第3章 1 第1节 重组DNA技术的基本工具（Word教参）-【学霸笔记·同步精讲】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（人教版）

本讲义聚焦重组DNA技术的基本工具这一核心知识点，系统梳理基因工程概念及限制酶、DNA连接酶、载体三种工具的作用原理，通过表格对比酶的作用部位与对象、判断题巩固理解、探究题深化应用，搭建从基础概念到实践分析的学习支架。 该资料以科学思维为导向，通过酶的特性比较培养分类归纳能力，结合限制酶切割末端分析等探究活动提升探究实践能力，嵌入判断题强化严谨求实的科学态度。课中辅助教师引导学生构建知识网络，课后助力学生通过例题与知识框架回顾强化，有效查漏补缺。

第1节　重组DNA技术的基本工具 [课标要求] 1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 考点一　基因工程的概念和工具酶 1．基因工程的概念 2．重组DNA技术的工具酶 (1)限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀” 具有专一性 (2)DNA连接酶——“分子缝合针” 注意连接的不是氢键 ①作用：能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的____________________。 ②类型 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 ____________ ____________ 两者 比较 E.coli DNA连接酶连接具有__________________的DNA片段的效率要远远____________T4 DNA连接酶 [答案自填] DNA分子　转基因　遗传特性　生物类型　基因重组　原核生物　数千　特定核苷酸序列　磷酸二酯键　黏性末端　平末端　磷酸二酯键　大肠杆菌　T4噬菌体　平末端　低于 (1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种。(　　) (2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(　　) (3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。(　　) (4)限制酶和解旋酶的作用部位相同。(　　) 答案：(1)√ (2)×　大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 (3)×　DNA连接酶是将DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 (4)×　限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。 [探究] 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶。回答下列问题： (1)下列限制酶切割形成的黏性末端分别是____________________________________________________________________________________________________________________________________。 同种限制酶切割产生的黏性末端________(填“相同”或“不相同”)，不同限制酶切割产生的黏性末端________(填“一定”或“不一定”)不同。 (2)图中的BamH Ⅰ 和Bgl Ⅱ 切割产生的两个黏性末端相互连接后，________(填“能”或“不能”)再被所用的限制酶识别。 (3)推断限制酶切割一次可断开________个磷酸二酯键；产生________个游离的磷酸基团；产生________个末端。 提示：(1) 　相同　不一定　 (2)不能 (3)2　2　2 1．与DNA相关的几种酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱 氧核苷酸 DNA 作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA 分子 切割DNA 分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 2.回文序列与同尾酶 (1)回文序列 限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。 (2)同尾酶 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。利用同尾酶构建重组DNA分子时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 1．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列说法正确的是(　　) A．限制酶只能切割双链DNA分子，不能切割烟草花叶病毒的核酸 B．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA C．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 D．T4 DNA连接酶只能连接具有黏性末端的DNA片段 解析：选A。烟草花叶病毒的核酸为RNA，限制酶只能切割双链DNA分子而不能切割RNA，A正确；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以限制酶不能剪切自身的DNA，B错误；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，C错误；T4 DNA连接酶既能连接具有黏性末端的DNA片段也能连接具有平末端的DNA片段，D错误。 2．(2025·江苏淮安期末)基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。下列说法正确的是(　　) 限制酶 EcoRⅠ SmaⅠ EcoRⅤ 识别序列及 切割位点 A．限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端可以通过E.coli DNA连接酶相互连接，且效率较T4 DNA连接酶连接时高 B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C．限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端 D．若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接 解析：选B。限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶可以连接平末端，但连接效率比T4 DNA连接酶低，A错误。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确。一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有2个磷酸二酯键断裂，形成2个黏性末端或平末端，形成2个游离的5′末端，C错误。若两种限制酶的识别序列相同，但切割位点不同，则切割形成的末端不同，不能通过DNA连接酶相互连接，D错误。 考点二　基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1．种类：质粒、________、动植物病毒等。 病毒具有特异性 2．常用载体——质粒 (1)本质：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞_____________DNA之外，并具有_____________能力的________________。 (2)特点：①有一个至多个限制酶切割位点。 供外源DNA片段(基因)插入其中 ②携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行__________________，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ③经人工改造后，这些质粒上常有特殊的___________，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等。 便于重组DNA分子的筛选 3．特点：不同载体的来源不同，在__________、____________、____________以及可以插入外源DNA片段的____________上也有很大差别。 [答案自填] 噬菌体　拟核　自我复制　环状双链DNA分子　自我复制　标记基因　大小　结构　复制方式　大小 (1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。(　　) (2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体。(　　) (3)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同。(　　) (4)载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等。(　　) 答案：(1)×　作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为标记基因。 (2)√　 (3)×　质粒是环状双链DNA分子，细胞膜中的载体蛋白是蛋白质。 (4)√ [探究] 下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图思考并回答下列问题： (1)基因工程使用的载体________(填“一定”或“不一定”)都是质粒，理由是_____________________________________________________________________________________________________________________________________。 (2)外源基因______(填“可以”或“不可以”)直接导入受体细胞，原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________。 (3)质粒上的一些抗生素抗性基因的作用是____________________________________________________________________________________________________________________________。 (4)下图表示四种质粒，其中箭头所指部位为限制酶的切割位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适合作为载体的质粒是________，说明理由： ___________________________________________________________________________________________________________________________________。 提示：(1)不一定　除了质粒外，基因工程使用的载体还有动植物病毒、噬菌体等 (2)不可以　若没有载体，则外源基因导入受体细胞后无法稳定存在并进行自我复制和表达 (3)作为标记基因，对重组DNA分子进行筛选，检测目的基因是否导入受体细胞 (4)①　质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和质粒④的标记基因上都有限制酶的切割位点，使用该酶会破坏标记基因，故二者均不适合作载体 标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如下图所示： 1．(2025·江苏连云港高二检测)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　) A．在基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 解析：选D。基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；作为基因工程的载体，必须具备一定的条件，而自然界中的质粒大多不具备相应的条件，因此不是所有的质粒都能作为基因工程中的载体，B错误；细菌为原核生物，无染色体，质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状双链DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有标记基因，便于对重组DNA进行筛选，D正确。 2．某细菌质粒如下图所示，通过标记基因可以推知外源基因插入的位置，图中的a、b、c是外源基因插入位置，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　) 细菌 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A．①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b 解析：选A。①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明其氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都没有被破坏，所以插入点是c；②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其氨苄青霉素抗性基因正常表达而四环素抗性基因被破坏，故插入点是b；③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而能在含四环素的培养基上生长，说明其氨苄青霉素抗性基因被破坏而四环素抗性基因正常表达，故插入点是a，A符合题意。 (1)一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。 (2)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，后者的实质是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。 【知识框架】 1．(2025·广东佛山S6联盟高二期中)下列哪些成果为基因工程的诞生奠定了基础(　　) ①科学家完成人类基因组的测序工作　②科学家证明质粒可将外源基因导入受体细胞并成功表达　③肺炎链球菌转化实验证明了遗传物质DNA可在同种生物的不同个体间转移 A．①② B．①③　 C．① D．②③ 解析：选D。科学家完成人类基因组的测序工作是在基因工程问世之后，①不符合题意；科学家证明质粒可将外源基因导入受体细胞并成功表达，为基因工程的诞生奠定了基础，②符合题意；肺炎链球菌转化实验证明了遗传物质DNA可在同种生物的不同个体间转移，让重组DNA成为可能，③符合题意。 2．以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是(　　) 　　 A．以上DNA片段至少是由4种限制酶切割后产生的 B．②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的 C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子 D．限制酶和DNA连接酶作用的部分都是磷酸二酯键 解析：选D。题图中①④可能是同一种限制酶切割形成的，因此题干中4个DNA片段至少是由3种限制酶切割后产生的，A错误；②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的，B错误；①④连接形成重组DNA分子需要的是DNA连接酶，C错误。 3．(2025·河北石家庄高二期中) BamHⅠ和BclⅠ是两种限制性内切核酸酶，二者的识别序列及切割位点如下表所示。下列相关叙述错误的是(　　) 限制酶 BamHⅠ BclⅠ 识别序列及切割位点 A．限制性内切核酸酶主要是从原核生物中分离得到的 B．限制性内切核酸酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列 C．分别被BamHⅠ和BclⅠ切割后产生的DNA片段能互补配对 D．若某链状DNA分子有两个BclⅠ切割位点，则被其切割后会产生2个DNA 片段 解析：选D。限制性内切核酸酶主要是从原核生物中分离得到的，A正确；限制性内切核酸酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，B正确；据题表分析可知，两种限制酶切割后产生的黏性末端相同，故分别被BamHⅠ和BclⅠ切割后产生的DNA片段能互补配对，C正确；若某链状DNA分子有两个BclⅠ切割位点，则被其切割后会产生3个DNA片段，D错误。 4．如图是某种质粒的结构模式图，其中ori为复制必需的序列，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，箭头表示某种限制酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是(　　) A．基因AmpR和TetR是一对等位基因，常作为基因工程中的标记基因 B．质粒指细菌细胞中能自我复制的小型环状的DNA和动植物病毒的DNA C．限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键 D．用该质粒将目的基因导入大肠杆菌，该菌能在含四环素的培养基上生长 解析：选D。基因AmpR和TetR在同一个DNA分子上，不是一对等位基因，A错误；质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，动植物病毒的DNA不属于质粒，B错误；限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；用题图所示质粒构建重组DNA分子时，氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，因此用该质粒将目的基因导入大肠杆菌，该菌能在含四环素的培养基上生长，D正确。 5．DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如下图甲所示)插入适宜的质粒(如下图乙所示)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，其在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体产生免疫反应。可选择的限制酶分别是Bgl Ⅱ、EcoR Ⅰ 和Sau3A Ⅰ。下列分析错误的是(　　) A．构建DNA疫苗时，可用Bgl Ⅱ 和Sau3A Ⅰ切割目的基因和质粒 B．若用EcoRⅠ切割质粒，则产生的DNA片段具有黏性末端 C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，会产生多种连接产物 D．图乙质粒用EcoRⅠ切割前后，分别含有2个和4个游离的磷酸基团 解析：选D。分析题图可知，外源DNA分子和质粒上都含有3种限制酶(BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ)的切割位点，为了防止目的基因和质粒自身环化以及两者之间的反向连接，构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒，A正确；用EcoRⅠ切割后获得的是黏性末端，B正确；用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，能产生多种连接产物，如目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因与质粒正向连接、目的基因与质粒反向连接等，C正确；题图乙质粒用EcoRⅠ切割前为环状DNA分子，不含游离的磷酸基团，切割后为链状DNA分子，含有2个游离的磷酸基团，D错误。 学科网（北京）股份有限公司 $