2026届高三生物二轮复习导学案微专题 PCR相关拓展及在基因工程中的应用

二轮复习微专题 PCR相关拓展及在基因工程中的应用 复习目标：1.掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳的原理及应用 2.掌握PCR在基因工程“四部曲”中的应用 1、 PCR与琼脂糖凝胶电泳，PCR是聚合酶链式反应的缩写。 它是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，包括： 、 、 、 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 1．PCR扩增的过程图解 2．PCR扩增中的相应关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 共消耗引物的数量 产生的DNA种类 得到等长的DNA的数量 3．DNA分子具有可解离的基团，在一定的 下，这些基团可以带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。 PCR的产物一般通过 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的 下被检测出来。 【典例分析】提取水稻822号和突变型乙品种的5号染色体DNA进行扩增，扩增产物的电泳结果如下图所示： 据电泳结果推测5号染色体上第 对引物对应区间(记为N基因)发生了碱基的 (填“增添”、“缺失”或“替换”)。 方法总结：在使用引物对DNA扩增时，扩增出的是 的片段。 2、 利用PCR在目的基因两侧添加限制酶识别序列 典例1.（2025·天津南开·一模）研究表明，COX-2基因与肿瘤细胞的迁移有关，科研人员通过构建COX-2基因表达载体（如图），用于进一步研究COX-2基因表达产物对肿瘤细胞迁移的作用机制。图中1链为转录的模板链，BamHⅠ、SacⅠ为限制酶识别序列，LacZ基因表达产物可使显色剂X-gal变蓝。下列说法正确的是（    ） A．通过PCR扩增COX-2基因片段，需要加入引物A和引物D B．为构建COX-2表达载体，需在与1链结合的引物的5'端添加BamHⅠ识别序列 C．在含氨苄青霉素的培养基中能生长的是含重组质粒的菌落 D．在含X-gal培养基中长出的蓝色菌落含重组质粒 典例2. 为保证目的基因与载体的正向连接，在设计PCR引物时，应在引物的 （填“3'”或“5'”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据上述信息，写出上游引物的15个碱基序列：5’- -3’，下游引物的15个碱基序列：5’- -3’。 方法总结：①选酶原则：不能破坏关键结构如（ ）；最好使用 酶切（单/双）；根据目的基因 方向或模板链以及载体上的 、终止子位置明确目的基因和载体可以正向连接。 ②当需要在目的基因没有酶切位点时，可以通过PCR在目的基因左右两侧加上酶切序列，具体方法，在引物的 端添加对应酶切序列。 三、利用PCR进行定点诱变 （1） 重叠延伸PCR 原理： 典例1.下图表示利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是（ ） A.由于基因控制蛋白质的合成,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成 B.酶①应为耐高温的DNA聚合酶,引物X和Y应该为引物2和4 C.可以将引物1、引物2、引物3和引物4置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应,进而缩短实验时间 D.利用图示流程技术可以将两个不同的基因拼接到一起 典例2.（2024·天津·一模）α-环糊精是食品、医药等常用原料。α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt）生产α、β和γ环糊精的混合物，分离纯化十分不便。cgt在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和 89 位酪氨酸是酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt催化特异性提高了27倍。 (1)重叠PCR是常用的 DNA定点突变技术，其原理如图所示。与细胞内的DNA 复制相比，PCR不需要用到_______酶。要完成两处位点的突变，至少要设计________种引物。图中第1对和第2对引物的PCR产物混合、变性、退火后可形成①②两种产物，其中产物①_________（能/不能）延伸，原因是_____________________________________________。 (2)如图是该酶编码（非模板）链的部分序列，请你设计替换372位天冬氨酸到赖氨酸（仅以密码子是AAG为例）的引物 FP2和RP1________________和_________________（只写371位到373位对应的9个碱基序列，并标出5'端和3'端）。 (3)上述过程需要用到____________工程。用大肠杆菌大量生产重组cgt需要解决酶的分泌问题，主要是因为大肠杆菌缺少________________（填细胞器）。成功获得工程菌后，还须对获得的α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt） 进行活性检测，这是属于____________水平的检测与鉴定。 （2） 大引物PCR技术 原理： 典例.（2025·天津西青·一模）阅读材料，回答问题：抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。    4．将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基具体变化为（    ） A．G变为A B．G变为T C．C变为G D．C变为A 5．据图分析，  “大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择（    ） A．5′…CCTTGTAT…3 ′B．5′…CCTGGTAT…3′ C．5′…ATACCAGG…3′ D．5′…ATAACAGG…3′ 6．通过PCR3 快速扩增时应选用的引物是（    ） A．大引物和诱变引物 B．引物1和引物2 C．引物1和大引物 D．诱变引物和引物2 3、 反向PCR技术 反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。下列说法正确的是（    ） A．PCR的原理是DNA半保留复制 B．图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的方向是逆时针 C．PCR产物含有EcoRI的酶切位点 D．PCR产物最终还是环状DNA分子，包含已知序列的完整序列 典例2.反向PCR流程如图所示，该技术可利用一段已知DNA序列设计合理的引物，扩增已知序列两端的未知序列。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5’-AACTATGCGCTCATGA-……-GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列叙述错误的是（ ） A．I酶切：用一种限制酶切割DNA，以使两端未知序列形成相同的黏性末端 B．II连接：使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键 C．设计的两种引物分别是“5'-AACTATGCGCTCATGA–3’”和“5'-AGAGGCTACGCATTGC-3’” D．对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。该DNA单链序列可能为“5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'” 典例3.利用基因工程培育转基因生物已得到飞速发展，培育过程主要包括四步：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。请回答下列相关问题。 (1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的_____的基因中进行筛选， (2)目的基因可以人工合成、从基因文库中获取，还可以利用PCR技术获取和扩增。下图展示了PCR技术获取和扩增目的基因的原理，请分析回答下列问题： 将如上图一个含目的基因的DNA分子进行扩增，理论上含目的基因的等长DNA片段最早在第_____次循环后获得；第5次循环后，可扩增得到该目的基因的DNA片段_____个。 (3)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。请回答相关问题： ①EcoR I切割得到黏性末端的原因是_____。 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是_____（填“顺时针”或“逆时针”）。 4、 利用PCR检测 典例1（2025·天津红桥·一模）阅读下列材料，完成下面1-2题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 1.研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 2.为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ）    A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 典例2（2025·天津河西·一模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物—干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞总mRNA款得干扰素蛋白基因，需要在_______酶的作用下先合成相应的DNA片段。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是引导游离的核糖体转移到_______上继续肽链的合成。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是_______，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加________两种限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有4种游离的脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和_______等。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品_______最可能是插入了目的基因的重组质粒。 5、 真题演练 1.（2021·天津·高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。 (1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。 (2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下： ①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。 为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑 和 。 ②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有 ，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （能/不能）在大肠杆菌中高效表达。 ③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。 (3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。 A．进一步优化发酵条件 B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子 C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种 2.（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。 ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是 。 答案及解析 1、 DNA半保留复制 模版、4种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶 2 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 共消耗引物的数量 2 6 14 2n+1-2 产生的DNA种类 2 4 5 5 得到等长的DNA的数量 0 0 2 2n-2n 3.pH 正或负电 相反 琼脂糖凝胶电泳 大小和构象 紫外灯 典例分析【答案】4 增添 根据题干信息可知，822号水稻经过X射线处理后，产生了较高抗性的突变型乙，说明性状（抗性性状）所反映的蛋白质中的氨基酸序列发生了改变，根据电泳结果可以推测出，只有5号染色体上的第4对引物对应区间发生了碱基对的增添（突变型乙扩增产物距离点样处距离小，说明其分子量大），才会导致上述现象。 方法总结：引物之间 二、利用PCR在目的基因两侧添加限制酶识别序列 典例1 【答案】B 【详解】A、已知COX-2基因的1链为转录的模板链，根据PCR扩增引物的设计原则，引物需要与模板链的两端互补。由图可以看出，引物C与1链的3'端互补，引物B与2链的3'端互补，DNA聚合酶是从引物的3''端进行延伸的，所以应该选择引物B和C扩增COX-2基因，A错误； B、使基因准确插入质粒，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。DNA聚合酶是从引物的3'端开始延伸DNA链的，在5'端添加序列不影响DNA链的延伸，同时可以利用限制酶对引物和质粒进行切割，以便后续连接。从质粒的结构（有BamHⅠ和SacⅠ的酶切位点）以及实验目的来看，与1链结合的引物的5'端需添加限制酶BamHⅠ，与2链结合的引物的5'端需添加限制酶SacⅠ的识别序列，B正确； C、在含氨苄青霉素的培养基中能生长的是含重组质粒的菌落，也可能是空载质粒，C错误； D、根据题意，在含X-gal培养基中长出的白色菌落含重组质粒，D错误。 典例2 【答案】5' XhoI和MunI CTCGAGATGCCAATC CAATTGGTAGTCGGA 综合分析图1和图2，SalI、Nhel会破坏目的基因，EcoR I在质粒上有两个切割位点，故选择XhoI和MunI切割质粒，故目的基因两边加上XhoI和MunI的识别序列，根据转录方向为由左至右确定模板链为下链，故在目的基因左侧加XhoI序列（CTCGAG）、右侧加MunI序列（CAATTG）。所以上游引物序列为CTCGAGATGCCAATC，下游因为CAATTGGTAGTCGGA。 方法总结：①目的基因、标记基因、启动子、终止子 双 转录 启动子 5' 三、利用PCR进行定点诱变 典例1【答案】 C 【详解】A、蛋白质工程的目标是按照人们对蛋白质功能的特定需求对蛋白质的结构进行分子设计，由于基因决定蛋白质，因此对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成，A正确； B、酶①要在高温条件下催化合成DNA子链，所以酶①为耐高温的DNA聚合酶。由图可知，要得到两条链一样长且含有突变碱基的DNA分子，应选择引物2和引物4，B正确； C、由图可知，引物1和引物3存在互补配对片段，置于同一个反应系统时它们会发生结合而失去作用，C错误； D、图示的过程为重叠延伸PCR技术，可利用重叠互补引物将两个不同的基因拼接到一起，D正确。 典例2 答案】(1) 解旋 6 不能 DNA 聚合酶只能将脱氧核苷酸添加到引物的 3'端 (2) 5'-GGCAAGCCC -3' 5'-GGGCTTGCC-3' (3) 蛋白质（或蛋白质和发酵） 内质网、高尔基体 个体 【详解】（1）与细胞内的DNA复制相比，PCR利用DNA热变性原理，90℃左右的温度下，氢键断裂，双链打开，不需要用到解旋酶；要完成两处位点的突变，由图可知，完成一处突变需要两种通用引物，和两种突变引物，如果要完成两种突变，则需要两种通用引物，和四种突变引物，至少要设计6种引物；PCR扩增过程中，耐高温的DNA聚合酶只能将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，图中产物①两条链的3'端无延伸的模板。 （2）372位天冬氨酸（GAC）替换为赖氨酸AAG，则从结果看，需要将题（2）图中展示序列第372为氨基酸对应三个碱基序列变为AAG，即371位到373位对应的9个碱基序列变为5'-GGCAAGCCC-3',再根据碱基互补配对原则，结合图中显示序列的突变引物RP1应为5'-GGGCTTGCC-3'，与图中显示序列互补的模板链结合的突变引物FP2应与突变引物RP1碱基互补，应为5'-GGCAAGCCC-3'。 （3）通过对自然界存在的指导合成cgt基因进行改造，来改造现有蛋白质cgt，最终得到重组cgt，这属于蛋白质工程；大肠杆菌是原核细胞，没有内质网、高尔基体等复杂的细胞器，不能将细胞内合成的重组cgt进行加工与分泌；成功获得工程菌后，目的基因已在细胞中成功表达为cgt，最后对cgt活性进行检测属于个体水平的检测与鉴定。 （2）大引物PCR技术 典例 【答案】4. D 5.A 6.B 4．题意显示，抗菌肽第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)，则密码子发生的改变是C变成了A，即将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基具体变化为C变为A，D正确。 故选D。 5．抗菌肽第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)，则密码子发生的改变是C变成了A，相应的模板链中发生的变化是G变成了T，结合图示信息可知，抗菌肽基因中相对应的转录模板链的碱基序列为5′…CCTGGTAT…3′ 改变后相关序列应该为5′…CCTTGTAT…3′ ，据此设计的引物应该与模板链的序列相同，因此 “大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择5′…CCTTGTAT…3′ ，A正确。 故选A。 6．PCR3 的目的是获得大量的产物2，引物应该位于目标DNA的两端，因此，快速扩增时应选用的引物是引物1和引物2，B正确。 三、反向PCR 典例1 【答案】D 【解析】A、PCR是在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链,以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，是半保留复制，A正确； B、据图中未知序列的位置可知，图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A逆时针延伸子链，沿引物a顺时针延伸子链，才能扩增到未知序列，B正确； C、由于碱基互补配对，环化后的DNA分子含有EcoRI的切割位点，则PCR产物含有EcoRI的酶切位点，C正确； D、PCR产物最终还是链状DNA分子，不包含已知序列的完整序列，D错误。 故选D。 典例2 【答案】C 【解析】A、根据图示可以看出经过I酶切过程后，由于用一种限制酶切割DNA，从而使两端未知序列形成相同的黏性末端，A正确； B、II过程是将DNA片段连接起来，该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，B正确； C、设计的两种引物需要与已知序列发生碱基互补配对，而后向两侧延伸合成未知序列，因此合成的引物分别是“5'-TCATGAGCGCATAGTT–3’”和“5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3’”，C错误； D、对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列，由于F序列是未知序列，根据C项中的引物序列做出判断，该DNA单链序列可能为“5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”，D正确。 典例3 2．(1)结构和功能清晰 (2) 3 22 (3) 切割位点在识别序列中心轴两侧 逆时针 【解析】（1）在基因工程中，为提高筛选目的基因的机会和可能通常从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选，因为已知结构和功能清晰的基因更容易被研究和应用于基因工程操作。 （2）PCR扩增时，前两次循环得到的DNA片段长度不一，第三次循环后才会出现含目的基因的等长DNA片段，故最早在第3次循环后获得。PCR扩增呈指数增长，第n次循环后DNA片段数为2n，但含目的基因的等长片段数为2n-2n。第5次循环后， 25-2×5=32-10=22，故可扩增得到该目的基因的DNA片段22个。 （3）EcoRI切割的位点位于识别序列中心轴两侧，这样切割后得到的就是黏性末端。DNA两端序列未知，无法设计引物，所以不直接在图1中DNA分子的两端设计引物并进行扩增。DNA子链的延伸方向是从5'到3'，结合图3中引物A的位置，环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A逆时针延伸子链，沿引物a顺时针延伸子链，才能扩增到未知序列。 四、利用PCR检测 典例1 【答案】1．D 2．B 1．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确； B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确； C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 故选D。 2．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。 故选B。 典例2 【答案】(1) 逆转录 内质网 (2) ②④ EcoRI、XhoI 模板、含Mg2+缓冲液 (3)2 【详解】（1）利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要经过RNA变成相应的DNA逆转录过程，需要逆转录酶的作用下先合cDNA。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，指导新生的多肽链和核糖体与内质网膜结合，使蛋白质的合成和加工在粗面内质网上进行，所以其在干扰素合成中的作用是引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成。 （2）为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是②④，其他引物会导致含信号肽序列的干扰素基因的合成，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上，需要在目的基因两端添加可以与质粒酶切位点互补的限制酶识别序列，需要在目的基因的两端添加EcoRI、XhoI限制酶的序列，PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有相应的模板；原料是4种游离的脱氧核苷酸（dNTP）；耐高温的DNA聚合酶；含Mg2+缓冲液。 （3）为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，因为一个切割位点只会将环状的质粒切割成一条线性的DNA，有两个切割位点才能切成2条片段，根据题图分析EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500bp和5800bp的两个片段，所以样品2最可能是插入了目的基因的重组质粒。 五、真题演练 1.【答案】(1)细胞质基质 (2) 包含BamHI的识别序列 将GTG改为ATG 原核生物复制原点 不能 缺失尿嘧啶 (3)B 【详解】（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。 （2）①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHI的识别序列。 ②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。 ③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。 （3）A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确； B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误； C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确； D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。 故选B。 2.【答案】(1) 1 4 5＇ (2)XhoⅠ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR 【详解】（1）据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR（卡那霉素抗性基因），需要引物1和4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此在引物的5'端引入XhoⅠ酶识别序列。 （2）据图可知，载体4中RpsL（链霉素敏感基因）的两侧具有XhoⅠ酶识别序列，载体3中不含XhoⅠ酶识别序列，如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4时，需要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。 （3）基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5中含有RpsL（链霉素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。 （4）据题意可知，载体5导入的是链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌中P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B正确，ACD错误。 故选B。 （5）通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA，因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。 1 学科网（北京）股份有限公司 $