第3章 微专题二 PCR技术的综合分析(学用Word)-【优学精讲】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（人教版）

本讲义聚焦PCR技术的综合分析这一核心知识点，系统梳理其基本原理（变性、复性、延伸）及高中阶段常用类型（常规、重叠延伸、实时荧光定量等6种），构建从基础原理到具体应用的知识支架。 通过对比不同PCR类型的原理与应用培养科学思维，结合病毒检测、基因工程等实例设计习题促进探究实践，课中辅助教师高效授课，课后助力学生巩固知识、查漏补缺，体现生物学与现实问题解决的社会责任。

微专题二　PCR技术的综合分析 　　聚合酶链式反应，简称PCR，是一种在实验室环境下进行的DNA快速扩增技术，利用DNA聚合酶的催化活性，以一段已知的DNA序列（即母链DNA）作为复制的模板。在进行PCR反应时，我们会设计并加入特定的引物，这些引物会与母链DNA的特定区域结合，作为新DNA链合成的起始点。 　　PCR反应的过程可以概括为三个主要步骤：首先是变性，通过加热使双链DNA解开成单链；接着是复性（退火），降低温度让引物与模板DNA特异性结合；最后是延伸，DNA聚合酶以引物为起点，沿着模板DNA的方向合成新的DNA链。通过不断地重复这三个步骤，PCR技术能够在体外迅速且特异性地扩增出大量的与母链DNA互补的子链DNA。 高中阶段常用到的PCR包括： 1.常规PCR（Polymerase Chain Reaction） 定义：常规PCR是一种基于DNA聚合酶的体外扩增技术，能够在短时间内将目标DNA片段扩增数百万倍。 原理：通过高温变性（94～96 ℃）、低温复性（50～65 ℃）和中温延伸（72 ℃）三个步骤的循环，利用DNA聚合酶合成特异性DNA片段。引物结合到目标DNA序列的两端，限制扩增范围，从而实现特定序列的高效扩增。 2.重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR） 定义：重叠延伸PCR是一种用于基因编辑和大片段拼接的技术。 原理：通过设计具有重叠序列的引物，将多个短片段连接成一个长片段。该技术可用于定点诱变和嵌合分子的生成。 3.实时荧光定量PCR（qPCR） 定义：实时荧光定量PCR是一种结合荧光信号实时监测DNA扩增的技术。 原理：通过荧光染料或探针实时检测PCR产物的生成量，实现对目标DNA的定量分析。 应用：广泛用于基因表达分析、病原体定量和转基因生物检测。 4.逆转录定量PCR（RT-qPCR） 定义：逆转录定量PCR是结合逆转录和实时荧光定量PCR的技术。 原理：首先将RNA逆转录为cDNA，然后通过qPCR进行定量分析。 5.逆转录PCR（RT-PCR） 定义：逆转录PCR是一种将RNA逆转录为cDNA后进行扩增的技术。 原理：首先利用逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过PCR进行扩增。 6.巢式PCR（Nested PCR） 定义：巢式PCR是一种通过两轮连续扩增提高反应特异性的技术。 原理：第一轮扩增较大片段，第二轮使用内部引物扩增目标序列。 1.（2025·山东聊城高二月考）如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（　　 ） A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 2.某病毒的检测可以采用实时荧光RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）的方法，RT-PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是（　　 ） A.过程①以mRNA为模板合成单链DNA B.过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，理论上需要n个引物B C.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 D.游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接 3.实时荧光定量RT-PCR技术需要在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，荧光染料能特异性掺入DNA双链中，从而发出荧光信号。在流感流行季节，对怀疑流感病毒感染的患者，可以通过实时荧光定量RT-PCR技术进行核酸检测。下列相关叙述不正确的是（　　） A.图中的探针可能是利用荧光分子标记的流感病毒独特的基因序列 B.核酸检测是通过检测荧光信号来确定样本中是否有病毒核酸的 C.PCR技术利用了DNA双链复制的原理，需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶的催化 D.用荧光RT-PCR技术测定病毒的核酸具有特异性 4.（2025·山东烟台期中）巢式PCR是一种使用两对引物扩增完整的片段的PCR。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对为内部引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增，其过程如图所示。下列说法错误的是（　　 ） A.两轮扩增所需引物不同，原料和酶相同 B.DNA的合成总是从子链的5'端向3'端延伸与Taq DNA聚合酶的作用有关 C.用内引物进行PCR时，扩增n次后理论上需要2n个引物 D.巢式PCR可增强扩增的特异性 5.（2024·盐城实验高级中学高二期中）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。如图是PCR扩增过程的示意图，请回答下列问题： （1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过　　　　　获得DNA用于PCR扩增。 （2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的　　　　　　　　　切割位点。设计引物时需要避免引物之间形成　　　　　　，从而造成引物自连。 （3）图中步骤1代表　　　　　，步骤2代表复性，步骤3代表　　　　　，这三个步骤组成一轮循环。 （4）PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏　　　　　　　　　　的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但　　　　　　　　　的引物需要设定更高的复性温度。 （5）如果PCR得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有　　　　　　（填序号）。 ①升高复性温度　②降低复性温度　③重新设计引物 3 / 3 学科网（北京）股份有限公司 $ 微专题二　PCR技术的综合分析 针对训练 1.D　由图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的分子是7个，即占7/8，D错误。 2.B　过程①是以mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，A正确；过程③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT-PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量（或浓度），便于检测，C正确；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接，D正确。 3.C　PCR技术利用了DNA双链复制的原理，不需要解旋酶，可通过高温使DNA双链解开，但需要耐高温的DNA聚合酶的催化，C错误。 4.C　第一轮所用引物为外引物，第二轮所用引物为内引物，两次所用原料均为dNTP（四种游离的脱氧核苷酸），酶均为Taq DNA聚合酶，A正确；Taq DNA聚合酶只能识别模板链的3'端，因此DNA的合成总是从子链的5'端向3'端延伸，B正确；PCR为体外DNA复制，每合成一条子链即需要一个引物，扩增n次后一共有2n个DNA，新合成了（2n－1）个DNA，合成了（2n－1）×2＝2n＋1－2条新链，需要2n＋1－2个引物，C错误；巢式PCR可增强扩增的特异性，因为如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式（内）引物能在错误片段上进行配对的概率低，D正确。 5.（1）逆转录　（2）限制性内切核酸酶（或限制酶）　碱基互补配对　（3）变性　延伸　（4）引物与模板　G—C含量高　（5）②③ 解析：（1）PCR是在体外进行DNA扩增，提取的mRNA不能用于PCR扩增，需要经过逆转录获得DNA后才可用于PCR扩增。（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），需要在引物中增加适当的限制性内切核酸酶（限制酶）的识别序列，便于构建重组质粒。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。（3）根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为复性，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。（4）复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间氢键数多于A、T之间氢键数，故在使用G—C含量高的引物时需要设定更高的复性温度。（5）如果PCR得不到任何扩增产物，可能的原因是复性温度过高使扩增效率降低；也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，需要重新设计。因此可采取的措施有降低复性温度、重新设计引物等。 3 / 3 学科网（北京）股份有限公司 $