3.2.4DNA片段的扩增及电泳鉴定课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 人教版选择性必修三 第三章 基因工程 教学目标 1.了解DNA片段扩增及电泳的基本原理，尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 2.通过设计实验方案，运用批判性科学思维引导学生分析“阳性对照”、“阴性对照”及“空 白对照”的作用，让学生体会科学探究实验中，设置对照的必要性和重要性。 3.通过介绍PCR在各领域的广泛应用，认同现代生物技术在生活生产中的重要价值。 1.PCR扩增DNA分子的原理是？ 2.什么是电泳？产物鉴定方法？ 3.影响DNA的迁移速率因素有哪些 ？ 4.如何观察现象？ 5.操作过程是？ 6.注意事项有？ 课本84--85 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环； ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理； 1.PCR扩增DNA分子的原理是？ PCR的操作流程，利用PCR获得和扩增目的基因 ① ： 当温度 时， 双链DNA 为单链。 ② ： 当温度下降到 时， 通过碱基互补配对 与两条单链DNA结合。 ③ ： 当温度上升到 时， 溶液中的4种脱氧核苷酸在 的作用下， 根据 原则合成 新的DNA链。 变性 超过90℃ 解聚 复性 50℃左右 两种引物 延伸 72℃左右 耐高温的DNA聚合酶 碱基互补配对 DNA体外复制（PCR）的过程：在 中自动完成。 PCR扩增仪 2.什么是电泳？ DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 产物鉴定方法： 琼脂糖凝胶电泳 1.凝胶的浓度（浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。） DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 3.影响DNA的迁移速率因素有哪些 ？ 4.如何观察现象？ 3.DNA构象等有关（双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA） 2.DNA分子的大小（较小的DNA分子迁移距离大） 二、材料用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） ⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 PCR方法步骤 1.用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 2.待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部 3.参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 确保引物延伸完全，得到更多产物 5.操作过程是？ 4.根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 7.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 8.将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）已知的DNA分子大小的片段。 9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 DNA片段的电泳鉴定 5.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 6.凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 (3)实验步骤 梳子 模具 点样孔 电泳槽 样品 电泳缓冲液 混合液 点样孔 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 ⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。 6.电泳条带的宽度（数量)、亮度与模板含量呈正相关 6.注意事项有？ 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及宽度亮度来评价扩增的结果。 如果扩增不成功（没有条带），可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 4.结果分析与评价 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列结合（非特异性结合）；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 例1 、下列有关电泳的叙述，错误的是(　　) A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。据图分析，下列表述错误的是(　　) A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同 C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关 B $