专题09 基因工程（2大考点）（山东专用）2026年高考生物一模分类汇编

专题09基因工程 题号 1 2 3 4 5 答案 C C B C A DNA粗提取、DNA片段的扩增及电泳实验 考点1 基因工程的基本操作程序 考点2 6.【答案】（1）①. 维持稳定和表达 ②. 翻译 （2）①. BbvCⅠ ②. TGA ③. TCA （3）卡那霉素 （4） ①. 提高植株抗As感染的能力 ②. S基因反义片段转录形成的RNA降低了生长素合成相关基因的表达 7.【答案】（1）①. 逆转录 ②. 引物1和引物3 （2）①. 起搭桥作用的两个引物的5'端存在部分可以碱基互补配对的序列 ②. 可沿着杂交分子互补区域的3'端继续延伸 ③. H3 （3）①. BamHⅠ和XmaⅠ ②. Sau3AI和XmaⅠ （4）能在含卡那霉素培养基上生长但不能在含四环素培养基上生长 8.【答案】（1）①. 防止/抑制IFN Nα-2b/人源干扰素/目的蛋白/外源蛋白的降解 ②. 诱导型 （2）①. 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够在受体细胞内表达和发挥作用 ②. ①②④ ③. 卡那霉素和 IPTG （3）①. tRNA（或“转运RNA”） ②. 单交换 ③. 1100或5000 9.【答案】（1）①. F1和R2（或F2和R1） ②. 3 ③. ①②③④⑤ （2） ①. A ②. 否 （3）强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加 10.【答案】（1）①. 氢 ②. 2n-1-1 （2）①. 5' ②. A 、C ③. ②③⑤ （3）GGACAUGGG （4）非目标序列也可能含有与sgRNA配对的碱基序列，造成sgRNA选错对象与之结合而脱靶 11.【答案】（1）①. 碱基互补配对 ②. 磷酸二酯键 （2）AGAUUGGGUCCU （3）①. SpeI和NheI ②. 复制原点、终止子 ③. 潮霉素 （4）①. 敲除 ②. 用布氏白粉菌感染基因改造的小麦和没有经过基因改造的小麦，如果基因改造的小麦产量高，没有改造的小麦产量低，则说明改造成功 12.【答案】（1）①. 2 ②. GFP基因的一端和PABD基因一端的核苷酸序列 ③. ①、④ ④. 不能 （2）①. 5'→3' ②. 黏性末端 ③. 过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列） ④. DNA聚合酶和DNA连接酶 （3）ABC （4）①. 草胺膦 ②. 绿色荧光点的分布 13.【答案】（1）①. AGATCT ②. BamHI、EcoRI ③. 2 （2）①. 延伸 ②. 检验PCR反应中是否有外源DNA污染 ③. 1 ④. 目的基因N大小约为2.3kb，实验组1的电泳结果与其大小接近 （3）GCC 14.【答案】（1）①. 细胞因子 ②. 抗原（或靶细胞 DLBCL 细胞）的接触和辅助性 T 细胞（Th）表面的特定分子 （2）元件排列顺序：。 文字说明： 利用pEF1α启动子持续表达nTA基因，nTA基因表达产物在没有四环素类抗生素时，无法激活pTRE启动子。 当正常B细胞出现耗竭风险时，向患者体内注入四环素类抗生素，nTA基因表达产物结合四环素类抗生素后，激活pTRE启动子，启动vp3基因表达，vp3基因表达产物诱导CAR—T细胞凋亡，从而减少CAR—T细胞数量，降低正常B细胞耗竭的风险。 （3）①. 引物2和引物3 ②. Pc 和 Ter ③. 氨苄青霉素 ④. PCR 缓冲液、Taq 酶、dNTP、特异性引物 ⑤. 对比传统构建重组质粒，In一Fusion 技术的优势有不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等。 15.【答案】（1）①. 终止子 ②. XhoI ③. CAATTGGTAGTCGAA （2）①. 氨苄青霉素和X-gal ②. 白 （3）①. GAT ②. 2 16.【答案】（1）①. XbaⅠ、SpeⅠ ②. DNA连接 ③. PstⅠ、BglⅡ （2）有多个限制酶酶切位点、基因能够在受体细胞内自我复制或整合到受体细胞DNA中，随着宿主细胞DNA复制而复制、有标记基因、对宿主细胞无害 （3） ①. 乙 ②. 引物1和引物2 （4）工程菌中表达的S蛋白可特异性结合癌细胞抗原，将工程菌引至癌细胞，癌细胞周围的低氧环境激活L蛋白导致工程菌破裂，抗癌药物释放 1 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题09基因工程 2大考点概览 考点1 DNA粗提取、DNA片段的扩增及电泳实验 考点2 基因工程的基本操作程序 ( DNA粗提取、DNA片段的扩增及电泳实验 考点1 )1.（2026·山东滨州·一模）关于“DNA粗提取与鉴定”和“琼脂糖凝胶电泳”的实验，下列说法正确的是（ ） A. 研磨液需经过4℃静置后才可离心获取上清液 B. 将获得的DNA直接加入二苯胺试剂后沸水浴加热呈现蓝色 C. 电泳时加入的核酸染料在紫外光照射下可发出荧光 D. 设置PCR循环程序的最后一次复性时间时，可与之前循环相同 2.（2026·山东临沂·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（ ） A. PCR复性温度与引物的长度以及引物中GC碱基的相对含量有关 B. 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 C. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D. 在同一电场作用下，通常DNA片段越长，在凝胶中迁移速率越慢 3.下列关于PCR技术的说法，错误的是（ ） A. PCR前需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部 B. 每一次循环都需要向离心管添加一次引物 C. 延伸的时长主要由模板链的长度决定 D. PCR步骤所需温度由高到低依次为变性、延伸、复性 4.（2026·山东青岛·一模）下列关于现代生物技术及生物学实验的叙述，正确的是（ ） A. 琼脂糖凝胶电泳实验中，琼脂糖融化后应立即加入核酸染料，以免凝胶凝固导致染料分布不均 B. DNA粗提取实验中，常利用DNA在酒精中溶解度较大的特性来提取DNA C. DNA粗提取实验中，EDTA（蛋白质变性剂）可抑制DNA酶的活性，防止研磨过程中DNA被水解 D. 通过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白 5.（2026·山东淄博·一模）下下列关于生物学实验的说法正确的是（ ） 选项 实验名称 相关描述 A 探究植物细胞的吸水和失水 仅使用低倍镜观察，随着外界蔗糖溶液浓度的增加，细胞大小基本不变 B 探究酵母菌细胞呼吸的方式 有氧呼吸组应让空气持续依次通过3个锥形瓶 C DNA的粗提取与鉴定 可进行两次离心，第一次离心取沉淀物，第二次离心取上清液 D DNA片段的扩增及电泳鉴定 电泳缓冲液中需加入指示剂以便观察电泳进程 A. A B. B C. C D. D ( 基因工程的基本操作程序 考点2 ) 6.（2026·山东潍坊·一模）同源重组技术是指利用目的基因与插入位点两端的同源序列实现目的基因的定向插入。为研究马铃薯抗马铃薯早疫病菌（As）感染的能力是否与S基因表达有关，研究人员用PCR技术扩增S基因反义片段，通过同源重组技术将反义片段插入Ti质粒，并将该质粒导入抗As马铃薯植株中，过程如图1所示。反义片段转录形成的RNA可与S基因的mRNA互补结合，从而抑制S基因的表达。 （1）农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内______的过程。反义片段转录形成的RNA抑制了S基因表达的______过程。 （2）用限制酶切割图1中质粒会产生黏性末端，需用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平，该过程应选用的限制酶是______。利用同源重组技术获得重组质粒，需要引物在片段末端加入与切割位点末端相同的同源序列，引物F和R所含的同源序列分别为5′-______-3′和5′-______-3′（两空只写出与扩增的S基因片段末端序列相连的3个碱基）。 （3）将反义片段转入抗As马铃薯细胞后，需在培养基中加入______（填“卡那霉素”“氨苄青霉素”或“卡那霉素和氨苄青霉素”）进行筛选。 （4）将三种植株分别接种致病菌，菌斑大小和未接种致病菌植株各个生长指标的相对值如图2所示。 据图2分析，S基因对马铃薯植株的作用是______。成功转入S基因反义片段植株与敲除S基因的植株生长指标有明显差异，推测原因是______。 7.（2026·山东滨州·一模）流感病毒的抗原有H和N两类，均可以分为很多亚型。某科研团队基于融合蛋白的思路，尝试制造H3、N2融合蛋白疫苗，以更好地预防H3N2病毒。 （1）获取病毒H3、N2抗原蛋白的mRNA，通过____过程得到相应的DNA，并进一步构建H3、N2融合基因。在H3蛋白基因和N2蛋白基因融合的过程中，起搭桥作用的是____（从引物1～8中选择）。 （2）从引物角度分析，两种基因能够融合的关键是____，变性后形成的杂交分子在延伸为双链等长的融合基因时，不需要添加引物的原因是____。若融合基因中上游基因的mRNA终止密码子对应的碱基序列未被切除，则融合基因翻译得到的抗原蛋白为____。 （3）将目的基因与运载体连接过程中，首先需要用____（填限制酶种类）处理载体；用____（填限制酶种类）处理目的基因所在的片段。 （4）利用大肠杆菌作受体细胞筛选获得目的菌株：首先在含卡那霉素的培养基上培养目标菌，将培养基上生长的菌落用影印法接种到含四环素的培养基上，最后选择____的菌株。 8.（2026·山东淄博·一模）人源干扰素IFNα-2b是一种具有抗病毒活性的真核蛋白，可通过大肠杆菌BL21（DE3）表达体系大规模生产。BL21（DE3）的质粒上有T7RNA聚合酶基因和lacI基因。T7RNA聚合酶具有极高的启动子特异性和转录效率，其表达受lacI基因编码的lac阻遏蛋白的调控，当培养基中无诱导物IPTG时，lac阻遏蛋白结合到T7RNA聚合酶基因的启动子上抑制其表达。 （1）BL21（DE3）去除了蛋白酶编码基因，目的是_______。T7RNA聚合酶基因的启动子属于______型启动子。 （2）构建重组载体时，选用了两种启动子PBAD（被大肠杆菌自身RNA聚合酶识别）和PT7（仅被T7RNA聚合酶识别），重组载体的部分结构如图1。构建基因表达载体的目的是_______。为实现目的基因在特定时期表达，图1的4个基因的启动子中为PBAD的是______（填序号）。为筛选出含重组质粒的大肠杆菌并使其大量表达IFNa-2b，培养基中需要加入_____。 （3）编码同一氨基酸的不同密码子，在不同生物体中的使用频率并不相同，即存在密码子偏好性。如果使用大肠杆菌表达一种真核蛋白，可能因密码子偏好性不同，导致目标蛋白翻译过程受阻。IFNa-2b基因的mRNA中存在一种大肠杆菌中不常见的密码子AGG，导致IFNa-2b产量极低。可利用同源重组（图2）向大肠杆菌基因组中导入密码子AGG对应的______基因提高IFNα-2b产量。图2中的同源区段可不发生交换，也可发生单交换或双交换。对大肠杆菌进行改造后，利用高温处理使质粒丢失，在培养基中加入四环素，能够生长的是发生______（填“单交换”或“双交换”）的大肠杆菌。利用引物1和引物2进行PCR扩增（引物大小忽略不计），如果插入了目的基因，PCR产物大小为______bp。 9.（2026·山东日照·一模）除草剂氟草啶（FCD）能抑制植物细胞中原卟啉原IX氧化酶的活性以达到除草效果，科研人员利用基因编辑技术使水稻2号染色体上的PPO1基因（编码原卟啉原IX氧化酶）与CP12基因结构改变（如图1），从而赋予水稻对FCD的耐受性，并利用PCR技术结合电泳对转基因水稻进行鉴定，结果如图2所示。 （1）据图1分析，利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时，应选择的引物组合为________。若基因编辑成功，PCR扩增产物的电泳结果应为图2中的________号泳道。若电泳结果中5号泳道内出现两条电泳条带，原因可能是________（填序号）。 ①样品被污染 ②复性过程温度过低 ③预变性时间较短 ④延伸过程中引物3'端被封闭 ⑤引物特异性不强 ⑥图1中的两个切割位点之间被切割后原位连接 （2）基因编辑成功后，PPO1的转录模板链是________（填“A”或“B”）链，基因编辑前后，CP12的转录模板链________（填“是”或“否”）改变。 （3）综合上述信息，分析上述基因编辑成功的水稻对FCD耐受性增强的原因是________。 10.（2026·山东菏泽·一模）科研人员开发了一种可将靶DNA中特定位点碱基对C-G变为T-A的单碱基编辑工具（简称CBE系统）。该系统由dCas9蛋白、胞苷脱氨酶和sgRNA三部分构成，其中“dCas9蛋白+胞苷脱氨酶”在sgRNA的引导下，使靶DNA特定位点的一个碱基C脱氨反应变成U，最终实现C→T的改变。编辑过程如图1，该过程中DNA链不断裂。图1中①②代表相应过程。 （1）CBE系统与靶DNA的识别与结合过程发生了________键的断裂和形成；①过程形成的一个含A-U的DNA分子经②过程n轮（n>2）复制后，可形成________个目标DNA． （2）上述CBE系统的构建用到了图2中的质粒、目的基因和限制酶等。构建CBE系统的部分过程如下： I．重组质粒的构建：根据pHSE401质粒上限制酶识别位点，利用PCR扩增目的基因时，需要在引物的________端添加限制酶识别序列，通过合适的限制酶组合以达到目的基因与质粒正确连接，避免出现自身环化现象。 Ⅱ．重组质粒的筛选：将重组质粒导入对卡那霉素和四环素敏感的大肠杆菌中，将该大肠杆菌在含有卡那霉素的培养基中涂布培养，获得单菌落A、B、C、D和E，然后将菌落原位转移到含四环素的培养基中，发现A、C菌落不能存活，则导入重组质粒的菌落是________。据此推测步骤Ⅰ中的限制酶组合可以为________（填序号）。 ①XbaⅠ和NheⅠ②XbaⅠ和HindⅢ③XbaⅠ和EcoRⅠ ④SmaⅠ和NheⅠ⑤HindⅢ和EcoRⅠ⑥EcoRⅠ和NheⅠ （3）草莓中MYB10基因影响品质，若将该基因编码的多肽链中一个特定的组氨酸定点突变为酪氨酸，则可以改良品质。已知MYB10基因转录的非模板链中相关的部分碱基序列为5＇-GGACATGGG-3＇，据此设计sgRNA的序列是5＇________3＇。（组氨酸的密码子：CAU、CAC，酪氨酸的密码子：UAU、UAC） （4）CBE系统有时误对非目标序列进行编辑而造成“脱靶”，发现sgRNA的序列越短，脱靶率越高。分析脱靶最可能的原因：________。 11.（2026·山东东营·一模）小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切。复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除。相关过程如图1所示。 （1）gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循__________原则，Cas9蛋白作用的化学键是__________。 （2）为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-__________-3'（写出12个碱基）。 （3）利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有__________，最终表达载体还应具备的基本元件有__________（写出两点）。表达载体导入农杆菌后，利用含__________的培养基筛选出阳性菌落。 （4）对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测，若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因__________（填“敲除”或“未敲除”）的植株。后续还需对小麦进行白粉病抗性鉴定，请简述实验思路：__________。 12.（2026·山东青岛·一模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 （1）PCR1经过________轮循环可初步获得图中A片段，PCR2扩增GFP基因时需依据________设计引物R2，据图分析扩增目的片段时所用的引物F1和R2可对应下表中的________（填序号）。 ① 5´-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3´ ② 5´-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3´ ③ 5´-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3´ ④ 5´-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3´ 据以上表格提示PCR1和PCR2通常________（“能”或者“不能”）在同一反应体系中进行。 （2）无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________（填“5´→3´或“3´→5´”）的方向水解DNA，其目的是形成________。过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是________，过程③所需的酶有________。 （3）与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。 A. 不受限制酶切位点的限制 B. 不会引入多余碱基，不会出现移码突变 C. 操作相对简单，成功率高 D. 不需要使用PCR技术扩增目的基因 （4）利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中________，了解PA的分布和含量。 13.（2026·山东临沂·一模）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物体中提取难度大、产率低。通过在离体培养的植物细胞中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 （1）图1中标识了质粒和基因N中限制酶的切割位点，基因N的b链为转录模板链。为将基因N正确插入质粒，引物1应添加的碱基序列是5′-______-3′，切割质粒时应选用的两种限制酶是______。质粒上的抗性基因______可用于初步筛选成功转化的植物细胞。 （2）耐高温的DNA聚合酶在PCR的______步骤中起作用。PCR扩增产物和质粒分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含N基因的重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后、质粒对应部分大小基本不变。进一步筛选转化的细胞，以1~4号细胞株中提取的DNA为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。初步判断实验组_____（从“1~4”中选填）的细胞中成功插入了基因N，理由是______。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有______。 a.5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b.5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c.5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d.5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' 14.（2026·山东聊城·一模）弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）最具代表性的特异性抗原是CD20，超过95%的DLBCL病例强表达CD20.抗原蛋白CD19在正常B细胞和DLBCL细胞表面都可稳定、高密度表达，也是B细胞受信号通路的重要组成部分。双靶点嵌合抗原受体T细胞（CAR—T）疗法是未来治疗DLBCL的发展方向，科学家将患者T细胞改造成同时表达CD19抗原受体和CD20抗原受体（对应基因简称为CAR基因）的CAR—T细胞。其基本流程如图1、2所示： （1）从患者体内获取的T细胞主要有辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc），由Th细胞改造完成的CAR—T细胞受到抗原刺激后，可分泌______，促进正常B细胞的增殖分化；由Tc细胞改造完成的CAR—T细胞裂解DLBCL细胞需要受到_______的双信号刺激才能进行。 （2）CD19CAR—T细胞长期激活可能导致正常B细胞耗竭，影响体液免疫功能。为降低该风险，结合题目信息，从图2和图3中选择部分或全部元件，设计新的基因表达载体，在答题卡相应位置画出元件排列顺序示意图（一个基因单独或多个基因拼接共用一个启动子为一个元件），并辅以必要的文字说明_______。 （3）图4为利用无缝克隆（In—Fusion）技术构建含CAR基因的重组质粒流程图，其中In—Fusion酶可以将任何具有相同15~20bp末端序列的线性DNA分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。 ①图中过程Ⅰ是利用PCR技术将质粒线性化，为了保证扩增后的产物是图中所示的线性质粒，应该选择引物_______。CAR基因序列可以由生物科技公司合成，扩增CAR基因时，引物F和R序列要依据_______的末端序列设计。 ②为了筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠杆菌，菌液涂布到含_______的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入_______等进行菌落PCR，并通过电泳鉴定PCR产物。 ③与传统构建重组质粒的方法相比，In—Fusion技术的优点有_______。（答出两点即可） 15.（2026·山东济宁·一模）科学家通过基因工程改造大肠杆菌，实现规模化生产人胰岛素；利用蛋白质工程优化胰岛素结构，通过将胰岛素B链的第28位氨基酸-脯氨酸（密码子为CCU）替换为天冬氨酸（密码子为GAU），有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。图1是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，图2是利用大引物PCR技术引入特定位点突变的流程。回答下列问题。 （1）图1中质粒作为载体时未标出的必需结构是____。为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5’端应添加限制酶____的识别序列，下游引物5’端的15个碱基序列为5’-____-3’。 （2）β-半乳糖苷酶可以将无色X-gal分解产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，培养基中需添加____，从____色菌落中选择。 （3）图2中，为了得到可表达出速效胰岛素类似物的改良基因，进行第一次PCR时，上游引物对应突变位点的碱基序列是5’-____-3’。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR时，至少要进行____次循环，才能获得完成定点突变、双链等长的改良基因。 16.（2026·山东德州·一模）S蛋白能够特异性识别癌细胞表面抗原，L蛋白是一种可被低氧环境激活的菌体裂解酶，科研人员将S蛋白基因和L蛋白基因连接为S-L融合基因，利用腺病毒AAV构建基因表达载体，再利用AAV和大肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，将S-L融合基因导入大肠杆菌基因组中，构建出能够精准递送抗癌药物的工程菌。 图1：S-L融合基因的构建过程 图2：同源重组替换基因的过程 （1）已知S蛋白基因转录时以b链为模板，L基因转录时以a链为模板。在构建S-L融合基因时，最好使用限制酶___________分别切割S蛋白基因和L蛋白基因，再用___________酶连接。将S-L融合基因连接至AAV载体时，需利用限制酶___________对S-L融合基因进行切割。 （2）AAV作为载体应具备的条件有___________(答出两点)。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌后，获得甲、乙两种大肠杆菌，分别提取其DNA，加入引物1、2、3扩增并电泳，结果如图3所示。其中成功导入S-L融合基因的大肠杆菌为___________(填“甲”或“乙”)；条带③为用引物___________扩增的产物。 （4）已知癌细胞周围为低氧环境。把抗癌药物注入含S-L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送，分析其机理是___________。 ( 1 ) 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题09基因工程 2大考点概览 考点01 DNA粗提取、DNA片段的扩增及电泳实验 考点02 基因工程的基本操作程序 ( DNA粗提取、DNA片段的扩增及电泳实验 考点1 )1.（2026·山东滨州·一模）关于“DNA粗提取与鉴定”和“琼脂糖凝胶电泳”的实验，下列说法正确的是（ ） A. 研磨液需经过4℃静置后才可离心获取上清液 B. 将获得的DNA直接加入二苯胺试剂后沸水浴加热呈现蓝色 C. 电泳时加入的核酸染料在紫外光照射下可发出荧光 D. 设置PCR循环程序的最后一次复性时间时，可与之前循环相同 【答案】C 【解析】A、研磨液研磨后只需先过滤除去固体残渣，可无需4℃静置即可离心或直接静置取含DNA的上清液，A错误； B、二苯胺试剂鉴定DNA时，需先将DNA溶解在2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂沸水浴加热才会呈现蓝色，直接加入未溶解的DNA，反应无法充分进行，B错误； C、电泳时加入的核酸染料可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外光照射下可发出荧光，用于显示核酸条带的位置，C正确； D、在PCR循环程序中，最后一次复性（延伸）时间通常会适当延长，以保证所有DNA片段都能充分完成延伸，而不是与之前循环相同，D错误。 故选C。 2.（2026·山东临沂·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（ ） A. PCR复性温度与引物的长度以及引物中GC碱基的相对含量有关 B. 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 C. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D. 在同一电场作用下，通常DNA片段越长，在凝胶中迁移速率越慢 【答案】C 【解析】A、PCR复性过程是引物与模板DNA单链互补配对的过程，引物长度越长、GC碱基相对含量越高，引物与模板结合的稳定性越强，所需复性温度越高，因此复性温度与引物长度、GC相对含量有关，A正确； B、为避免外源DNA等杂质污染，干扰PCR扩增结果，实验使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等试剂和耗材，使用前必须进行高压灭菌处理，B正确； C、凝胶载样缓冲液中的指示剂仅用于指示电泳的迁移进程，方便判断电泳终止时机，无法指示DNA分子的具体位置，DNA的位置需要经过专门染色后用紫外灯才能观察到，C错误； D、DNA带负电，电场作用下向正极迁移，凝胶的分子筛效应会使更长的DNA片段受到的阻力更大，因此同一电场下，DNA片段越长，在凝胶中迁移速率越慢，D正确。 故选C。 3.下列关于PCR技术的说法，错误的是（ ） A. PCR前需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部 B. 每一次循环都需要向离心管添加一次引物 C. 延伸的时长主要由模板链的长度决定 D. PCR步骤所需温度由高到低依次为变性、延伸、复性 【答案】B 【解析】A、PCR反应前需短暂离心，使反应液聚集于离心管底部，避免液体挂壁影响反应效率，A正确； B、引物在PCR反应开始时一次性加入，后续循环中无需重复添加，B错误； C、延伸时长取决于待扩增DNA片段的长度，模板链越长，延伸所需时间越长，C正确； D、PCR循环的正确温度顺序为：变性（高温解链，约95℃）→ 复性（低温退火，约55℃）→ 延伸（中温合成，约72℃），即PCR步骤所需温度由高到低依次为变性、延伸、复性，D正确。 故选B。 4.（2026·山东青岛·一模）下列关于现代生物技术及生物学实验的叙述，正确的是（ ） A. 琼脂糖凝胶电泳实验中，琼脂糖融化后应立即加入核酸染料，以免凝胶凝固导致染料分布不均 B. DNA粗提取实验中，常利用DNA在酒精中溶解度较大的特性来提取DNA C. DNA粗提取实验中，EDTA（蛋白质变性剂）可抑制DNA酶的活性，防止研磨过程中DNA被水解 D. 通过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白 【答案】C 【解析】A、琼脂糖凝胶电泳实验中，琼脂糖融化后需冷却至50~60℃再加入核酸染料，避免温度过高导致染料降解、有毒染料挥发，并非立即加入，A错误； B、DNA粗提取实验中，DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质易溶于酒精，利用该特性可让DNA析出以分离杂质，B错误； C、DNA酶的活性依赖镁离子等金属辅因子，EDTA可螯合这类金属离子，从而抑制DNA酶活性，防止研磨过程中DNA被水解，C正确； D、单细胞蛋白是发酵获得的微生物菌体本身，直接收集菌体即可得到，无需从微生物细胞中提取，D错误。 故选C。 5.（2026·山东淄博·一模）下下列关于生物学实验的说法正确的是（ ） 选项 实验名称 相关描述 A 探究植物细胞的吸水和失水 仅使用低倍镜观察，随着外界蔗糖溶液浓度的增加，细胞大小基本不变 B 探究酵母菌细胞呼吸的方式 有氧呼吸组应让空气持续依次通过3个锥形瓶 C DNA的粗提取与鉴定 可进行两次离心，第一次离心取沉淀物，第二次离心取上清液 D DNA片段的扩增及电泳鉴定 电泳缓冲液中需加入指示剂以便观察电泳进程 A. A B. B C. C D. D 【答案】A 【解析】A、探究植物细胞的吸水和失水实验仅用低倍镜即可清晰观察到质壁分离及复原现象；植物细胞的细胞壁伸缩性极弱，即使细胞失水发生质壁分离，细胞壁围成的细胞整体大小基本不变，A正确； B、探究酵母菌有氧呼吸方式时，空气需间歇性地通过NaOH溶液、酵母菌培养液、澄清石灰水，B错误； C、DNA粗提取与鉴定实验中，第一次离心为破碎细胞后离心，DNA溶解于上清液中，应取上清液；第二次为加入冷酒精析出DNA后离心，DNA聚集在沉淀物中，应取沉淀物，C错误； D、DNA电泳鉴定时，指示剂是添加在待扩增样品的上样缓冲液中，用于指示电泳进程，并非加入电泳缓冲液，D错误。 故选A。 ( 基因工程的基本操作程序 考点2 )6.（2026·山东潍坊·一模）同源重组技术是指利用目的基因与插入位点两端的同源序列实现目的基因的定向插入。为研究马铃薯抗马铃薯早疫病菌（As）感染的能力是否与S基因表达有关，研究人员用PCR技术扩增S基因反义片段，通过同源重组技术将反义片段插入Ti质粒，并将该质粒导入抗As马铃薯植株中，过程如图1所示。反义片段转录形成的RNA可与S基因的mRNA互补结合，从而抑制S基因的表达。 （1）农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内______的过程。反义片段转录形成的RNA抑制了S基因表达的______过程。 （2）用限制酶切割图1中质粒会产生黏性末端，需用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平，该过程应选用的限制酶是______。利用同源重组技术获得重组质粒，需要引物在片段末端加入与切割位点末端相同的同源序列，引物F和R所含的同源序列分别为5′-______-3′和5′-______-3′（两空只写出与扩增的S基因片段末端序列相连的3个碱基）。 （3）将反义片段转入抗As马铃薯细胞后，需在培养基中加入______（填“卡那霉素”“氨苄青霉素”或“卡那霉素和氨苄青霉素”）进行筛选。 （4）将三种植株分别接种致病菌，菌斑大小和未接种致病菌植株各个生长指标的相对值如图2所示。 据图2分析，S基因对马铃薯植株的作用是______。成功转入S基因反义片段植株与敲除S基因的植株生长指标有明显差异，推测原因是______。 【答案】（1）①. 维持稳定和表达 ②. 翻译 （2）①. BbvCⅠ ②. TGA ③. TCA （3）卡那霉素 （4） ①. 提高植株抗As感染的能力 ②. S基因反义片段转录形成的RNA降低了生长素合成相关基因的表达 【解析】 【小问1详解】 农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。反义片段转录形成的RNA可与S基因的mRNA互补结合，从而抑制S基因表达的翻译过程，因为翻译是基于mRNA进行的，互补结合会阻碍翻译的进行。 【小问2详解】 由图中碱基序列及其互补序列可知，质粒切割位点存在ScaⅠ、Sma Ⅰ、Xma Ⅰ和BbvCⅠ识别序列；Sma Ⅰ和Xma Ⅰ识别的序列相同，只是切割位点不同，且sma Ⅰ在质粒上还有切割位点，选择sma Ⅰ和Xma Ⅰ会破坏质粒的结构，不能选用限制酶sma Ⅰ和Xma Ⅰ；限制酶ScaⅠ切割后DNA聚合酶无法从5'端添加脱氧核苷酸，质粒上有限制酶BbvC I的识别序列，可选用BbvC I。利用同源重组技术获得重组质粒，需要引物在片段末端加入与切割位点末端相同的同源序列，因需反向插入，引物F对应质粒切割后的右切口，引物R对应质粒切割后的左切口，根据BbvC I切割位点及补平后的序列，引物F和R所含的同源序列分别为5′-TGA-3'和5′-TCA-3'。 【小问3详解】 Ti质粒中，卡那霉素抗性基因位于T-DNA区域内，随T-DNA整合入植物基因组；而氨苄青霉素抗性基因位于T-DNA外，不会转入植物细胞。因此，筛选成功转化的植株应使用卡那霉素培养基。 【小问4详解】 据图2分析，三种植株接种致病菌后，含S基因的植株（野生型）形成的菌斑小，由此可知S基因对马铃薯植株的作用是提高植株抗As感染的能力。根据未接种致病菌植株各个生长指标的相对值可知，成功转入S基因反义片段植株与敲除S基因的植株生长指标有明显差异，推测原因是S基因反义片段转录形成的RNA降低了生长素合成相关基因的表达。 7.（2026·山东滨州·一模）流感病毒的抗原有H和N两类，均可以分为很多亚型。某科研团队基于融合蛋白的思路，尝试制造H3、N2融合蛋白疫苗，以更好地预防H3N2病毒。 （1）获取病毒H3、N2抗原蛋白的mRNA，通过____过程得到相应的DNA，并进一步构建H3、N2融合基因。在H3蛋白基因和N2蛋白基因融合的过程中，起搭桥作用的是____（从引物1～8中选择）。 （2）从引物角度分析，两种基因能够融合的关键是____，变性后形成的杂交分子在延伸为双链等长的融合基因时，不需要添加引物的原因是____。若融合基因中上游基因的mRNA终止密码子对应的碱基序列未被切除，则融合基因翻译得到的抗原蛋白为____。 （3）将目的基因与运载体连接过程中，首先需要用____（填限制酶种类）处理载体；用____（填限制酶种类）处理目的基因所在的片段。 （4）利用大肠杆菌作受体细胞筛选获得目的菌株：首先在含卡那霉素的培养基上培养目标菌，将培养基上生长的菌落用影印法接种到含四环素的培养基上，最后选择____的菌株。 【答案】（1）①. 逆转录 ②. 引物1和引物3 （2）①. 起搭桥作用的两个引物的5'端存在部分可以碱基互补配对的序列 ②. 可沿着杂交分子互补区域的3'端继续延伸 ③. H3 （3）①. BamHⅠ和XmaⅠ ②. Sau3AI和XmaⅠ （4）能在含卡那霉素培养基上生长但不能在含四环素培养基上生长 【解析】 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 【小问1详解】 以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录，所以获取病毒H3、N2抗原蛋白的mRNA，通过逆转录过程得到相应的DNA。DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，据图可知扩增N2基因用的引物为引物1和引物6，扩增H3基因用的引物为引物3和引物8，所以起搭桥作用的是引物1和引物3。 【小问2详解】 两种基因能够融合的关键是引物1和引物3的5'端部分碱基互补配对，这样才能在搭桥、变性后杂交过程中使两个基因连接起来。变性后形成的杂交分子在延伸为双链等长的融合基因时，两条链互为引物和模板链，且两条母链均存在3'端，使DNA聚合酶能从母链的3'端开始连接脱氧核苷酸，即可沿着杂交分子互补区域的3'端继续延伸，据图可知H3基因位于融合基因的上游，所以若融合基因中上游基因的mRNA终止密码子对应的碱基序列未被切除，则融合基因翻译得到的抗原蛋白为H3。 【小问3详解】 根据限制酶识别序列及产生的黏性末端，BsaⅠ切割产生的黏性末端不固定所以不能使用，而运载体上在启动子和终止子之间还有BamHⅠ和XmaⅠ，且Sau3AI会切割卡那霉素抗性基因，所以用BamHⅠ和XmaⅠ处理运载体；因为Sau3AI产生的黏性末端和BamHⅠ产生的黏性末端相同，为同尾酶，所以为了防止载体自身环化以及保证目的基因和载体正确连接，用Sau3AI和XmaⅠ处理目的基因所在的片段。 【小问4详解】 重组质粒中卡那霉素抗性基因未被破坏，四环素抗性基因被破坏，所以在含卡那霉素的培养基上能生长，在含四环素的培养基上不能生长的菌株为含有重组质粒的目的菌株。 8.（2026·山东淄博·一模）人源干扰素IFNα-2b是一种具有抗病毒活性的真核蛋白，可通过大肠杆菌BL21（DE3）表达体系大规模生产。BL21（DE3）的质粒上有T7RNA聚合酶基因和lacI基因。T7RNA聚合酶具有极高的启动子特异性和转录效率，其表达受lacI基因编码的lac阻遏蛋白的调控，当培养基中无诱导物IPTG时，lac阻遏蛋白结合到T7RNA聚合酶基因的启动子上抑制其表达。 （1）BL21（DE3）去除了蛋白酶编码基因，目的是_______。T7RNA聚合酶基因的启动子属于______型启动子。 （2）构建重组载体时，选用了两种启动子PBAD（被大肠杆菌自身RNA聚合酶识别）和PT7（仅被T7RNA聚合酶识别），重组载体的部分结构如图1。构建基因表达载体的目的是_______。为实现目的基因在特定时期表达，图1的4个基因的启动子中为PBAD的是______（填序号）。为筛选出含重组质粒的大肠杆菌并使其大量表达IFNa-2b，培养基中需要加入_____。 （3）编码同一氨基酸的不同密码子，在不同生物体中的使用频率并不相同，即存在密码子偏好性。如果使用大肠杆菌表达一种真核蛋白，可能因密码子偏好性不同，导致目标蛋白翻译过程受阻。IFNa-2b基因的mRNA中存在一种大肠杆菌中不常见的密码子AGG，导致IFNa-2b产量极低。可利用同源重组（图2）向大肠杆菌基因组中导入密码子AGG对应的______基因提高IFNα-2b产量。图2中的同源区段可不发生交换，也可发生单交换或双交换。对大肠杆菌进行改造后，利用高温处理使质粒丢失，在培养基中加入四环素，能够生长的是发生______（填“单交换”或“双交换”）的大肠杆菌。利用引物1和引物2进行PCR扩增（引物大小忽略不计），如果插入了目的基因，PCR产物大小为______bp。 【答案】（1）①. 防止/抑制IFN Nα-2b/人源干扰素/目的蛋白/外源蛋白的降解 ②. 诱导型 （2）①. 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够在受体细胞内表达和发挥作用 ②. ①②④ ③. 卡那霉素和 IPTG （3）①. tRNA（或“转运RNA”） ②. 单交换 ③. 1100或5000 【解析】 【小问1详解】 防止蛋白酶降解外源基因表达的人源干扰素 IFNα-2b，提高目标蛋白的产量和稳定性。因为其表达受 lacI 基因编码的 lac 阻遏蛋白调控，需 IPTG 诱导才能解除抑制。 【小问2详解】 构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够在受体细胞内表达和发挥作用。启动子③是控制IFNα-2b（目的蛋白）的表达，需要在合适时机稳定表达，应该被T7RNA聚合酶识别（受IPTG调控）。 而T7RNA聚合酶基因和lac基因是调控元件，需要大肠杆菌自身RNA聚合酶来基础表达，维持菌株的调控体系，通过大肠杆菌BL21（DE3）表达体系大规模生产IFNα-2b，也需要大肠杆菌自身RNA聚合酶来基础表达，所以它们的启动子①②④是 PBAD。用于筛选导入了重组质粒（携带卡那霉素抗性基因）的大肠杆菌，不含重组质粒的大肠杆菌无法在含卡那霉素的培养基存活。 IPTG作为诱导物，解除lac阻遏蛋白对T7RNA聚合酶基因启动子的抑制，让T7RNA聚合酶表达，进而启动目的基因IFNα-2b的转录和翻译，实现大量表达。 【小问3详解】 tRNA（或识别密码子 AGG 的 tRNA），通过补充对应 tRNA 来克服密码子偏好性，提高翻译效率。单交换会使完整四环素抗性基因（Tet^r）保留，高温处理后仍含四环素抗性基因；双交换会丢失四环素抗性基因，只有成功插入目的基因的菌株（四环素敏感）才能在含四环素的培养基中存活（未插入的菌株因四环素抗性基因完整而被四环素杀死）。若发生了双交换，M1 和 M2 片段各 500 bp，目的基因 100 bp，总长度 = 500 + 100 + 500 = 1100 bp。若发生了单交换，PCR产物大小为4000+500+500=5000。 9.（2026·山东日照·一模）除草剂氟草啶（FCD）能抑制植物细胞中原卟啉原IX氧化酶的活性以达到除草效果，科研人员利用基因编辑技术使水稻2号染色体上的PPO1基因（编码原卟啉原IX氧化酶）与CP12基因结构改变（如图1），从而赋予水稻对FCD的耐受性，并利用PCR技术结合电泳对转基因水稻进行鉴定，结果如图2所示。 （1）据图1分析，利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时，应选择的引物组合为________。若基因编辑成功，PCR扩增产物的电泳结果应为图2中的________号泳道。若电泳结果中5号泳道内出现两条电泳条带，原因可能是________（填序号）。 ①样品被污染 ②复性过程温度过低 ③预变性时间较短 ④延伸过程中引物3'端被封闭 ⑤引物特异性不强 ⑥图1中的两个切割位点之间被切割后原位连接 （2）基因编辑成功后，PPO1的转录模板链是________（填“A”或“B”）链，基因编辑前后，CP12的转录模板链________（填“是”或“否”）改变。 （3）综合上述信息，分析上述基因编辑成功的水稻对FCD耐受性增强的原因是________。 【答案】（1）①. F1和R2（或F2和R1） ②. 3 ③. ①②③④⑤ （2） ①. A ②. 否 （3）强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加 【解析】 【小问1详解】 结合图示可知，与原来的染色体相比发生了倒位，若使用F1F2或R1R2则无法进行PCR扩增，若使用F1R1或F2R2，则无论是否基因编辑成功都可以扩增出产物，因此利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时，应选择的引物组合为F1和R2（或F2和R1）。根据扩增引物可知，PCR扩增产物的碱基对数量为300+911=1211，应为图2中的3号条带。若电泳结果中5号泳道内出现两条电泳条带，原因可能是①样品被污染，扩增出非目的基因；②复性过程温度过低、③预变性时间较短都导致引物与非目的基因结合扩增出非目的基因序列； ④延伸过程中引物3'端被封闭，扩增出的DNA片段偏短；⑤引物特异性不强，扩增出非目的基因；⑥图1中的两个切割位点之间被切割后原位连接，则PCR扩增没有对应的产物，故选①②③④⑤。 【小问2详解】 基因转录时，是以DNA的一条链为模板，转录的方向是启动子到终止子，沿模板的3'端到5'端。根据图中信息，基因编辑成功的PPO1基因转录的模板是A链。根据图示可知，基因编辑前后，CP12的转录模板链没有发生改变，均为B链。 【小问3详解】 综合上述信息，分析上述基因编辑成功的水稻对FCD耐受性增强的原因是强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加。 10.（2026·山东菏泽·一模）科研人员开发了一种可将靶DNA中特定位点碱基对C-G变为T-A的单碱基编辑工具（简称CBE系统）。该系统由dCas9蛋白、胞苷脱氨酶和sgRNA三部分构成，其中“dCas9蛋白+胞苷脱氨酶”在sgRNA的引导下，使靶DNA特定位点的一个碱基C脱氨反应变成U，最终实现C→T的改变。编辑过程如图1，该过程中DNA链不断裂。图1中①②代表相应过程。 （1）CBE系统与靶DNA的识别与结合过程发生了________键的断裂和形成；①过程形成的一个含A-U的DNA分子经②过程n轮（n>2）复制后，可形成________个目标DNA． （2）上述CBE系统的构建用到了图2中的质粒、目的基因和限制酶等。构建CBE系统的部分过程如下： I．重组质粒的构建：根据pHSE401质粒上限制酶识别位点，利用PCR扩增目的基因时，需要在引物的________端添加限制酶识别序列，通过合适的限制酶组合以达到目的基因与质粒正确连接，避免出现自身环化现象。 Ⅱ．重组质粒的筛选：将重组质粒导入对卡那霉素和四环素敏感的大肠杆菌中，将该大肠杆菌在含有卡那霉素的培养基中涂布培养，获得单菌落A、B、C、D和E，然后将菌落原位转移到含四环素的培养基中，发现A、C菌落不能存活，则导入重组质粒的菌落是________。据此推测步骤Ⅰ中的限制酶组合可以为________（填序号）。 ①XbaⅠ和NheⅠ②XbaⅠ和HindⅢ③XbaⅠ和EcoRⅠ ④SmaⅠ和NheⅠ⑤HindⅢ和EcoRⅠ⑥EcoRⅠ和NheⅠ （3）草莓中MYB10基因影响品质，若将该基因编码的多肽链中一个特定的组氨酸定点突变为酪氨酸，则可以改良品质。已知MYB10基因转录的非模板链中相关的部分碱基序列为5＇-GGACATGGG-3＇，据此设计sgRNA的序列是5＇________3＇。（组氨酸的密码子：CAU、CAC，酪氨酸的密码子：UAU、UAC） （4）CBE系统有时误对非目标序列进行编辑而造成“脱靶”，发现sgRNA的序列越短，脱靶率越高。分析脱靶最可能的原因：________。 【答案】（1）①. 氢 ②. 2n-1-1 （2）①. 5' ②. A 、C ③. ②③⑤ （3）GGACAUGGG （4）非目标序列也可能含有与sgRNA配对的碱基序列，造成sgRNA选错对象与之结合而脱靶 【解析】 【小问1详解】 CBE系统与靶DNA的识别和结合过程中，首先基因组DNA双链先解开，其中的一条链与sgRNA结合，发生了氢键的断裂和形成。第一次复制得到G-C、A-U，第二次复制得到G-C、C-G、A-U、A-T，仅有1个目标DNA，第三次复制得到G-C、C-G、G-C、C-G、A-T、A-T、A-U、A-T，以此类推，经n轮复制后，G-C占一半，另一半中有一个是A -U，因此经脱氨作用形成的一个如图所示的DNA分子需要经过2次复制后才可形成碱基编辑的DNA，所以经过n轮（n>2）复制可形成（2n－1-1）个碱基编辑的DNA。 【小问2详解】 子链延伸的方向是5'→3'，根据pHSE401质粒上限制酶识别位点，利用PCR扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶识别序列，通过合适的限制酶组合以达到目的基因与质粒正确连接，避免出现自身环化现象。导入重组质粒的菌落是 A、C（在卡那霉素培养基存活，在四环素培养基不能存活，说明四环素抗性基因被破坏，目的基因插入其中）。① Xba I 和 Nhe I：两种酶切后产生的黏性末端相同，会导致质粒自身环化或目的基因反向连接，不符合要求。 ② Xba I 和 Hind III：破坏四环素抗性基因，符合条件。 ③ Xba I 和 EcoR I：破坏四环素抗性基因，符合条件。 ④ Sma I 和 Nhe I：Sma I破坏卡那霉素抗性基因，不符合筛选条件。 ⑤ Hind III 和 EcoR I：破坏四环素抗性基因，符合条件。 ⑥ EcoR I 和 Nhe I：未破坏四环素抗性基因，不符合条件。 因此可选 ②③⑤。 【小问3详解】 MYB10基因转录的非模板链为5'-GGACATGGG-3'，则模板链为3'-CCTGTACCC-5'，转录的mRNA序列为5'-GGACAUGGG-3'。 组氨酸密码子为CAU、CAC，对应DNA模板链为GTA、GTG。要将组氨酸突变为酪氨酸（UAU、UAC），需将DNA中的C-G变为T-A，因此sgRNA的序列是5'-GGACAUGGG-3'。 【小问4详解】 sgRNA序列越短，与靶DNA的特异性结合能力越弱， 非目标序列也可能含有与sgRNA配对的碱基序列，造成sgRNA选错对象与之结合而脱靶。 11.（2026·山东东营·一模）小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切。复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除。相关过程如图1所示。 （1）gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循__________原则，Cas9蛋白作用的化学键是__________。 （2）为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-__________-3'（写出12个碱基）。 （3）利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有__________，最终表达载体还应具备的基本元件有__________（写出两点）。表达载体导入农杆菌后，利用含__________的培养基筛选出阳性菌落。 （4）对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测，若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因__________（填“敲除”或“未敲除”）的植株。后续还需对小麦进行白粉病抗性鉴定，请简述实验思路：__________。 【答案】（1）①. 碱基互补配对 ②. 磷酸二酯键 （2）AGAUUGGGUCCU （3）①. SpeI和NheI ②. 复制原点、终止子 ③. 潮霉素 （4）①. 敲除 ②. 用布氏白粉菌感染基因改造的小麦和没有经过基因改造的小麦，如果基因改造的小麦产量高，没有改造的小麦产量低，则说明改造成功 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循碱基互补配对原则。 gRNA能够识别DNA特定序列，引导Cas9蛋白通过催化磷酸二酯键的断裂发挥作用，二者的作用类似基因工程中的限制酶。 【小问2详解】 观察图2，目标DNA序列为5′-AGATGCATATCCCGGAGATTGGGTCCTGCGTGACGG-3′，其3′端（即该序列的右侧）的PAM序列是“AGATTG”；复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链（3′端-5′端）互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除；可见gRNA靶向序列的应该与目标DNA序列（5′端-3′端）序列基本一致，但需要将DNA序列上的T换成U，又在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-AGAUUGGGUCCU-3'（写出12个碱基）。 【小问3详解】 通过限制酶SpeⅠ和NheⅠ将载体1启动子a和gRNA基因剪切，该片段两端的黏性末端相同，因此再用SpeⅠ将载体2切开，通过DNA连接酶将该片段连接到载体2即可成为最终载体。基因表达载体除了图中所示的目的基因、启动子、标记基因外，还应具有复制原点、终止子等元件。由于载体中含有潮霉素抗性基因，所以可用含潮霉素的培养基筛选出阳性菌落。 【小问4详解】 AvaⅡ酶切位点存在于M基因中，若M基因未被敲除，AvaⅡ酶切后会产生两个条带；若M基因被敲除，M基因序列改变，AvaⅡ酶切位点消失，酶切后会出现1个条带，所以检测结果出现1个条带时，该植株为M基因敲除的植株。 白粉病抗性鉴定可通过将白粉病菌接种到小麦植株上，观察植株是否感染白粉病来判断。具体思路为：用布氏白粉菌感染基因改造的小麦和没有经过基因改造的小麦，如果基因改造的小麦产量高，没有改造的小麦产量低，则说明改造成功。 12.（2026·山东青岛·一模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 （1）PCR1经过________轮循环可初步获得图中A片段，PCR2扩增GFP基因时需依据________设计引物R2，据图分析扩增目的片段时所用的引物F1和R2可对应下表中的________（填序号）。 ① 5´-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3´ ② 5´-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3´ ③ 5´-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3´ ④ 5´-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3´ 据以上表格提示PCR1和PCR2通常________（“能”或者“不能”）在同一反应体系中进行。 （2）无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________（填“5´→3´或“3´→5´”）的方向水解DNA，其目的是形成________。过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是________，过程③所需的酶有________。 （3）与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。 A. 不受限制酶切位点的限制 B. 不会引入多余碱基，不会出现移码突变 C. 操作相对简单，成功率高 D. 不需要使用PCR技术扩增目的基因 （4）利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中________，了解PA的分布和含量。 【答案】（1）①. 2 ②. GFP基因的一端和PABD基因一端的核苷酸序列 ③. ①、④ ④. 不能 （2）①. 5'→3' ②. 黏性末端 ③. 过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列） ④. DNA聚合酶和DNA连接酶 （3）ABC （4）①. 草胺膦 ②. 绿色荧光点的分布 【解析】 【小问1详解】 PCR第1轮：得到长短不一的链；PCR第2轮：首次出现长度正好等于A片段的 DNA。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于下表中的①。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于下表中的④。PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行，因为PCR1与PCR2的引物F1和R2之间存在互补序列，若在同一体系中扩增，引物会相互配对形成其他产物，干扰正常PCR反应，无法获得正确的目的片段。 【小问2详解】 据图可知，T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA（单链），暴露出3' 端非互补序列，即黏性末端。过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列），因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶（DNA聚合酶将游离的单个脱氧核苷酸加到子链3′末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 【小问3详解】 传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切位点的限制，不会引入多余碱基，不会出现移码突变，操作时间短，成功率高，ABC正确，D错误。 【小问4详解】 由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 13.（2026·山东临沂·一模）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物体中提取难度大、产率低。通过在离体培养的植物细胞中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 （1）图1中标识了质粒和基因N中限制酶的切割位点，基因N的b链为转录模板链。为将基因N正确插入质粒，引物1应添加的碱基序列是5′-______-3′，切割质粒时应选用的两种限制酶是______。质粒上的抗性基因______可用于初步筛选成功转化的植物细胞。 （2）耐高温的DNA聚合酶在PCR的______步骤中起作用。PCR扩增产物和质粒分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含N基因的重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后、质粒对应部分大小基本不变。进一步筛选转化的细胞，以1~4号细胞株中提取的DNA为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。初步判断实验组_____（从“1~4”中选填）的细胞中成功插入了基因N，理由是______。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有______。 a.5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b.5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c.5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d.5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' 【答案】（1）①. AGATCT ②. BamHI、EcoRI ③. 2 （2）①. 延伸 ②. 检验PCR反应中是否有外源DNA污染 ③. 1 ④. 目的基因N大小约为2.3kb，实验组1的电泳结果与其大小接近 （3）GCC 【解析】 【分析】PCR技术的原理与操作：包括PCR扩增的原料组成（模板、引物、dNTP、酶、缓冲液），及PCR三个步骤（变性、复性、延伸）中DNA聚合酶的作用阶段。 【小问1详解】 基因N的b链为转录模板链，质粒上启动子与终止子之间有 BamHI 、EcoRI 和XbaI的识别序列，其中BamHI和XbaI会破坏目的基因，观察表格中限制酶识别序列及切割位点可知BglI和BamHI为同尾酶，，故选择BamHI 和 EcoRI 切割质粒，选择BglI和 EcoRI 切割目的基因，根据模板链为链，为基因N正确插入质粒，所以需要在引物1应添加BglI的碱基序列是5′-AGATCT-3′。T-DNA区域内的抗性基因 2 会随 T-DNA 整合到植物细胞染色体中，可通过添加对应抗生素初步筛选成功转化的植物细胞。 【小问2详解】 PCR 的延伸步骤中，耐高温的DNA聚合酶以DNA为模板，从引物 3' 端开始合成子链，该步骤需要耐高温DNA聚合酶催化。设置空白对照组（用无菌水代替模板DNA），目的是排除试剂、操作等引入的外源DNA污染，确保实验结果可靠。重组质粒大小约9.5kb，原质粒为7.2kb，因此基因N大小约为 9.5−7.2=2.3 kb。实验组1的电泳条带大小约2000bp（接近 2.3kb），与目的基因N的大小相符，说明成功插入了基因N。 【小问3详解】 密码子位于mRNA上，与DNA模板链互补，与引物（DNA链）反向互补。a引物的诱变序列为GCA（DNA链），对应mRNA密码子GCA。 根据引物a的GCA为第240位密码子对应序列，可知a引物第244位密码子开始对应的序列（TGG/CTG/TTT……），观察其与c引物上最前面一位密码子对应序列之后的完全一致，可知c引物最前面的GCC即是第243位密码子，也就是丙氨酸诱变序列，即丙氨酸的另一个密码子为GCC。 14.（2026·山东聊城·一模）弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）最具代表性的特异性抗原是CD20，超过95%的DLBCL病例强表达CD20.抗原蛋白CD19在正常B细胞和DLBCL细胞表面都可稳定、高密度表达，也是B细胞受信号通路的重要组成部分。双靶点嵌合抗原受体T细胞（CAR—T）疗法是未来治疗DLBCL的发展方向，科学家将患者T细胞改造成同时表达CD19抗原受体和CD20抗原受体（对应基因简称为CAR基因）的CAR—T细胞。其基本流程如图1、2所示： （1）从患者体内获取的T细胞主要有辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc），由Th细胞改造完成的CAR—T细胞受到抗原刺激后，可分泌______，促进正常B细胞的增殖分化；由Tc细胞改造完成的CAR—T细胞裂解DLBCL细胞需要受到_______的双信号刺激才能进行。 （2）CD19CAR—T细胞长期激活可能导致正常B细胞耗竭，影响体液免疫功能。为降低该风险，结合题目信息，从图2和图3中选择部分或全部元件，设计新的基因表达载体，在答题卡相应位置画出元件排列顺序示意图（一个基因单独或多个基因拼接共用一个启动子为一个元件），并辅以必要的文字说明_______。 （3）图4为利用无缝克隆（In—Fusion）技术构建含CAR基因的重组质粒流程图，其中In—Fusion酶可以将任何具有相同15~20bp末端序列的线性DNA分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。 ①图中过程Ⅰ是利用PCR技术将质粒线性化，为了保证扩增后的产物是图中所示的线性质粒，应该选择引物_______。CAR基因序列可以由生物科技公司合成，扩增CAR基因时，引物F和R序列要依据_______的末端序列设计。 ②为了筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠杆菌，菌液涂布到含_______的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入_______等进行菌落PCR，并通过电泳鉴定PCR产物。 ③与传统构建重组质粒的方法相比，In—Fusion技术的优点有_______。（答出两点即可） 【答案】（1）①. 细胞因子 ②. 抗原（或靶细胞 DLBCL 细胞）的接触和辅助性 T 细胞（Th）表面的特定分子 （2）元件排列顺序：。 文字说明： 利用pEF1α启动子持续表达nTA基因，nTA基因表达产物在没有四环素类抗生素时，无法激活pTRE启动子。 当正常B细胞出现耗竭风险时，向患者体内注入四环素类抗生素，nTA基因表达产物结合四环素类抗生素后，激活pTRE启动子，启动vp3基因表达，vp3基因表达产物诱导CAR—T细胞凋亡，从而减少CAR—T细胞数量，降低正常B细胞耗竭的风险。 （3）①. 引物2和引物3 ②. Pc 和 Ter ③. 氨苄青霉素 ④. PCR 缓冲液、Taq 酶、dNTP、特异性引物 ⑤. 对比传统构建重组质粒，In一Fusion 技术的优势有不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等。 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【小问1详解】 如白细胞介素 - 4、白细胞介素 - 6 等）：辅助性 T 细胞（Th）受抗原刺激后，会分泌细胞因子，这些细胞因子可以促进 B 细胞的增殖分化，形成浆细胞和记忆细胞。细胞毒性 T 细胞（Tc）的活化需要双信号刺激，第一信号来自其与靶细胞（DLBCL 细胞）的接触，第二信号来自辅助性 T 细胞（Th）提供的共刺激信号。 【小问2详解】 为了降低 CD19CAR-T 细胞长期激活导致正常 B 细胞耗竭的风险，我们可以设计一个可诱导的 “自杀开关” 系统，在需要时清除过度激活的 CAR-T 细胞。降低CD19CAR—T细胞长期激活导致正常B细胞耗竭的风险，元件排列顺序：pEF1α启动子 → nTA基因 → vp3基因 → pTRE启动子 → CAR基因。如图： 文字说明： 利用pEF1α启动子持续表达nTA基因，nTA基因表达产物在没有四环素类抗生素时，无法激活pTRE启动子。 当正常B细胞出现耗竭风险时，向患者体内注入四环素类抗生素，nTA基因表达产物结合四环素类抗生素后，激活pTRE启动子，启动vp3基因表达，vp3基因表达产物诱导CAR—T细胞凋亡，从而减少CAR—T细胞数量，降低正常B细胞耗竭的风险。 【小问3详解】 ①引物选择与设计：应选择引物2和 3（或根据图中线性化位点选择能扩增出完整线性化质粒的引物对）。PCR 扩增时，引物需要与模板链的 3' 端互补，从而保证扩增产物是图中所示的线性化质粒。扩增 CAR 基因时，引物 F 和 R 序列要依据线性化质粒的末端序列设计，即Pc 和 Ter的末端序列。这样才能保证扩增出的 CAR 基因两端与线性化质粒的末端序列相同，以便 In-Fusion 酶进行无缝连接。 ②筛选与鉴定： 菌液应涂布到含氨苄青霉素 的培养基中。因为重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），只有成功导入质粒的大肠杆菌才能在该培养基上生长。 挑取菌落并加入 PCR 缓冲液、Taq 酶、dNTP、特异性引物 等进行菌落 PCR，通过电泳鉴定 PCR 产物的大小，判断 CAR 基因是否成功插入。 ③ In—Fusion 技术的优点：不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏；无需酶切 和连接，简化实验流程等。 15.（2026·山东济宁·一模）科学家通过基因工程改造大肠杆菌，实现规模化生产人胰岛素；利用蛋白质工程优化胰岛素结构，通过将胰岛素B链的第28位氨基酸-脯氨酸（密码子为CCU）替换为天冬氨酸（密码子为GAU），有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。图1是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，图2是利用大引物PCR技术引入特定位点突变的流程。回答下列问题。 （1）图1中质粒作为载体时未标出的必需结构是____。为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5’端应添加限制酶____的识别序列，下游引物5’端的15个碱基序列为5’-____-3’。 （2）β-半乳糖苷酶可以将无色X-gal分解产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，培养基中需添加____，从____色菌落中选择。 （3）图2中，为了得到可表达出速效胰岛素类似物的改良基因，进行第一次PCR时，上游引物对应突变位点的碱基序列是5’-____-3’。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR时，至少要进行____次循环，才能获得完成定点突变、双链等长的改良基因。 【答案】（1）①. 终止子 ②. XhoI ③. CAATTGGTAGTCGAA （2）①. 氨苄青霉素和X-gal ②. 白 （3）①. GAT ②. 2 【解析】 【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【小问1详解】 载体需具备启动子、终止子、标记基因、复制原点和限制酶切割位点等，图1质粒未标出的必需结构是终止子。为保证目的基因与载体正向连接且不破坏目的基因和标记基因，限制酶Sal I会破坏两个标记基因，NheⅠ会破坏目的基因，所以选择MunⅠ和XhoⅠ进行双酶切，因此为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5'端应添加限制酶XhoⅠ的识别序列，下游引物的5'端应添加限制酶MunⅠ的识别序列，所以下游引物5'端的15个碱基序列为5'-CAATTGGTAGTCGAA-3'。 【小问2详解】 已知β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。而结合题图，目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达，无法产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，则菌落呈现白色。故应将转化后的大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上，筛选出的白色的菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。 【小问3详解】 根据碱基互补配对原则，B链的第28位氨基酸—脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸 (密码子为GAU)，则需要将转录模板链相应位置GGA改为CTA，那么与之结合的相应引物的序列应由CCT改为GAT。利用大引物②链作为下游引物和常规上游引物共同进行PCR时，根据PCR过程和DNA分子半保留复制特点可知，第一轮得到两个DNA分子，其中一个DNA分子一条链含大引物②（含突变位点）另一条链为模板链（不含突变位点），两条链不等长；另一个DNA分子和模板DNA一样（无突变位点）。第二次循环中，以含有大引物②的DNA单链为模板，以常规引物复制得到的DNA分子即为完成定点突变、双链等长的改良基因。 16.（2026·山东德州·一模）S蛋白能够特异性识别癌细胞表面抗原，L蛋白是一种可被低氧环境激活的菌体裂解酶，科研人员将S蛋白基因和L蛋白基因连接为S-L融合基因，利用腺病毒AAV构建基因表达载体，再利用AAV和大肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，将S-L融合基因导入大肠杆菌基因组中，构建出能够精准递送抗癌药物的工程菌。 图1：S-L融合基因的构建过程 图2：同源重组替换基因的过程 （1）已知S蛋白基因转录时以b链为模板，L基因转录时以a链为模板。在构建S-L融合基因时，最好使用限制酶___________分别切割S蛋白基因和L蛋白基因，再用___________酶连接。将S-L融合基因连接至AAV载体时，需利用限制酶___________对S-L融合基因进行切割。 （2）AAV作为载体应具备的条件有___________(答出两点)。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌后，获得甲、乙两种大肠杆菌，分别提取其DNA，加入引物1、2、3扩增并电泳，结果如图3所示。其中成功导入S-L融合基因的大肠杆菌为___________(填“甲”或“乙”)；条带③为用引物___________扩增的产物。 （4）已知癌细胞周围为低氧环境。把抗癌药物注入含S-L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送，分析其机理是___________。 【答案】（1）①. XbaⅠ、SpeⅠ ②. DNA连接 ③. PstⅠ、BglⅡ （2）有多个限制酶酶切位点、基因能够在受体细胞内自我复制或整合到受体细胞DNA中，随着宿主细胞DNA复制而复制、有标记基因、对宿主细胞无害 （3） ①. 乙 ②. 引物1和引物2 （4）工程菌中表达的S蛋白可特异性结合癌细胞抗原，将工程菌引至癌细胞，癌细胞周围的低氧环境激活L蛋白导致工程菌破裂，抗癌药物释放 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 构建S-L融合基因需保证两个基因转录方向一致（S基因以b链为模板、L基因以a链为模板），XbaⅠ和 SpeⅠ切割后可使S、L基因产生互补黏性末端，实现定向连接，避免反向连接导致基因表达异常。限制酶切割基因后产生的DNA片段，需通过DNA连接酶恢复脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，才能将S、L基因连接为S-L融合基因。这两种限制酶的酶切位点位于S-L融合基因的两端，切割后可使融合基因产生特异性末端，能定向插入AAV载体的对应酶切位点，同时保证融合基因的完整，避免自身环化或载体自连。 【小问2详解】 基因工程载体需满足目的基因的装载、传递、稳定遗传和筛选等核心需求，必备条件为：有多个限制酶酶切位点，便于根据目的基因选择合适酶切位点，插入目的基因且不破坏载体自身结构；能在受体细胞内自我复制（或整合到受体细胞DNA 中，随宿主细胞DNA同步复制），保证目的基因在受体细胞中稳定遗传并扩增； 有标记基因（如抗性基因），便于通过选择培养基筛选出成功导入目的基因的受体细胞； 对宿主细胞无害，不影响受体细胞的正常生命活动，确保受体细胞能正常增殖、表达目的基因。 【小问3详解】 未导入S-L融合基因的大肠杆菌（甲），其基因组中无该融合基因，仅能扩增出少量短片段，电泳条带少；而成功导入融合基因的大肠杆菌（乙），引物可结合融合基因及大肠杆菌基因组的同源区段，扩增出不同长度的DNA片段，因此电泳出现①②③三条条带，条带数量多于甲。PCR扩增产物的长度由引物结合的模板位置决定，引物1和引物2分别结合在S-L融合基因的两端，扩增的DNA片段长度最长；电泳中DNA片段越长，迁移速率越慢，因此最长的扩增产物对应条带③（条带①②为引物1和引物3、引物2和引物3组合扩增的短片段，迁移速率更快）。 【小问4详解】 该过程依托S蛋白和L蛋白的特异性功能，实现抗癌药物的靶向定位和定向释放，两步完成精准递送： 靶向定位：工程菌中S-L融合基因表达出S蛋白，S蛋白能特异性识别并结合癌细胞表面的抗原，使携带抗癌药物的工程菌被精准引导至癌细胞周围，避免药物作用于正常细胞； 定向释放：癌细胞周围为低氧环境，可激活工程菌表达的L蛋白（菌体裂解酶），L蛋白发挥裂解作用使工程菌的菌体破裂，内部装载的抗癌药物随即释放，精准作用于癌细胞，实现药物的靶向递送。 ( 1 ) 学科网（北京）股份有限公司 $