3.4蛋白质工程的原理和应用（情境专练）生物人教版选择性必修3

第三章 基因工程 第四节 蛋白质工程的原理和应用情境化练习题 情境创新练（2大知识）+素养拓展练（教材深挖+情境速递） 知识点 1 蛋白质工程原理及操作流程 1．（江西省吉安市2026届高三一模生物试题）天然β-淀粉酶（M0）大多耐热性差，不利于工业化应用。科研人员将β-淀粉酶第2位的酪氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸可与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，从而获得了耐高温β-淀粉酶（M1）。下列叙述错误的是（　　） A．上述获得M1的过程属于蛋白质工程范畴 B．M0与M1耐热性的差异与两者的空间结构有关 C．检测M1活性时应先将M1与底物混合再设置高温环境 D．替换氨基酸的过程涉及到对相关基因的改造 2．（2026·湖北黄石·二模）为提升α-淀粉酶的工业应用价值，研究人员将该酶分子第162位的天冬氨酸（D）定点突变为赖氨酸（K），获得了D162K突变酶。为探究其特性，测定了不同温度下突变酶与天然酶的活性，结果如下图。下列叙述正确的是（　　） A．通过蛋白质工程直接改变α-淀粉酶的氨基酸序列，可获取D162K突变酶 B．若将90℃处理后的D162K突变酶置于55℃，其酶活性会恢复至峰值 C．据图可知，与天然α-淀粉酶相比，D162K突变酶的热稳定性较好 D．D162K突变酶比天然α-淀粉酶降低化学反应活化能的能力更强 3．（2026·河北邯郸·一模）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料难以降解，易造成严重的环境污染。科研人员从某种细菌中发现了一种能降解PET的酶（PETase），但其热稳定性和降解效率较低。通过分析PETase的三维结构，将其中第238位的甘氨酸替换为酪氨酸后，获得的新型酶（FAST-PETase）在40～50℃下的降解效率提高了数百倍，其在塑料回收中展现出应用前景。下列叙述错误的是（    ） A．改造PETase从根本上是对其编码基因进行修饰 B．对PETase分子结构与功能的深入了解是成功改造的关键 C．获得FAST-PETase的基因后，可将其直接导入工程菌用于工业化生产 D．该改造体现了“从预期功能出发→设计蛋白质结构→改造基因”的蛋白质工程思路 4．（2026·贵州黔东南·三模）天然胰岛素易形成二聚体，使得其治疗效果被降低。科研人员通过蛋白质工程使胰岛素第28位的脯氨酸替换为天冬氨酸，从而抑制了胰岛素的聚合。由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。下列叙述错误的是（　　） A．改造胰岛素从根本上讲就是改造胰岛素的相关基因 B．若要改变蛋白质的功能，可以对蛋白质的氨基酸序列进行改进 C．通过定点突变技术获得的新的胰岛素基因可直接导入大肠杆菌，用于发酵生产 D．通过蛋白质工程对胰岛素改造的过程中，对蛋白质分子结构的了解是非常关键的 5．（25-26高三下·湖南长沙·月考）天然胰岛素在体内易形成二聚体，需解离为单体才能发挥降糖作用，这导致了起效延迟。为解决此问题，科学家利用蛋白质工程对胰岛素进行精准改造，将胰岛素B链第28位上的脯氨酸（Pro）与第29位上的赖氨酸（Lys）互换，进而获得目标胰岛素（INS，基因长度为330bp）。图1为天然胰岛素B链的部分DNA序列，图2表示利用PCR技术获取目标胰岛素基因的部分过程，图3为pET-INS表达载体构建示意图，图4为凝胶电泳结果图。据图分析，回答下列问题。 (1)蛋白质工程构建目标胰岛素需从_______出发。根据图1、图2（黑框代表天然胰岛素B链基因突变位置，R1、R2、F1与F2为对应的引物）综合分析，利用PCR技术获取目标胰岛素基因时，所用突变引物R1和F2对应的序列分别为_______（填选项）。 A． B． C． D． (2)为确保INS正确插入图3的质粒pET-MCS中，经相应酶切割后，质粒pET保留的黏性末端序列应为5'-_______-3'和5'-_______-3'。 (3)将重组质粒pET-INS导入感受态大肠杆菌，并置于含_______的培养基中，挑取8个长势良好的单菌落进行PCR扩增以及扩增产物的凝胶电泳，结果见图4.图中7个条带大小均为330bp左右，说明_______。 (4)不同生物对编码同一氨基酸的不同密码子的使用频率存在差异，该现象称为密码子的偏好性。为提高在大肠杆菌中目标胰岛素基因的表达量，请从密码子的简并性和偏好性的角度，提出一条可行性强的措施：_______。 6.（2026·河南郑州·二模）t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的氨基酸替换后，能显著降低出血副作用。请回答下列问题： (1)科学家将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA突变蛋白的生物技术手段属于__________范畴。 (2)改造t-PA基因序列可以利用如图1所示的基因定点突变技术。图1表示重叠延伸PCR技术，其中第1对引物是指__________，两对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是______。不选择产物A进一步延伸的原因是________。 (3)据图可知，重叠延伸时，需要的引物是_________，引物的作用是__________。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因_________。 (4)若获得的t-PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶________切开，才能与t-PA突变基因高效连接。mlacZ表达产物会把细胞染为蓝色，否则为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有_______的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌的表型是______。 知识点 2 蛋白质工程应用及实例 1．（2026届广西南宁市普通高中毕业班第二次适应性测试生物学试卷）几丁质酶是一类糖苷水解酶，可有效降解病原生物中的几丁质，在农作物病虫害防治中具有广泛应用前景。科研人员利用蛋白质工程技术对源于溶珊瑚弧菌的几丁质酶进行改造：保留氨基端功能区域，同时在其羧基端融合陆生真菌几丁质结合保守域。改造后的几丁质酶与几丁质的结合能力显著提升，酶活性和抑菌能力也明显增强。下列相关说法错误的是（　　） A．几丁质和几丁质酶均属于以碳链为骨架的生物大分子 B．几丁质酶的结构差异取决于氨基端和羧基端之间氨基酸的连接方式 C．上述对几丁质酶的改造实质是改造溶珊瑚弧菌相关基因的结构 D．用几丁质酶取代杀虫剂应对农作物病虫害可有效避免生物富集 2．（25-26高三下·浙江·开学考试）为提高玉米中赖氨酸含量，科学家通过蛋白质工程将天冬氨酸激酶的第352位苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶的第104位天冬氨酸变成异亮氨酸。下列有关说法正确的是（　　） A．直接改造上述两种蛋白质的空间结构 B．对指导上述两种酶合成的mRNA进行改造 C．对控制上述两种酶的基因碱基序列进行改造 D．利用诱变技术促使上述两种酶的基因突变 3．（2026·四川绵阳·二模）基因PCR定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR是发展最早的定点突变技术，其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（    ） A．蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质 B．应将引物1、2与引物3、4置于两个独立的反应体系中 C．步骤④使用DNA聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸 D．步骤⑤中如果完成6轮循环一共需要消耗63个引物1 4．（2026·湖南长沙·三模）哺乳动物的苦味受体（TAS2R16）能识别苦味物质，绝大多数哺乳动物的TAS2R16某特定位点为赖氨酸（K），人类和白面僧面猴却独立演化出了天冬酰胺（N）。科学家通过蛋白质工程将白面僧面猴该位点处的N替换为K后，其对苦味的敏感性显著下降。下列叙述错误的是（    ） A．以上研究为分子生物学证据，是判断物种间进化关系的直接证据 B．经科学家蛋白质工程改造后的白面僧面猴增加了该物种的遗传多样性 C．若白面僧面猴TAS2R16中N替换为K，将导致其种群基因库组成发生改变 D．人类的TAS2R16该位点上天冬酰胺（N）的出现，对物种的繁衍有积极意义 5．（2026·河北唐山·一模）乳腺癌严重威胁着人类的健康。癌细胞需要从内环境吸收天冬酰胺，使用外源天冬酰胺酶降解内环境中的天冬酰胺可抑制癌细胞增殖，正常细胞能合成天冬酰胺，受影响较小。回答下列问题： (1)使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入_________等天然成分。与正常组织细胞不同，乳腺癌细胞因失去_________特性，可在培养瓶中堆叠生长。培养箱中通入CO2的主要作用是_________ (2)天冬酰胺酶具有一定水解谷氨酰胺的酶活性，长期使用会对正常细胞造成损伤。为降低天冬酰胺酶的副作用，可通过_________工程改造其结构。已知天冬氨酸密码子为GAU/GAC，甘氨酸密码子为GGU/GGC/GGA/GGG，若通过单个碱基对的替换将天冬酰胺酶中第50位的天冬氨酸（见图1）替换为甘氨酸，需将模板链中5'-GTC-3＇序列突变为5'_________3'。 (3)为实现单碱基对的定点突变，应选用引物_________（填编号）对质粒1进行全质粒扩增。全质粒扩增产物为线性DNA，从DNA聚合酶作用角度分析，原因是_________。在去除模板质粒的PCR产物中加入_________以得到质粒2.将质粒1和质粒2分别导入大肠杆菌后，可用___法检测目的基因是否表达成功。 (4)图2显示了改造前后的天冬酰胺酶对两种氨基酸的水解活性，据图分析改造后的酶作为候选药物的优势为_________。 （一）教材知识链接 1．蛋白质工程的目标是？ 2.不能直接对天然的蛋白质进行改造的原因？ 3. 天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的：基因→ →形成具有特定 的多肽链→形成 →行使生物功能：而蛋白质工程却与之相反，它的基本途径是： 。（P94“教材”） 4.蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为 。（P95“教材”） 5.酶制剂在食品工业、医药工业等方面都有广泛的应用。现在，酶制剂的生产已经形成一个市场可观的新兴产业。蛋白质工程的应用又为酶制剂产业的发展提供了强大助力。酶用作工业催化剂，比无机催化剂具有更大的优越性，主要体现在以下几__________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________。因此,酶制剂在工业领域得到了广泛的应用。近年来，通过引进国外先进设备、优良________以及开发________________，我国酶制剂产业保持了较快的增长态势，品种越来越丰富，产品的市场竞争力也在不断提升。在酶制剂产业中，蛋白质工程被广泛用于 ，如提高酶的热稳定性，增加某些被用作去污剂的酶的去污效率等。（P96“到社会中去”）。 （二）教材深挖拓展 1.蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的 的基础上进行的，它最终要达到的目的是 。（P96“概念检测T2”改编） 2.T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的耐热性，科学家首先对影响T4溶菌酶耐热性的一些重要结构进行了研究。然后以此为依据对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸。于是，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。这项工作属于 的范畴。在该实例中引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是 。如果要将改造后的T4溶菌酶应用于生产实践,还有很多工作需要做。例如由于改造后酶的空间结构发生了变化,因此它的一些基本特性需要重新明确,包括 等。（P96“拓展应用”改编） 3.为了生产药物，常把药用蛋白基因构建的表达载体导入大肠杆菌或酵母菌细胞中构建工程菌，选用细菌或酵母菌作为受体细胞的优点有哪些？ 4.与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器的优点是 ？ 5．某同学认为只要知道了氨基酸的序列就可以利用蛋白质工程制造出各种特定功能的蛋白质，你认为他的说法科学吗？________。说明你的理由： 6.利用蛋白质工程将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，如何对现有的基因进行改造？ 学科网（北京）股份有限公司 $ 第三章 基因工程 第四节 蛋白质工程的原理和应用情境化练习题 情境创新练（2大知识）+素养拓展练（教材深挖+情境速递） 知识点 1 蛋白质工程原理及操作流程 1．C 2．C 3．C 4．C 5．【答案】(1) 预期蛋白质的功能（不形成二聚体，能迅速发挥作用） BC (2) TA AGCT (3) 卡那霉素 目标胰岛素基因INS已经成功导入大肠杆菌 (4)根据胰岛素中氨基酸序列和大肠杆菌偏好的密码子，改变相应脱氧核苷酸序列 6.【答案】(1)蛋白质工程 (2) 突变引物FP2和通用引物RP2 突变引物FP2和突变引物RP1之间能碱基互补配对，会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率 DNA子链只能从引物的3’端延伸，与产物A的方向相反 (3) 通用引物FP1和通用引物RP2 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 退火（复性）温度过低、引物特异性不高 (4) XmaⅠ、BglⅡ 新霉素 菌落呈白色 知识点 2 蛋白质工程应用及实例 1．B 2．C 3．C 4.A 5．【答案】(1) 血清 接触抑制 维持培养液的pH (2) 蛋白质 5'-GCC-3' (3) 2和3 DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3'端，不能将线性DNA相连 DNA连接酶 抗原—抗体杂交 (4)与改造前相比，改造后的天冬酰胺酶水解天冬酰胺的酶活性显著提高、水解谷氨酰胺的酶活性明显降低，说明显著提高了对癌细胞增殖的抑制作用，降低了长期使用对正常细胞造成损伤的副作用 （一）教材知识链接 1．根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构基因和转组中稳定存在，且能够正常表达。 2．任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，如果对蛋白质直接进行改造，即便成功，改造的蛋白质也无法遗传。 3.表达（转录和翻译） 氨基酸序列 具有高级结构的蛋白质 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核甘酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 4.蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。（P95“教材”） 5.由于酶促反应能在常温、常压和中性pH条件下进行，因此可以节省大量的能源和设备投资；生产过程中不会造成严重的污染，符合环境保护的要求；生产过程简单、效率高，产品质量好，生产成本低 菌种 新型酶制剂 开发酶的新品种或改进酶的性能 （二）教材深挖拓展 1.结构与功能关系 改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求 2.蛋白质工程 基因的碱基序列发生了变化 它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等;需要建立规模化生产该酶的技术体系,评估生产成本 3.细菌和酵母菌繁殖速度快，多为单细胞，遗传物质相对少，生产能力大等 4.从转基因动物一出生就可以收集产物，不用考虑动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显著的优势在于从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。 5．不科学，蛋白质的功能除了与氨基酸的序列有关以外，还与其特定的空间结构有关。 6. 改变决定干扰素分子上半胱氨酸的碱基序列，改变其碱基的种类使其控制合成的氨基酸为丝氨酸 学科网（北京）股份有限公司 $ 第三章 基因工程 第四节 蛋白质工程的原理和应用情境化练习题 情境创新练（2大知识）+素养拓展练（教材深挖+情境速递） 知识点 1 蛋白质工程原理及操作流程 1．（江西省吉安市2026届高三一模生物试题）天然β-淀粉酶（M0）大多耐热性差，不利于工业化应用。科研人员将β-淀粉酶第2位的酪氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸可与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，从而获得了耐高温β-淀粉酶（M1）。下列叙述错误的是（　　） A．上述获得M1的过程属于蛋白质工程范畴 B．M0与M1耐热性的差异与两者的空间结构有关 C．检测M1活性时应先将M1与底物混合再设置高温环境 D．替换氨基酸的过程涉及到对相关基因的改造 【答案】C 【知识点】酶的特性、蛋白质工程原理及操作流程 【详解】A、科研人员通过改变β- 淀粉酶中氨基酸的种类，获得了耐高温β-淀粉酶（M1），这属于对现有蛋白质进行改造，因此上述获得M1的过程属于蛋白质工程范畴，A正确； B、蛋白质的结构决定其功能，M0 与M1 耐热性的差异与两者的空间结构有关，由于M1中形成了二硫键，其空间结构与M0不同，从而导致耐热性也不同，B正确； C、检测 M1 活性时应先将M1置于高温环境中处理一段时间，使M1在高温下保持一定时间后，再与底物混合，C错误； D、蛋白质是由基因控制合成的，替换氨基酸的过程需要通过对相关基因进行改造，使其表达出具有特定氨基酸序列的蛋白质，D正确。 2．（2026·湖北黄石·二模）为提升α-淀粉酶的工业应用价值，研究人员将该酶分子第162位的天冬氨酸（D）定点突变为赖氨酸（K），获得了D162K突变酶。为探究其特性，测定了不同温度下突变酶与天然酶的活性，结果如下图。下列叙述正确的是（　　） A．通过蛋白质工程直接改变α-淀粉酶的氨基酸序列，可获取D162K突变酶 B．若将90℃处理后的D162K突变酶置于55℃，其酶活性会恢复至峰值 C．据图可知，与天然α-淀粉酶相比，D162K突变酶的热稳定性较好 D．D162K突变酶比天然α-淀粉酶降低化学反应活化能的能力更强 【答案】C 【知识点】酶的特性、蛋白质工程原理及操作流程、验证性实验与探究性实验 【详解】A、蛋白质工程的操作对象是基因，通过改造和合成基因来改造蛋白质，或合成新的蛋白质，A错误； B、高温会破坏酶的空间结构，若将90℃处理后的D162K突变酶置于55℃，其酶活性不会再恢复至峰值，B错误； C、据图可知，与天然α-淀粉酶（90℃失活）相比，D162K突变酶的热稳定性较好，C正确； D、两种酶在各自最适温度下活性基本相同，无法说明D162K突变酶比天然α-淀粉酶降低化学反应活化能的能力更强，D错误。 故选C。 3．（2026·河北邯郸·一模）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料难以降解，易造成严重的环境污染。科研人员从某种细菌中发现了一种能降解PET的酶（PETase），但其热稳定性和降解效率较低。通过分析PETase的三维结构，将其中第238位的甘氨酸替换为酪氨酸后，获得的新型酶（FAST-PETase）在40～50℃下的降解效率提高了数百倍，其在塑料回收中展现出应用前景。下列叙述错误的是（    ） A．改造PETase从根本上是对其编码基因进行修饰 B．对PETase分子结构与功能的深入了解是成功改造的关键 C．获得FAST-PETase的基因后，可将其直接导入工程菌用于工业化生产 D．该改造体现了“从预期功能出发→设计蛋白质结构→改造基因”的蛋白质工程思路 【答案】C 【知识点】蛋白质工程原理及操作流程 【详解】A、蛋白质是由基因编码的，要对蛋白质进行改造，从根本上来说就是要对其编码基因进行修饰，A正确； B、蛋白质工程的前提是明确蛋白质结构与功能的对应关系，对PETase分子结构与功能的深入了解才能实现针对性改造，是成功改造的关键，B正确； C、获得FAST-PETase的基因后，需要先构建基因表达载体后才能导入工程菌，使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达，C错误； D、蛋白质工程的基本思路就是从预期功能出发，设计出具有相应功能的蛋白质结构，然后根据蛋白质结构推测出对应的氨基酸序列，进而确定相应的基因序列，对基因进行改造，D正确。 4．（2026·贵州黔东南·三模）天然胰岛素易形成二聚体，使得其治疗效果被降低。科研人员通过蛋白质工程使胰岛素第28位的脯氨酸替换为天冬氨酸，从而抑制了胰岛素的聚合。由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。下列叙述错误的是（　　） A．改造胰岛素从根本上讲就是改造胰岛素的相关基因 B．若要改变蛋白质的功能，可以对蛋白质的氨基酸序列进行改进 C．通过定点突变技术获得的新的胰岛素基因可直接导入大肠杆菌，用于发酵生产 D．通过蛋白质工程对胰岛素改造的过程中，对蛋白质分子结构的了解是非常关键的 【答案】C 【知识点】蛋白质工程原理及操作流程、蛋白质工程的应用及实例分析 【详解】A、蛋白质的结构由对应的基因决定，且改造后的基因可稳定遗传，因此改造胰岛素从根本上讲就是改造胰岛素的相关基因，A正确； B、蛋白质的功能由结构决定，氨基酸序列是蛋白质的一级结构，对氨基酸序列进行改进可改变蛋白质的空间结构，进而改变蛋白质的功能，B正确； C、获得的新胰岛素基因属于真核来源基因，含有内含子，大肠杆菌为原核生物，缺乏剪接内含子的转录后加工机制，直接导入无法合成有功能的胰岛素；且目的基因必须先构建基因表达载体才能导入受体细胞，不能直接导入大肠杆菌，C错误； D、蛋白质工程需要明确蛋白质结构和功能的对应关系，才能实现针对性改造，因此对蛋白质分子结构的了解是非常关键的，D正确。 5．（25-26高三下·湖南长沙·月考）天然胰岛素在体内易形成二聚体，需解离为单体才能发挥降糖作用，这导致了起效延迟。为解决此问题，科学家利用蛋白质工程对胰岛素进行精准改造，将胰岛素B链第28位上的脯氨酸（Pro）与第29位上的赖氨酸（Lys）互换，进而获得目标胰岛素（INS，基因长度为330bp）。图1为天然胰岛素B链的部分DNA序列，图2表示利用PCR技术获取目标胰岛素基因的部分过程，图3为pET-INS表达载体构建示意图，图4为凝胶电泳结果图。据图分析，回答下列问题。 (1)蛋白质工程构建目标胰岛素需从_______出发。根据图1、图2（黑框代表天然胰岛素B链基因突变位置，R1、R2、F1与F2为对应的引物）综合分析，利用PCR技术获取目标胰岛素基因时，所用突变引物R1和F2对应的序列分别为_______（填选项）。 A． B． C． D． (2)为确保INS正确插入图3的质粒pET-MCS中，经相应酶切割后，质粒pET保留的黏性末端序列应为5'-_______-3'和5'-_______-3'。 (3)将重组质粒pET-INS导入感受态大肠杆菌，并置于含_______的培养基中，挑取8个长势良好的单菌落进行PCR扩增以及扩增产物的凝胶电泳，结果见图4.图中7个条带大小均为330bp左右，说明_______。 (4)不同生物对编码同一氨基酸的不同密码子的使用频率存在差异，该现象称为密码子的偏好性。为提高在大肠杆菌中目标胰岛素基因的表达量，请从密码子的简并性和偏好性的角度，提出一条可行性强的措施：_______。 【答案】(1) 预期蛋白质的功能（不形成二聚体，能迅速发挥作用） BC (2) TA AGCT (3) 卡那霉素 目标胰岛素基因INS已经成功导入大肠杆菌 (4)根据胰岛素中氨基酸序列和大肠杆菌偏好的密码子，改变相应脱氧核苷酸序列 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、蛋白质工程原理及操作流程、电泳鉴定 【分析】基因工程的基本操作程序包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）蛋白质工程与基因工程的核心区别在于“逆向设计”——基因工程是从基因到蛋白质（中心法则正向），而蛋白质工程是先明确目标蛋白质的功能需求，再反向推导对应的基因序列。题目中目标胰岛素的核心需求是“不形成二聚体，快速解离为单体发挥降糖作用”，这是改造的核心目的。所以蛋白质工程需从预期蛋白质的功能（不形成二聚体，能迅速发挥作用）出发。天然胰岛素B链的碱基序列为：5′……ACACACCCAAGACCC……3′3′……TGTGTGGGTTCTGGG……5′突变后，编码第28、29位氨基酸的碱基发生改变，序列变为：5′……ACACAAAGCCCACCC……3′，分析图2的引物方，F1和F2是正向引物，与模板链的3′端互补，方向为5′→3′。引物R1和R2是反向引物，与编码链的3′端互补，方向为5′→3′。与突变后的模板链（3′→5′）互补，因此F2的5′→3′序列为：5′—ACACAAAGCCCACCC—3′，对应选项C；引物R1：与突变后的编码链（5′→3′）互补，因此R1的5′→3′序列为：5′—GGGTGGGCTTTGTGT—3′，对应选项B。 （2）目的基因INS插入质粒pET－MCS时，需用相同限制酶切割质粒和目的基因，确保黏性末端互补。图3中目的基因两侧的限制酶为NdeⅠ和HindⅢ。限制酶切割规则：NdeⅠ识别序列为CATATG，切割后产生黏性末端5′－TA－3′（CATATG切割位点：C↓ATATG，产生5′－CATATG－3′和3′－GTATAC－5′，黏性末端为5′－TA－3′）；HindⅢ识别序列为AAGCTT，切割后产生黏性末端5′－AGCT－3′（AAGCTT切割位点：A↓AGCTT，产生5′－AAGCT－3′和3′－TTCGA－5′，黏性末端为5′－AGCT－3′）。 （3）图3分析：重组质粒pET-INS中含有的抗性基因是Kanr，含重组质粒的大肠杆菌能抵抗卡那霉素，因此培养基需添加卡那霉素，淘汰未导入重组质粒的大肠杆菌。图4可知，7个菌落的PCR扩增产物均为330bp，说明目标胰岛素基因INS已经成功导入大肠杆菌（每个单菌落均含重组质粒，PCR扩增出目的基因）。条带亮度反映DNA扩增产物的量，条带不明显说明扩增产物少。 （4）目标胰岛素的氨基酸序列固定（需保证功能不变），可利用密码子简并性，将人源胰岛素基因的密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子，提高翻译效率，进而增加表达量。可行性措施为根据胰岛素中氨基酸序列和大肠杆菌偏好的密码子，改变相应脱氧核苷酸序列（即密码子优化）。 6.（2026·河南郑州·二模）t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的氨基酸替换后，能显著降低出血副作用。请回答下列问题： (1)科学家将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA突变蛋白的生物技术手段属于__________范畴。 (2)改造t-PA基因序列可以利用如图1所示的基因定点突变技术。图1表示重叠延伸PCR技术，其中第1对引物是指__________，两对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是______。不选择产物A进一步延伸的原因是________。 (3)据图可知，重叠延伸时，需要的引物是_________，引物的作用是__________。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因_________。 (4)若获得的t-PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶________切开，才能与t-PA突变基因高效连接。mlacZ表达产物会把细胞染为蓝色，否则为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有_______的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌的表型是______。 【答案】(1)蛋白质工程 (2) 突变引物FP2和通用引物RP2 突变引物FP2和突变引物RP1之间能碱基互补配对，会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率 DNA子链只能从引物的3’端延伸，与产物A的方向相反 (3) 通用引物FP1和通用引物RP2 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 退火（复性）温度过低、引物特异性不高 (4) XmaⅠ、BglⅡ 新霉素 菌落呈白色 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、蛋白质工程原理及操作流程 【详解】（1）由题干信息可知，生产改良t-PA蛋白的技术是先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的改良t-PA蛋白，因此属于蛋白质工程。 （2）第一对引物扩增右边一段DNA且对中间部分进行突变，因此第一对引物为突变引物FP2和通用引物RP2；突变引物FP2和突变引物RP1之间能碱基互补配对，会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率，所以两对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行；DNA子链只能从引物的3’端延伸，与产物A的方向相反，因此不选择产物A进一步延伸。 （3）据图可知，重叠延伸时，需要的引物是通用引物FP1和通用引物RP2；DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3'端开始延伸DNA链，因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。出现非目的序列产物的原因有：引物设计太短（或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性）、两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）、复性温度过低、Mg2+浓度过高、DNA模板出现污染等。 （4）根据图中目的基因两端的黏性末端（5'-CCGG-3'和5'-GATC-3'）以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即新霉素抗性基因为标记基因，作用是便于筛选出成功导入质粒（普通质粒和重组质粒）的大肠杆菌。培养基中形成菌落的受体细胞应该包含两种类型：一类是导入普通质粒的大肠杆菌，这类大肠杆菌细胞因为含有mlacZ基因而呈蓝色；另一类是导入重组质粒的大肠杆菌，因为其中的mlacZ基因在构建重组质粒时被破坏，则该细菌表现为白色。因此需选择呈白色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t-PA蛋白的工程菌。 知识点 2 蛋白质工程应用及实例 1．（2026届广西南宁市普通高中毕业班第二次适应性测试生物学试卷）几丁质酶是一类糖苷水解酶，可有效降解病原生物中的几丁质，在农作物病虫害防治中具有广泛应用前景。科研人员利用蛋白质工程技术对源于溶珊瑚弧菌的几丁质酶进行改造：保留氨基端功能区域，同时在其羧基端融合陆生真菌几丁质结合保守域。改造后的几丁质酶与几丁质的结合能力显著提升，酶活性和抑菌能力也明显增强。下列相关说法错误的是（　　） A．几丁质和几丁质酶均属于以碳链为骨架的生物大分子 B．几丁质酶的结构差异取决于氨基端和羧基端之间氨基酸的连接方式 C．上述对几丁质酶的改造实质是改造溶珊瑚弧菌相关基因的结构 D．用几丁质酶取代杀虫剂应对农作物病虫害可有效避免生物富集 【答案】B 【知识点】生物大分子以碳链为骨架、蛋白质工程的应用及实例分析 【详解】A、几丁质属于多糖，几丁质酶属于蛋白质，二者都是以碳链为骨架的生物大分子，A正确； B、所有蛋白质中氨基酸之间的连接方式都是通过肽键相连，蛋白质结构差异取决于氨基酸的种类、数目、排列顺序，以及肽链盘曲折叠形成的空间结构，并非氨基酸的连接方式，B错误； C、蛋白质工程改造蛋白质的实质是改造编码蛋白质的基因结构，C正确； D、化学杀虫剂难以降解，会沿食物链发生生物富集，几丁质酶本质是蛋白质，可被生物降解，取代杀虫剂能避免生物富集，D正确。 故选B。 2．（25-26高三下·浙江·开学考试）为提高玉米中赖氨酸含量，科学家通过蛋白质工程将天冬氨酸激酶的第352位苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶的第104位天冬氨酸变成异亮氨酸。下列有关说法正确的是（　　） A．直接改造上述两种蛋白质的空间结构 B．对指导上述两种酶合成的mRNA进行改造 C．对控制上述两种酶的基因碱基序列进行改造 D．利用诱变技术促使上述两种酶的基因突变 【答案】C 【知识点】基因突变、蛋白质工程原理及操作流程、蛋白质工程的应用及实例分析 【详解】A、蛋白质工程通过改造基因间接改变蛋白质结构，而非直接修饰蛋白质空间结构（如高温、强酸等物理化学方法），A错误； B、mRNA是基因转录的产物，改造mRNA无法遗传至子代，且蛋白质工程的核心是基因层面的改造，B错误； C、蛋白质工程需对目标基因的碱基序列进行定向修饰（如定点突变），从而改变氨基酸序列和蛋白质功能，符合题干中替换特定氨基酸的操作，C正确； D、诱变技术（如辐射、化学诱变剂）属于基因突变，具有随机性和不定向性，无法精确控制特定氨基酸的替换，D错误。 故选C。 3．（2026·四川绵阳·二模）基因PCR定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR是发展最早的定点突变技术，其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（    ） A．蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质 B．应将引物1、2与引物3、4置于两个独立的反应体系中 C．步骤④使用DNA聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸 D．步骤⑤中如果完成6轮循环一共需要消耗63个引物1 【答案】C 【知识点】PCR扩增的原理与过程、蛋白质工程的应用及实例分析 【详解】A、蛋白质工程是通过改造基因来设计具有新功能的蛋白质，能够创造自然界中原本不存在的蛋白质，A正确； B、引物1、2用于扩增含突变位点的上游片段，引物3、4用于扩增含突变位点的下游片段。若将四组引物置于同一反应体系，会导致引物交叉结合、干扰PCR产物的特异性，因此需在两个独立的反应体系中分别扩增上下游片段，B正确； C、步骤④使用DNA聚合酶可对分子乙进行延伸，甲不可延伸，C错误； D、PCR过程中，引物的消耗数量为2n+1－2（n为循环数），初始模板不消耗引物。6轮循环后，总产物数为27－2=126，因此消耗的引物1数量为126÷2=63，D正确。 故选C。 4．（2026·湖南长沙·三模）哺乳动物的苦味受体（TAS2R16）能识别苦味物质，绝大多数哺乳动物的TAS2R16某特定位点为赖氨酸（K），人类和白面僧面猴却独立演化出了天冬酰胺（N）。科学家通过蛋白质工程将白面僧面猴该位点处的N替换为K后，其对苦味的敏感性显著下降。下列叙述错误的是（    ） A．以上研究为分子生物学证据，是判断物种间进化关系的直接证据 B．经科学家蛋白质工程改造后的白面僧面猴增加了该物种的遗传多样性 C．若白面僧面猴TAS2R16中N替换为K，将导致其种群基因库组成发生改变 D．人类的TAS2R16该位点上天冬酰胺（N）的出现，对物种的繁衍有积极意义 【答案】A 【知识点】基因频率的改变与生物进化、蛋白质工程原理及操作流程、蛋白质工程的应用及实例分析、生物有共同祖先的证据 【详解】A、分子生物学证据（如蛋白质序列差异）属于间接证据，化石才是判断物种进化关系的直接证据；A错误； B、经蛋白质工程改造后的白面僧面猴，其TAS2R16蛋白的氨基酸序列发生了改变，这属于可遗传的变异，增加了该物种的遗传多样性，B正确； C、若将白面僧面猴TAS2R16中N替换为K，属于基因突变，突变后的基因会进入种群基因库，导致基因库组成改变，C正确； D、人类TAS2R16位点演化出N可提高苦味敏感性，有助于规避有毒食物，增强生存适应性，对物种繁衍具有积极意义，D正确。 5．（2026·河北唐山·一模）乳腺癌严重威胁着人类的健康。癌细胞需要从内环境吸收天冬酰胺，使用外源天冬酰胺酶降解内环境中的天冬酰胺可抑制癌细胞增殖，正常细胞能合成天冬酰胺，受影响较小。回答下列问题： (1)使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入_________等天然成分。与正常组织细胞不同，乳腺癌细胞因失去_________特性，可在培养瓶中堆叠生长。培养箱中通入CO2的主要作用是_________ (2)天冬酰胺酶具有一定水解谷氨酰胺的酶活性，长期使用会对正常细胞造成损伤。为降低天冬酰胺酶的副作用，可通过_________工程改造其结构。已知天冬氨酸密码子为GAU/GAC，甘氨酸密码子为GGU/GGC/GGA/GGG，若通过单个碱基对的替换将天冬酰胺酶中第50位的天冬氨酸（见图1）替换为甘氨酸，需将模板链中5'-GTC-3＇序列突变为5'_________3'。 (3)为实现单碱基对的定点突变，应选用引物_________（填编号）对质粒1进行全质粒扩增。全质粒扩增产物为线性DNA，从DNA聚合酶作用角度分析，原因是_________。在去除模板质粒的PCR产物中加入_________以得到质粒2.将质粒1和质粒2分别导入大肠杆菌后，可用___法检测目的基因是否表达成功。 (4)图2显示了改造前后的天冬酰胺酶对两种氨基酸的水解活性，据图分析改造后的酶作为候选药物的优势为_________。 【答案】(1) 血清 接触抑制 维持培养液的pH (2) 蛋白质 5'-GCC-3' (3) 2和3 DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3'端，不能将线性DNA相连 DNA连接酶 抗原—抗体杂交 (4)与改造前相比，改造后的天冬酰胺酶水解天冬酰胺的酶活性显著提高、水解谷氨酰胺的酶活性明显降低，说明显著提高了对癌细胞增殖的抑制作用，降低了长期使用对正常细胞造成损伤的副作用 【知识点】PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定、蛋白质工程的应用及实例分析、动物细胞培养技术 【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由于人们对动物细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入血清等天然成分。癌细胞具有无限增殖的能力，培养癌细胞的过程中不会发生接触抑制现象。可见，与正常组织细胞不同，乳腺癌细胞因失去接触抑制的特性，可在培养瓶中堆叠生长。培养箱中通入CO2的主要作用是维持培养液的pH。 （2）天冬酰胺酶的化学本质为蛋白质，可通过蛋白质工程改造其结构。编码第50位的天冬氨酸模板链中对应的碱基序列为5'-GTC-3'，则mRNA中对应的天冬氨酸密码子为5'-GAC-3'。若通过单个碱基对的替换将第50位的天冬氨酸替换为甘氨酸，则甘氨酸密码子应为5'-GGC-3'，因此需将模板链中5'-GTC-3＇序列突变为5'-GCC-3'。 （3）PCR的子链延伸方向是5′→3′，引物必须与模板链的3′端结合，才能保证子链从引物的3′端（-OH）开始延伸，所以为实现单碱基对的定点突变，应选用引物2和引物3对质粒1进行全质粒扩增。由于DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3'端，不能将线性DNA相连，所以全质粒扩增产物为线性DNA。在去除模板质粒的PCR产物中加入DNA连接酶，能够将产物的两端连接形成闭环，以便得到质粒2。若目的基因在受体细胞内控制合成了相应的蛋白质，则表明目的基因表达成功，可采用抗原—抗体杂交法进行检测。 （4）由图2可知改造后的酶作为候选药物的优势为：与改造前相比，改造后的天冬酰胺酶水解天冬酰胺的酶活性显著提高、水解谷氨酰胺的酶活性明显降低，说明改造后的天冬酰胺酶显著提高了对癌细胞增殖的抑制作用，降低了长期使用对正常细胞造成损伤的副作用。 （一）教材知识链接 1．蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构基因和转组中稳定存在，且能够正常表达。 2．不能直接对天然的蛋白质进行改造的原因：任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，如果对蛋白质直接进行改造，即便成功，改造的蛋白质也无法遗传 。 3.天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的：基因→表达（转录和翻译）→形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能：而蛋白质工程却与之相反，它的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核甘酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。（P94“教材”） 4.蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。（P95“教材”） 5.酶制剂在食品工业、医药工业等方面都有广泛的应用。现在，酶制剂的生产已经形成一个市场可观的新兴产业。蛋白质工程的应用又为酶制剂产业的发展提供了强大助力。酶用作工业催化剂，比无机催化剂具有更大的优越性，主要体现在以下几个方面：由于酶促反应能在常温、常压和中性pH条件下进行，因此可以节省大量的能源和设备投资；生产过程中不会造成严重的污染，符合环境保护的要求；生产过程简单、效率高，产品质量好，生产成本低。因此,酶制剂在工业领域得到了广泛的应用。近年来，通过引进国外先进设备、优良菌种以及开发新型酶制剂，我国酶制剂产业保持了较快的增长态势，品种越来越丰富，产品的市场竞争力也在不断提升。在酶制剂产业中，蛋白质工程被广泛用于开发酶的新品种或改进酶的性能，如提高酶的热稳定性，增加某些被用作去污剂的酶的去污效率等。（P96“到社会中去”）。 （二）教材深挖拓展 1.蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到的目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求。（P96“概念检测T2”改编） 2.T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的耐热性，科学家首先对影响T4溶菌酶耐热性的一些重要结构进行了研究。然后以此为依据对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸。于是，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。这项工作属于蛋白质工程的范畴。在该实例中引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是基因的碱基序列发生了变化。如果要将改造后的T4溶菌酶应用于生产实践,还有很多工作需要做。例如由于改造后酶的空间结构发生了变化,因此它的一些基本特性需要重新明确,包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等;需要建立规模化生产该酶的技术体系,评估生产成本等。（P96“拓展应用”改编） 5．某同学认为只要知道了氨基酸的序列就可以利用蛋白质工程制造出各种特定功能的蛋白质，你认为他的说法科学吗？________。说明你的理由： 不科学，蛋白质的功能除了与氨基酸的序列有关以外，还与其特定的空间结构有关。 6.利用蛋白质工程将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，如何对现有的基因进行改造？ 改变决定干扰素分子上半胱氨酸的碱基序列，改变其碱基的种类使其控制合成的氨基酸为丝氨酸 （三）新情景素材速递 1.科学家对鼠源杂交瘤抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体，用于癌症治疗。下图表示形成鼠—人嵌合抗体的过程。 试探究： (1)改造鼠源杂交瘤抗体，是对人抗体和鼠抗体直接进行操作吗？操作的思路应该是什么？(科学思维) 不是。操作的思路是根据需要设计出鼠—人嵌合抗体的结构，推测出氨基酸的序列和基因的碱基序列，对小鼠的基因进行改造。 (2)经过改造的鼠—人嵌合抗体，与鼠源杂交瘤抗体相比较，突出的优点是什么？(生命观念) 提示：对人体的不良反应减少。 学科网（北京）股份有限公司 $