。 但是,目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来些伦理方面的问题。 检测提升 1. (2023·黑龙江黑河市一模)人乳头瘤病毒(HPV)是一种DNA病毒，可诱发细胞癌变。抗HPV的单克隆抗体可以准确检测出HPV，从而及时监控宫颈癌的发生。以HPV衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体的过程如下图所示。下列叙述错误的是（ ） A.在HAT培养基上存活的杂交瘤细胞既能无限增殖又可以分泌抗体 B.单克隆抗体的特点是灵敏度高、特异性强，可以大量制备 C.可用HPV衣壳蛋白检测筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞 D.单克隆抗体制备过程涉及的生物学原理有细胞增殖和细胞膜的选择透过性 D 检测提升 2.(2022山东,15,2分)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是(　　) A.双抗可同时与2种抗原结合 B.利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞　 C.筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原 D.同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞 D 检测提升 3.(2022·东北三省联考)科学家将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，制成了抗体—药物偶联(ADC)，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，机理见图。回答下列问题： (1)制备单克隆抗体时，获得的杂交瘤细胞需进行________培养和抗体检测，抗体检测的原理是________________________。 (2)ADC中，抗体的作用是___________________________________________。 除细胞毒素外，图中的物质C还可以 。（答出两点即可) (3)图中细胞A为 ，结构B为一种细胞器，在细胞A中的作用是________________________。 (4)除ADC外，单克隆抗体在临床上的应用还有 (答出两点即可)。 克隆化 抗体与抗原特异性结合 与肿瘤细胞特异性结合，将物质C带到肿瘤细胞 放射性同位素、化学药物 肿瘤细胞 水解抗体，释放出物质C 作为诊断试剂；单独使用治疗疾病 Lavf55.33.100 单克隆抗体的制备过程 jasmine $