第3章 3 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建（Word教参）-【学霸笔记·同步精讲】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（人教版）

本高中生物学讲义聚焦基因工程基本操作程序的核心知识点，系统梳理目的基因的筛选与获取（涵盖PCR技术的原理、条件及反应过程）和基因表达载体的构建（包括组成、构建目的及步骤），形成从目的基因获取到表达载体构建的连贯学习支架。 该资料通过设计探究活动（如PCR引物设计分析）、表格归纳（PCR数量关系）及例题解析，培养学生科学思维（归纳、建模）和探究实践能力。配套知识框架图与练习题，课中辅助教师清晰授课，课后帮助学生回顾强化，有效查漏补缺。

第2节　基因工程的基本操作程序 第1课时　目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建 [课标要求] 1．运用系统思想解释基因工程的基本步骤和原理。2.结合资料和示意图阐明PCR的原理，说出PCR所需的条件及其反应过程。3.结合模式图说出基因表达载体的组成，并理解构建基因表达载体的目的。 考点一　目的基因的筛选与获取(第一步) 1．目的基因 2．获取目的基因的方法 　　　　聚合酶链式反应的缩写 (1)利用PCR获取和扩增目的基因 ①含义：在体外提供参与DNA复制的______________与__________，对目的基因的________________进行大量复制的技术。 ②原理：____________________。 ③场所：在__________中进行，其中一般要添加Mg2+。 ④条件 ⑤过程 ⑥鉴定：常采用______________________来鉴定PCR的产物。 (2)人工合成目的基因。 (3)通过构建基因文库获取目的基因。 [答案自填] 表达产物　编码蛋白质　目的基因　各种组分　反应条件　核苷酸序列　DNA的半保留复制　缓冲液　脱氧核苷酸　耐高温　3′　90　解聚　50　两种引物　72　耐高温的DNA聚合酶　琼脂糖凝胶电泳 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。(　　) (2)PCR反应中，需要用解旋酶使双链DNA解聚。(　　) (3)PCR过程中使用的DNA聚合酶的特点是耐高温。(　　) (4)PCR反应中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。(　　) 答案：(1)×　PCR反应中温度的周期性改变是变性、复性和延伸所需要的温度。 (2)×　PCR反应中通过高温使双链DNA解聚。 (3)√　(4)√ [探究1] 下图是PCR反应相关过程。据图回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因需要提供的条件是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (2)上图所示利用PCR扩增目的基因，在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 (3)如果循环n次，那么共需消耗__________对引物。 提示：(1)DNA模板、耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、原料(4种脱氧核苷酸)、引物以及特定的温度 (2)3 (3)2n－1 [探究2] 下图是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)。回答下列问题： (1)两组引物都不合理，请分别说明理由： ________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (2)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行的操作是____________________________________________________________________。 如果要用PCR扩增以下DNA模板中的基因1，需要的一对引物序列应是___________________________________________________________________________________________________________________________________________。 提示：(1)第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效 (2)在两种引物的5′端分别加上限制酶的识别序列引物1是5′—CTTCGAAATTC—3′；引物2是5′—CCGATCGGGAGA—3′ 1．引物的选取原则 (1)引物自身不能环化。 (2)两种引物之间不应存在互补序列，否则会相互结合成引物二聚体。 (3)引物长度不宜过短，防止引物随机结合，使得不能特异性扩增目的基因。 2．PCR中的数量关系 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 2n+1－2 两条脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 1.(2025·湖南雅礼中学联考)右图表示利用PCR扩增目的基因的过程，下列相关叙述错误的是(　　) A．利用PCR扩增目的基因时DNA全解旋再复制，与细胞内DNA复制不同 B．①过程中高温的作用与解旋酶相同，目的是使两条链间的氢键断裂 C．用PCR扩增目的基因时，需要知道目的基因的全部碱基序列 D．③过程使用的酶具有热稳定性，在高温下不会发生结构改变而失去催化活性 解析：选C。利用PCR扩增目的基因时，DNA片段全部解聚为单链后再进行复制，而细胞内DNA复制时DNA边解旋边复制，A正确；①过程表示变性，通过升高温度使双链DNA解聚为单链，高温的作用与解旋酶相同，目的是使两条链间的氢键断裂，B正确；利用PCR扩增目的基因时，不必知道目的基因的全部碱基序列，只需根据其部分序列设计出相应的引物即可，C错误；③过程表示延伸，使用的是耐高温的DNA聚合酶，该酶具有热稳定性，在高温下不会发生结构改变而失去催化活性，D正确。 2.(教材P78图3－5改编)利用PCR特异性地拷贝“X基因”，两种引物及其与模板链的结合位置如图一所示。经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图二。下列叙述错误的是(　　) A．第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各1个 B．第二轮循环得到4个DNA分子，即①②③④各1个 C．第三轮循环得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个X基因 D．第四轮循环得到16个DNA分子，其中有4个X基因 解析：选D。据题图分析可知，第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各1个，A正确；第二轮循环得到4个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，故得到①②③④各1个，B正确；第三轮循环得到8个DNA分子，①复制得到①和③，③复制得到③和⑤，②复制得到②和④，④复制得到④和⑤，故得到①②各1个，③④各2个，⑤2个且等长，即2个X基因，C正确；第四轮循环得到16个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，2个③复制得到2个③和2个⑤，2个④复制得到2个④和2个⑤，2个⑤复制得到4个⑤，故第四轮循环得到的16个DNA分子中有8个X基因，D错误。 (1)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 (2)在PCR过程中实际加入的为dNTP，即脱氧核苷三磷酸，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。其分子结构为： 既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 考点二　基因表达载体的构建(第二步) 1．基因表达载体构建的目的 让目的基因在受体细胞中____________，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够____________和____________。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 (1)首先用一定的________切割载体。 (2)然后用________限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用______________将目的基因片段拼接到载体的切口处(如下图所示)。 [答案自填] 稳定存在　表达　发挥作用　启动子　上游　RNA聚合酶　终止子　下游　转录　标记　限制酶　同种　DNA连接酶 (1)基因工程的核心步骤是目的基因的获取。(　　) (2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。(　　) (3)标记基因不一定是抗生素抗性基因。(　　) (4)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。(　　) 答案：(1)×　基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。 (2)×　基因表达载体中不含终止密码子。 (3)√　(4)√ [探究] 构建基因表达载体的目的是让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。请结合下图回答问题： (1)在构建好的基因表达载体中，目的基因的上游应含有__________，其是____________________识别和结合的部位。 (2)启动子、终止子和起始密码子、终止密码子的化学本质______(填“相同”或“不相同”)，原因是___________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (3)据图分析，构建基因表达载体时，______(填“能”或“不能”)用SmaⅠ切割质粒，原因是________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (4)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和外源DNA，但会导致_____________________________________________________________________ 等问题，为避免以上问题出现，应使用________________________两种限制酶。 提示：(1)启动子　RNA聚合酶 (2)不相同　启动子和终止子是DNA上的脱氧核苷酸序列，起始密码子和终止密码子是mRNA上的核糖核苷酸序列 (3)不能　SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗生素抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若其被破坏，无法进一步筛选 (4)目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接　BamHⅠ和Hind Ⅲ 1．限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因、启动子、终止子、复制原点，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。 (3)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的末端。 (4)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即避免DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向相反，导致目的基因导入后无法正常表达。 2．真核生物、原核生物基因的结构和表达 (1)基因的结构 (2)基因表达遗传信息 ①原核生物基因 ②真核生物基因 1．下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是(　　) A．切割含抗虫基因的DNA片段和载体时必须用同一种限制酶 B．抗虫基因表达载体中要有起始密码子和终止密码子 C．抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的受体细胞 D．抗虫基因的表达开始于复制原点 解析：选C。切割含抗虫基因的DNA片段和载体时可以用不同的限制酶，只要切割出的末端相同即可，A错误；抗虫基因表达载体必须具备启动子和终止子，起始密码子和终止密码子位于mRNA上，B错误；基因表达载体必须具备标记基因，其作用是检测目的基因是否导入受体细胞中，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，C正确；抗虫基因的表达开始于启动子，D错误。 2．(2025·广东珠海五校高二联考) 乙肝病毒基因工程疫苗的生产和使用流程见下图，质粒中LacZ基因可使细菌能够利用物质X-gal，从而使菌落呈现蓝色，若无该基因，菌落则呈白色。下列叙述错误的是(　　) A．过程①中目的基因和载体重组的效率与载体和目的基因的浓度及比例等有关 B．过程②需要在培养基中加青霉素和X-gal以获得呈蓝色的大肠杆菌菌落 C．过程①最好的限制酶选择方案是BamHⅠ和EcoRⅠ D．该基因工程疫苗不会出现乙肝病毒感染和增殖的情况，安全性高 解析：选B。过程①为构建重组质粒过程，增加载体和目的基因的浓度及比例，可以提高目的基因和载体重组的效率，A正确；BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点在目的基因两侧，可以获得完整的目的基因，且质粒上也存在这两种酶的识别位点，故过程①最好的限制酶选择方案是BamHⅠ和EcoRⅠ，过程②中培养大肠杆菌时，应在培养基中加青霉素和X-gal可以用于筛选含有重组质粒的大肠杆菌，由于BamHⅠ和EcoRⅠ酶切时破坏了质粒中LacZ基因，但保留了青霉素抗性基因，故培养基中生长的白色的大肠杆菌菌落为所需菌落，B错误，C正确；基因工程疫苗由于只利用了乙肝病毒的外壳，不含其遗传物质，所以不会出现乙肝病毒增殖和感染的情况，安全性高，D正确。 【知识框架】 1．(2025·湖南常德高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　) A．目的基因就是编码蛋白质的基因 B．获取目的基因是基因工程的第一步 C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 解析：选A。用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因，它主要是指编码蛋白质的基因，A错误。 2．(2025·福建福州一中质检)下列有关体内DNA复制与PCR比较的叙述，错误的是(　　) A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D．二者遵循的碱基互补配对原则相同 解析：选B。DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增DNA时，不需要解旋酶破坏氢键来实现解旋，而是在高温条件下使氢键断裂，B错误；体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。 3．(2025·江苏盐城高二期中)下图为PCR扩增过程示意图，下列相关叙述错误的是(　　) A．PCR反应的缓冲液中一般需添加Mg2+以激活DNA聚合酶 B．利用PCR扩增DNA分子过程中子链合成的方向是从5′端到3′端 C．高温加热的目的是使DNA受热变性，打开双螺旋，解聚为单链 D．第3轮PCR产物中和目的基因等长的DNA分子占1/8 解析：选D。PCR是体外进行DNA复制的技术，DNA复制需要DNA聚合酶，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，故进行PCR扩增时通常在PCR反应的缓冲液中添加Mg2+，A正确；DNA子链的合成方向是从5′端到3′端，B正确；高温加热的目的是使DNA受热变性，氢键断裂，从而打开双螺旋，解聚为单链，C正确；第3轮PCR结束后，和目的基因等长的DNA分子有2个，而子代DNA分子有23＝8(个)，故和目的基因等长的DNA分子占1/4，D错误。 4．下图为基因表达载体的模式图，下列叙述错误的是(　　) A．构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶 B．终止子位于基因的下游，使翻译在所需要的地方停止下来 C．构建成功后可使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代 D．复制原点使得该表达载体可以在受体细胞中进行自我复制 解析：选B。构建基因表达载体时，首先用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和载体，然后用DNA连接酶连接目的基因和载体形成重组DNA分子，A正确；终止子位于基因的下游，使转录在所需要的地方停下来，B错误；基因表达载体构建的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，C正确；复制原点使得表达载体可以在受体细胞中进行自我复制，D正确。 5．(2025·山东滨州高二期末)大刍草具有较强的耐盐碱能力，该性状与M蛋白有关。科学家通过PCR获取和扩增M蛋白基因，如图1所示。将获得的大量M蛋白基因与质粒构建基因表达载体，各部分结构如图2所示。回答下列问题： (1)PCR一般可分为________________三步。据图1分析，PCR过程应选择的引物是________，引物的作用是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (2)在M蛋白基因两端设计不同黏性末端的目的是____________________________________________________________________。 质粒中氨苄青霉素抗性基因的作用是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (3)为实现质粒和M蛋白基因的连接，切割质粒时选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 为将M蛋白基因连接到质粒上，还需要____________等酶。 答案：(1)变性、复性、延伸　引物Ⅱ、Ⅲ　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　(2)防止M蛋白基因自身环化，保证M蛋白基因在质粒上正向连接　便于重组DNA分子的筛选　(3)XmaⅠ酶切出的黏性末端与M蛋白基因一端的黏性末端相同，SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与M蛋白基因的黏性末端连接　BglⅡ、DNA连接酶 学科网（北京）股份有限公司 $