第3章 第1节 第3课时 基因工程的基本操作程序-【新课程学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程教师用书word（苏教版）

本讲义聚焦基因工程基本操作程序核心知识点，系统梳理目的基因获取（化学合成、基因文库、PCR）、DNA粗提取鉴定（原理与步骤）、表达载体构建（组成与限制酶选择）、目的基因导入（植物、动物、微生物方法）及检测鉴定（分子与个体水平）的完整知识链，搭建从原理到操作的学习支架。 该资料通过对比表格（如cDNA与基因组文库）、实验流程图等可视化工具，培养科学思维中的比较归纳能力。DNA粗提取实验细节（材料选择、试剂作用）指导规范操作，落实探究实践；例题与分层训练（概念澄清、知能落实、迁移应用）帮助学生巩固知识，课中辅助教师清晰授课，课后助力学生查漏补缺，提升解决实际问题的态度责任。

第3课时 基因工程的基本操作程序 学习目标 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。　　 2.概述DNA的粗提取和鉴定的原理及过程。 知识点(一)　目的基因的获取及DNA的粗提取和鉴定 [教材知识梳理] (一)基因工程的基本操作程序 包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞,以及目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 (二)目的基因的获取 1.通过化学合成法直接人工合成目的基因:对于比较小的目的基因,在明确脱氧核苷酸序列后,可以通过DNA合成仪直接人工合成;全基因或较大基因常使用半合成的方法,该方法主要用到的酶有Klenow酶和DNA连接酶等。 2.通过基因文库获取目的基因:基因文库分为基因组文库和cDNA文库。从基因组文库中筛选目的基因,一般采用核酸探针杂交的方法。 3.从细胞中直接提取DNA或RNA的基本过程:首先裂解细胞使核酸分子释放出来,然后从释放出来的细胞成分中分离核酸分子,最后纯化获得核酸分子。 (三)DNA的粗提取和鉴定的原理 1.DNA不溶于乙醇,但某些蛋白质溶于乙醇。 　　2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。 　　3.在沸水浴加热条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 [核心要点点拨] 　　(一)cDNA文库与基因组文库的区别 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间的基因交流 可以 部分基因可以 　　(二)几种获取目的基因方法的比较 方 法 从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 基因组文库 cDNA文库 过程 供体细胞 中的DNA 许多DNA 片段 构建表达 载体 受体细胞 (基因组文库) 目的基因 目的基因 的mRNA 单链DNA 双链DNA 载体 受体细胞 (cDNA文库) 目的基因 目的基因 单链DNA 引物结合 到互补 DNA链 大量目的 基因 蛋白质的 氨基酸 序列 mRNA的 核苷酸 序列 目的基因 的核苷酸 序列 目的基因 优点 操作比 较简单 具有专一性 可在短时间内大量扩增目的基因 专一性强,可产生自然界中不存在的新基因 缺点 工作量大、盲目性大、专一性差 操作过程较麻烦,技术要求过高 需要严格控制温度,技术要求高 适用范 围较小 　　(三)DNA的粗提取实验步骤及注意事项 　　1.实验步骤 　　2.实验注意事项点 (1)一般选取鸡血来提取DNA,因为鸡血中血细胞含量高,DNA含量丰富,材料易得,细胞易吸水涨破。也可以选用植物细胞如洋葱等,只是破碎植物细胞比较麻烦,提取洋葱DNA时,需先将洋葱切碎,然后加入一定量的洗涤剂和食盐,进行充分搅拌和研磨,过滤后收集研磨液。 (2)该实验中不能选用猪血等哺乳动物的血,因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和各种细胞器。 (3)过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布,否则会因DNA被吸附到滤纸上,而导致DNA大量损失。 (4)用玻璃棒搅拌时,动作要缓慢且沿同一方向进行,目的是防止DNA被破坏,但细胞破裂时应快速搅拌。 (5)二苯胺试剂是利用二苯胺、冰醋酸、浓硫酸配制的,要现配现用,否则二苯胺会变成浅蓝色,影响鉴定效果。 (6)在鸡血中加入柠檬酸钠防止血液凝固。 (7)提取含有杂质较少的DNA时,应加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液,因为DNA不溶于乙醇,细胞中某些蛋白质可溶于乙醇,进一步提纯DNA,且冷却的乙醇可以防止DNA降解,易形成沉淀,增加DNA的柔韧性,减少断裂。 [例1]　(2025·扬州期末)下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析,下列叙述正确的是 (　　) A.过程①所需的原料是核糖核苷酸 B.过程②所需的酶必须耐高温 C.过程③需要解旋酶破坏氢键 D.过程④的引物对之间不能互补配对 [解析]　过程①为逆转录,所需的原料是脱氧核苷酸,A错误;由DNA单链合成DNA双链的过程中所需要的DNA聚合酶不需要耐高温,B错误;过程③为变性,温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链,不需要解旋酶破坏氢键,C错误;过程④为复性,温度降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,但引物对之间不能互补配对,D正确。 [答案]　D [例2]　(2025·南京月考)下表关于“DNA的粗提取和鉴定”实验的表述,错误的是 (　　) 选项 试剂 操作 作用 A 研磨液 与生物材料混合 提取 溶解DNA B 2 mol·L-1 NaCl溶液 与提取出的 DNA混合 溶解DNA C 预冷的酒精 加入离心后 的上清液中 溶解DNA D 二苯胺试剂 加入溶解有 DNA的NaCl 溶液中 鉴定DNA 　　[解析]　向离心后的上清液中加入预冷酒精的作用是溶解杂质和析出DNA,C错误。 [答案]　C [层级训练评价] (一)澄清概念 1.判断下列叙述的正误 (1)对于核苷酸序列已知且比较小的基因可通过化学合成法直接人工合成。 (√) (2)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5'端补平的DNA聚合酶。 (√) (3)一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因。 (√) (4)cDNA文库含有该生物的所有基因。 (×) (5)在DNA提取液中加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液,可以使DNA析出。 (√) (6)DNA溶液中加入二苯胺试剂就会变蓝色。 (×) (二)落实知能 2.(2025·苏州月考)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是 (　　) A.增加模板DNA的量 　B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 　D.提高复性的温度 解析:选D　PCR过程中,引物和模板不完全配对会形成非特异条带,增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生,A错误;延长热变性的时间,有利于双链DNA解聚为单链,不能减少反应中非特异条带的产生,B错误;延长延伸的时间,有利于合成新的DNA链,但不能减少反应中非特异条带的产生,C错误;在一定温度范围内,选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合,从而减少非特异条带的产生,D正确。 3.基因工程操作中,需要筛选和获取目的基因。下列关于目的基因的说法,不正确的是 (　　) A.目的基因可以通过人工合成获取 B.目的基因都有自我复制能力 C.可在基因文库中寻找目的基因 D.目的基因是指用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因 解析:选B　若基因比较小,核苷酸序列又已知,可以通过化学合成法直接人工合成目的基因,A正确;目的基因没有自我复制能力,目的基因与载体结合后才可以复制,B错误;可以根据相应的表达产物,从基因文库中寻找目的基因,C正确;基因工程是按照人们的目的定向改造生物的性状,目的基因是指用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,D正确。 4.“SDS法”是提取DNA的常用方法,其提取液成分中的SDS能使蛋白质变性,EDTA是DNA酶抑制剂,Tris作为缓冲剂。下列说法错误的是 (　　) A.SDS能破坏蛋白质空间结构,从而促进DNA和蛋白质分离 B.EDTA能减少DNA水解,提高DNA的完整性 C.Tris作为缓冲剂能维持pH的稳定,保证DNA结构正常 D.提取到的DNA可在常温下用二苯胺试剂进行鉴定 解析:选D　由题干可知,SDS能使蛋白质变性,破坏蛋白质空间结构,从而促进DNA和蛋白质分离,A正确;EDTA是DNA酶抑制剂,能减少DNA水解,提高DNA的完整性和总量,B正确;Tris作为缓冲剂能维持pH的稳定,可以防止DNA结构被破坏,保证DNA结构正常,C正确;鉴定DNA的方法是沸水浴条件下用二苯胺试剂鉴定,D错误。 (三)迁移应用 5.In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常为15~20 bp),然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为①利用PCR技术将质粒线性化;②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因;③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶作用下形成重组质粒;④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题。 (1)过程①需要用到的酶是　　　　。过程③中,同源序列1、2中的碱基序列不同,这样设计的好处是 　。  (2)为保证扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因,引物A或引物B要依据　　　　　　　　序列进行设计。过程②经过　　　　轮循环即可初步得到符合要求的目的基因片段。  (3)若目的基因是氨苄青霉素抗性基因,以大肠杆菌作为受体细胞。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果,在含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的培养基上分别接种等量的已转化大肠杆菌并培养相同时间,然后采用 　　　　　　　法进行计数,若结果较真实值偏小,原因是　　　　　　　。  (4)与传统构建重组质粒的方法相比,In-Fusion技术的优势有　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  解析:(1)过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程,该过程属于PCR技术的应用,故需要Taq酶;过程③是基因表达载体的构建过程,该过程中,同源序列1、2中的碱基序列不同,这样设计的好处是防止目的基因反向连接,防止线性化质粒或目的基因的自身环化,以保证目的基因能够正确连接并表达。 (2)目的基因经引物A和引物B扩增后需要与线性化质粒连接,故为保证扩增出所需的目的基因,引物A或引物B要依据目的基因和质粒序列进行设计;根据DNA的半保留复制的特点可知,PCR前两轮循环产生的4个DNA分子的两条链均不等长,第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链,即仅含引物之间的序列,因此,至少经过3轮循环可得到符合要求的目的基因片段。 (3)能对微生物进行计数的方法有显微镜计数法和稀释涂布平板法(用于活菌计数);在用稀释涂布平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,在平板上观察到的是一个菌落,导致结果较真实值偏小。 (4)对比传统构建重组质粒,In-Fusion技术的优势有不受限制酶酶切位点的限制,可以把目的基因插入任何位点;避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等。 答案:(1)热稳定的DNA聚合酶(或Taq酶)　防止目的基因反向连接,防止线性化质粒或目的基因自身环化　(2)目的基因与质粒　3　(3)稀释涂布平板　两个或多个细胞连在一起,在平板上观察到的是一个菌落　(4)不受限制酶酶切位点的限制,可以把目的基因插入任何位点;避免限制酶切割对质粒功能区的破坏(答案合理即可) 知识点(二)　基因表达载体的构建、目的基因的导入及其表达产物的检测鉴定 [教材知识梳理] 　　(一)基因表达载体的构建 1.基因表达载体构建的目的 (1)使目的基因进入受体细胞并有效表达。 (2)使目的基因能稳定存在且遗传给后代。 2.基因表达载体的组成 (二)目的基因导入不同细胞的方法 项目 植物细胞 哺乳动物细胞 微生物细胞 常用 方法 农杆菌转化法 显微注射法 感受态细胞法 (Ca2+处理法) 受体 细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化 过程 目的基因插到农杆菌Ti质粒的T-DNA特定区段上→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→目的基因稳定遗传和表达 目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组的基因表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子→培养基培养转化后的细胞并筛选→获得带有目的基因的微生物 　　(三)目的基因及其表达产物的检测鉴定 检测 水平 检测 对象 检测内容 检测方法 结果 显示 分子水平的检测 DNA 检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因 DNA分子杂交法(基因探针+待测的DNA) 是否显示 出杂交带 mRNA 检测目的基因是否转录 分子杂交法(基因探针+待测转基因生物的mRNA) 蛋白质 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗原—抗体杂交法 个体水 平的检 测　　 性状 包括抗虫、抗病的接种试验,抗冻的耐寒试验,以确定是否有抗性及抗性程度 [核心要点点拨] 　　(一)图示法理解基因表达载体的构建过程 1.用同一种限制酶或产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA和质粒,使其产生相同末端。 2.将切下的目的基因片段与切开的质粒混合,再加入适量DNA连接酶,使目的基因插入质粒的切口处,形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示: 　　(二)关于农杆菌转化法的几个易错点 两次 拼接 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上;第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上 两次 导入 第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌;第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞 　　(三)图示法理解目的基因的检测与鉴定方法 　　[例1]　(2025·南京高二期末)[多选]某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析正确的是 (　　) A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒,可得到2条DNA片段 B.不能用限制酶AluⅠ切割质粒和外源DNA的原因是限制酶AluⅠ会破坏目的基因 C.构建重组DNA时,需选择限制酶SmaⅠ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA D.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长 [解析]　限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点,用HindⅢ和PstⅠ切割质粒,可得到2条DNA片段,A正确;AluⅠ的切割位点位于目的基因中,用限制酶AluⅠ切割外源DNA会破坏目的基因,B正确;不宜选择限制酶SmaⅠ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA,因为质粒中的两个标记基因均会被破坏,且DNA会反向连接至载体上,C错误;构建重组DNA时,应选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA,此时会破坏质粒中的氯霉素抗性基因,保留四环素抗性基因,所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长,D正确。 [答案]　ABD [方法规律] 构建基因表达载体时限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 　　[例2]　(2025·无锡高二期末)下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时,从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中,与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是 (　　) A.图中Ⅰ是质粒,步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒,步骤②是将重组质粒导入棉花细胞 C.图中Ⅲ是农杆菌,通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 [解析]　图中Ⅰ为质粒,步骤①为基因表达载体的构建,需要用到限制酶和DNA连接酶,A正确;图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌,再通过步骤③将目的基因导入植物细胞,B错误,C正确;基因的表达具有一定的独立性,剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达,D正确。 [答案]　B [归纳拓展] 受体细胞选择的几个注意点 　　要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌);一般不用支原体,原因是它营寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟的红细胞,原因是它无细胞核和各种细胞器,不能合成蛋白质。 [层级训练评价] (一)澄清概念 1.判断下列叙述的正误 (1)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。 (×) (2)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵作为受体细胞。 (×) (3)细菌Ti质粒上的T-DNA可转移到植物细胞内,并且与其染色体DNA整合在一起。 (√) (4)标记基因不一定是抗生素抗性基因。 (√) (5)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。 (√) (6)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交法。 (√) (二)落实知能 2.下列是某学习小组关于基因工程的基本操作程序的说法,正确的是 (　　) A.利用PCR技术获得目的基因需要提供的酶有解旋酶、DNA聚合酶等 B.基因表达载体构建必须在细胞内进行,必须包括启动子、终止子、标记基因 C.常用显微注射法将目的基因导入哺乳动物细胞 D.将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上就可以直接导入植物细胞 解析:选C　利用PCR技术获得目的基因不需要解旋酶,A错误;基因表达载体构建在体外进行,必须包括启动子、终止子、标记基因、目的基因、复制原点等,B错误;当受体细胞是哺乳动物细胞时,常用显微注射法将目的基因导入受体细胞,C正确;将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上后,将含有目的基因的Ti质粒导入到农杆菌中,再由农杆菌导入植物细胞,不是直接导入,D错误。 3.(2025·常州月考)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述,错误的是 (　　) A.用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌,以改变大肠杆菌细胞的生理状态 B.将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法 C.对于动物来说,受体细胞一般是受精卵 D.通过基因工程大量获得胰岛素时,受体细胞选择酵母菌比大肠杆菌更有优势 解析:选B　将目的基因转入动物细胞常用显微注射法,将目的基因转入微生物细胞常用Ca2+处理法,B错误。 4.下图是利用生物工程技术培育转荧光蛋白基因克隆猪的过程。下列叙述正确的是 (　　) A.①②过程都属于基因工程的范畴 B.③过程常用显微注射法,注射前需先用Ca2+处理重组细胞 C.④过程需要用到动物细胞融合技术 D.⑤过程的受体雌猪的遗传物质不会影响克隆猪的性状表达 解析:选D　结合题干分析可知,①过程属于细胞工程的范畴,②过程属于基因工程的范畴,A错误;③表示将目的基因(重组质粒)导入受体细胞(哺乳动物细胞),常用显微注射法,但是注射前不需要用Ca2+处理重组细胞,B错误;④过程表示早期胚胎培养,不需要利用动物细胞融合技术,C错误;⑤过程的受体雌猪的遗传物质不会影响克隆猪的性状表达,D正确。 (三)迁移应用 5.接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。 (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是　　　　　　。  (3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取　　　　　 进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。　　　　　。  解析:(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原,由于不含乙肝病毒的遗传物质,故接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒。 (2)抗生素抗性基因为标记基因,其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。 (3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,可采用DNA分子杂交技术,即将酵母细胞中的基因组DNA提取出来,在含有乙肝病毒表面抗原基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,就表明目的基因已插入染色体DNA中。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,应从转基因酵母菌中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因在酵母细胞中表达出目的蛋白。 答案:(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原,由于不含乙肝病毒的遗传物质,接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒　(2)鉴别受体细胞(酵母菌)中是否含有目的基因(乙肝病毒表面抗原基因),从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来　RNA聚合酶　(3)基因组DNA　用放射性同位素等标记的含有乙肝病毒表面抗原基因的DNA片段　(4)从转基因酵母菌中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,观察是否有杂交带出现 /课堂小结与随堂训练/ 一、知识体系构建 二、关键语句必背 1.在沸水浴加热条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 2.目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。转化的关键是目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。 3.标记基因的作用——初步筛选、检测目的基因是否导入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。 4.受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。 三、素养好题训练 1.随着科学技术的发展,人们可以从基因文库中获取目的基因,下表为两种基因文库的比较,表中①②③④依次是 (　　) 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 ① ② 基因多少 部分基因 全部基因 物种间的基因交流 ③ ④ A.有;无;可以;部分基因可以 B.无;有;可以;部分基因可以 C.无;有;部分基因可以;可以 D.有;无;部分基因可以;可以 解析:选B　cDNA文库中的基因无内含子,基因组文库中的基因有内含子;cDNA文库中的基因可以进行物种间的基因交流,基因组文库中部分基因可以进行物种间的基因交流,B符合题意。 2.(2025·镇江月考)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后,拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上,静置一段时间,质粒分布在上清液中,利用上述原理可初步获得质粒DNA。用限制酶Ⅰ和Ⅱ处理提取的产物,电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述正确的是 (　　) A.提取DNA时可加入乙醇,使溶于乙醇的蛋白质等物质析出 B.将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后,可直接用二苯胺试剂进行鉴定 C.用限制酶Ⅰ和Ⅱ处理提取产物的电泳结果说明未提取到质粒 D.溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁,洗涤剂能瓦解其细胞质膜,但对DNA没有影响 解析:选D　DNA在冷乙醇中溶解度很低,提取DNA时可加入乙醇,是为了让DNA析出,A错误;将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后,可用二苯胺试剂在沸水浴加热条件下进行鉴定,B错误;限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ处理提取的产物,只得到一条带,说明提取物是环状DNA,即提取物为质粒,C错误;溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁,洗涤剂能瓦解其细胞质膜,但对DNA没有影响,常用于使细胞破碎,D正确。 3.(2025·连云港期末)[多选]无缝克隆技术(In-Fusion技术)是一种先进的DNA重组技术,用于将目标DNA片段插入载体中。其中In-Fusion酶可以连接任何具有相同15 bp(bp为碱基对)末端序列的线性DNA分子,过程如图所示。下列关于该技术的叙述正确的是 (　　) A.推测In-Fusion酶可替代限制酶和DNA连接酶用于构建重组载体 B.PCR扩增目的基因时,需在引物5'端添加与载体相同的特定序列 C.利用In-Fusion技术构建图示重组载体时,可避免目的基因与载体的反向连接 D.当目的基因内部有多种限制酶识别序列时,该方法将无法使用 解析:选ABC　根据题意,In-Fusion酶可以替代限制酶和DNA连接酶,用于构建基因表达载体,A正确;根据题意“In-Fusion酶可以连接任何具有相同15 bp末端序列的线性DNA分子”,因此PCR扩增目的基因时,需在引物5'端添加与载体相同的特定序列,以便于In-Fusion酶的连接,B正确;通过在目的基因与线性载体两端连入不同的15 bp末端序列,可实现目的基因的定向插入,从而避免目的基因与载体的反向连接,C正确;当目的基因内部有多种限制酶识别序列时,将无法使用限制酶构建重组载体,但可设计15 bp末端序列,使用In-Fusion酶来构建,D错误。 4.虫草中的超氧化物歧化酶(PSSOD)具有抗衰老作用。研究人员培育了能合成PSSOD的转基因酵母菌。据图回答下列问题: (1)基因工程基本操作程序的核心步骤是　　　　　　　　　　　。将图中的重组DNA分子用HindⅢ和ApaLⅠ完全酶切后,可得到　　　种DNA片段。图示的表达载体存在氨苄青霉素抗性基因,不能导入用于食品生产的酵母菌中,据图分析,可用　　　　切除该抗性基因的部分片段使其失效,再用DNA连接酶使表达载体重新连接起来。  (2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因,必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活,因此,图示表达载体上的URA3基因可作为　　　　　　,供鉴定和选择;为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌,所使用的培养基 　　　　(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶。  (3)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为　　　　　;为了确定受体细胞中PSSOD基因是否转录,可用标记的　　　　　　作为探针进行分子杂交试验,分子杂交的原理是　　　。  解析:(1)基因工程基本操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。分析题图可知,图中的重组DNA分子中存在Hind Ⅲ的一个酶切位点,存在ApaL Ⅰ的两个酶切位点,因此用两种酶同时切割环状质粒,会得到3种不同的DNA片段。图示的表达载体存在氨苄青霉素抗性基因,不能导入用于食品生产的酵母菌中,否则会导致人体对抗生素不敏感,因此可以利用ApaL Ⅰ切除该抗性基因的部分片段使其失效,再用DNA连接酶使表达载体重新连接起来。 (2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因,必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活,因此,图示表达载体上的URA3基因可作为标记基因,供鉴定和选择;由于导入表达载体的酵母菌中含有URA3基因,而普通酵母菌中不含有URA3基因,因此为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌,所使用的培养基不需要添加尿嘧啶。 (3)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。为了确定受体细胞中PSSOD基因是否转录,可用标记的PSSOD基因作为探针进行分子杂交检测,分子杂交的原理是碱基互补配对。 答案:(1)基因表达载体的构建　3　ApaLⅠ (2)标记基因　不需要　(3)转化　PSSOD基因　碱基互补配对 学科网（北京）股份有限公司 $