第3章 第1节 第2课时 利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定-【新课程学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程教师用书word（苏教版）

本高中生物学讲义聚焦PCR技术扩增DNA片段及电泳鉴定核心知识点，系统梳理PCR的原理（DNA半保留复制）、条件（模板DNA、引物等）、过程（变性-退火-延伸循环）及应用，衔接电泳鉴定实验操作，通过对比表格、图示解析、典例分析及分层训练构建学习支架。 该资料特色在于理论与实践融合，以PCR与体内DNA复制对比培养科学思维，实验步骤（如试剂添加顺序）和电泳结果分析强化探究实践，典例及高考题提升应用能力，分层训练助学生查漏补缺，课中辅助教学，课后便于回顾，实验注意事项培养严谨科学态度。

第2课时 利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 学习目标 1.简述PCR的原理、条件及过程。　　 2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。 知识点(一)　聚合酶链式反应(PCR)技术 [教材知识梳理] (一)PCR的含义及反应条件 含义 PCR是聚合酶链式反应的缩写,是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术 原理 DNA半保留复制 条件 模板DNA、引物对、4种dNTP(能量和原料)、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2+等 　　(二)PCR的反应步骤和结果 1.PCR反应的一般步骤 (1)变性:在约94 ℃高温下,作为模板的双链DNA解旋(变性)为两条单链DNA。 (2)退火:反应体系的温度降至约55 ℃,2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。 (3)延伸:反应体系的温度回升到约72 ℃(Taq酶催化作用的最适反应温度),4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则,在Taq酶的作用下连接到引物3'端之后,使引物链延伸,并形成互补的DNA双链。 　　(4)重复循环多次。 2.PCR的结果:理论上,每经过一个循环,样本中DNA片段的数量增加一倍,经过n个循环后,DNA片段数量可以扩增至原先的2n倍。 (三)PCR技术的应用 1.广泛应用于医学及分子生物学等领域,如:病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。 2.在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。 [核心要点点拨] 　　(一)图示法理解PCR反应过程 　　(二)PCR技术与生物体内DNA复制的比较 比较项目 PCR 细胞核内DNA复制 区别 场所 试管中 细胞内 方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制 起始位点 引物3'端 复制起始位点 酶 仅一种DNA聚合酶(Taq酶) 多种酶(DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等) 反应条件 温度变幅大 温和 解旋 高温解旋 解旋酶解旋 引物 DNA片段,保留在复制的子链中 RNA片段,不保留在复制的子链中 产物 引物界定的片段 核基因组 循环次数 人为设置 与细胞分裂同步 联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成; ②原料:均为四种脱氧核苷酸; ③酶:均需要DNA聚合酶进行催化; ④引物:均需要引物,使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 　　(三)与引物相关的问题分析 1.PCR技术需要引物的原因 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3'端延伸DNA链,因此,DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3'端开始延伸DNA链,因此DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。 2.PCR扩增中需要引物数目的计算规律 若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环,理论上需要消耗引物数为2n+1-2个,第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。 3.关于引物设计应注意的问题 依据目的基因两端的部分核苷酸序列设计。两种引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对。有时候引物5'端需要含有某种限制酶的识别序列。 　　[典例]　(2025·南京期末)科研人员利用PCR技术扩增X基因片段,需加入两种引物,引物结合位置如图甲所示。PCR循环后产生五种DNA分子,如图乙所示。下列叙述正确的是 (　　) A.利用DNA聚合酶和DNA连接酶才能完成PCR扩增过程 B.如果加入大量引物1和引物2,会干扰正常的PCR扩增过程 C.在第四轮复制后,会出现8个⑤片段 D.经过第二轮PCR后会出现①②③④⑤五种DNA分子 [解析]　PCR扩增过程中不需要DNA连接酶,A错误。由图甲可知,利用PCR技术扩增X基因片段需要引物1和引物2,加入大量引物1和引物2,不会干扰正常的PCR扩增过程,B错误。若图乙表示第三轮复制的产物,则①②各有1个,③④⑤各有2个,第四次复制将得到16个DNA分子:①复制得①和③,②复制得②和④,2个③复制得2个③和2个⑤,2个④复制得2个④和2个⑤,2个⑤复制得4个⑤,C正确。第一轮PCR后得到2个两种DNA分子:①和②;第二轮PCR后得到4个四种DNA分子:①复制得①和③,②复制得②和④,所以经过第二轮PCR后会出现①②③④四种DNA分子,D错误。 [答案]　C 　　[归纳拓展]　PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 同时含两种引物的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗引物的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n [层级训练评价] (一)澄清概念 1.判断下列叙述的正误 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。 (×) (2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 (√) (3)PCR技术中,DNA模板链上碱基G和C的比例越高,DNA变性解链的温度就越高。 (√) (二)落实知能 2.下列有关细胞内DNA的复制与PCR的叙述,错误的是 (　　) A.都需要以亲代DNA的两条链分别作为模板 B.都需要DNA聚合酶和解旋酶进行催化 C.都需要四种脱氧核苷酸作为原料 D.都遵循相同的碱基互补配对方式 解析:选B　PCR是一项根据细胞内DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。细胞内DNA的复制与PCR都需要以亲代DNA的两条链分别作为模板,A正确;细胞内DNA的复制需要DNA聚合酶和解旋酶,PCR需要热稳定的DNA聚合酶,但不需要解旋酶,B错误;DNA的基本单位是脱氧核苷酸,细胞内DNA的复制与PCR都是为了合成DNA,故都需要四种脱氧核苷酸作为原料,C正确;DNA结构遵循碱基互补配对原则,故细胞内DNA的复制与PCR都遵循相同的碱基互补配对方式,D正确。 3.(2025·南京月考)PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键,5'端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列,dNTP是DNA合成的原料,还可供能。下列相关说法错误的是 (　　) A.图示环节所需的温度比上一个环节的低 B.设计引物时,要有一段目的基因的已知核苷酸序列 C.热稳定的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链 D.1个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同 解析:选D　图示环节为引物与模板碱基互补配对,表示的是复性环节,复性的上一环节为变性,复性的温度比变性的温度低,A正确;设计引物时,要有一段目的基因的已知核苷酸序列,保证其与已知模板能碱基互补配对,在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸,B正确;子链是从5'端向3'端延伸的,热稳定的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链,C正确;由于两个引物均不在该片段的端点,因此一个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不一定相同,D错误。 (三)迁移应用 4.导致流感的病原体是一种单链RNA病毒。PCR是一项在生物体外能快速扩增DNA片段的技术。如图为流感病毒核酸检测的部分过程,图中引物是能与模板DNA碱基互补配对的单链DNA片段,是子链合成延伸的基础,DNA复制后将成为新合成子链的一部分。 (1)据图分析,核酸检测时首先以　　　　　　　为模板,以　　　　　　为原料合成杂交双链,将杂交双链用核酸酶H处理的目的是　　　　　　　　　　　　　。  (2)图中变性过程是将DNA双链间的　　　　　破坏,方法是用约94 ℃高温,该过程相当于体内DNA复制中的　　　　　　。退火过程需要降低反应体系的温度,目的是使引物与DNA模板链结合,该温度的高低与引物分子中含有的(A+T)/(G+C)有关,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (3)利用1个双链DNA分子完成35轮循环共需要　　　　　　个引物分子。  解析:(1)据图分析,核酸检测时首先以病毒RNA(或RNA单链)为模板,以脱氧核苷酸为原料合成杂交双链,将杂交双链用核酸酶H处理的目的是将杂交双链中的RNA单链水解,得到DNA单链。 (2)图中变性过程是将DNA双链间的氢键破坏,使双链分开,方法是用约94 ℃高温,该过程相当于体内DNA复制中的解旋。退火过程需要降低反应体系的温度,目的是使引物与DNA模板链结合,该温度的高低与引物分子中含有的(A+T)/(G+C)有关,是因为引物与DNA模板链之间通过形成氢键结合,碱基对A—T之间可形成2个氢键,碱基对G—C之间可形成3个氢键,所以(A+T)/(G+C)越高,退火需要的温度越低。 (3)利用1个双链DNA分子完成35轮循环共合成235个DNA分子,有236条单链,最初的两条链不需要引物,故需要236-2个引物分子。 答案:(1)病毒RNA(或RNA单链)　脱氧核苷酸　将杂交双链中的RNA单链水解,得到DNA单链　(2)氢键　解旋　引物与DNA模板链之间通过形成氢键结合,碱基对A—T之间可形成2个氢键,碱基对G—C之间可形成3个氢键,所以(A+T)/(G+C)越高,退火需要的温度越低　(3)236-2 　知识点(二)　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定　　　　　　　 [教材知识梳理] 　　(一)实验目的 1.尝试运用PCR仪扩增DNA片段。 2.关注PCR技术的应用。 3.学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术。 (二)实验原理 1.扩增DNA片段的过程包括变性、退火和延伸等步骤的多次循环。 2.理论上,每经过一个循环,样本中DNA片段的数量增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过n个循环后,DNA片段数量可扩增至原来的　2n　倍。  3.PCR反应体系包括:DNA模板、反应缓冲液、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的DNA引物对、Taq酶等。 4.在不同阶段,还需要控制PCR仪反应系统的不同温度。 (三)实验步骤 1.PCR扩增目的基因 (1)配制反应体系。 (2)按程序进行扩增。 2.电泳分析 电泳 进行此实验需要配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶液(1×TAE)、50 μL PCR扩增产物和6 μL凝胶加样缓冲液等试剂,操作时维持恒压80 V 1.5~2 h 电泳 鉴定 采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录电泳结果 　　(四)实验注意事项 1.微量取液器不能超量程使用。使用一次性屏蔽式吸液枪头有助于防止吸取的液体流入微量取液器,从而减少实验过程中的交叉污染。 2.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的PCR管、枪头和双蒸水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 　　3.为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性,要按照加入体积的大小,由大到小依次加入各试剂,即最先加入双蒸水。为保护酶的活性,一般最后加入Taq酶。 4.在向PCR管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,取液器上的枪头都必须更换。 [核心要点点拨] 　　(一)图示法理解PCR扩增及电泳分析的实验步骤 1.PCR扩增目的基因AKP 2.电泳分析 　　(二)PCR扩增中扩增条带异常的原因分析 未出现 扩增条带 ①Taq酶失活;②引物出现质量问题;③Mg2+浓度过低;④变性时的温度低,变性时间短 出现非特异 性扩增条带 ①模板DNA出现污染;②引物特异性不强或形成引物二聚体;③Mg2+浓度过高;④退火时的温度过低等 [典例]　(2025·启东高二阶段测)PCR产物常用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,下列与PCR和琼脂糖凝胶电泳有关叙述错误的是 (　　) A.利用PCR扩增目的基因时,需要已有的目的基因作模板 B.需将扩增得到的PCR产物与内含指示剂的电泳缓冲液混合后加样 C.PCR使用的缓冲液和酶应分装后冷冻保存,使用前取出并缓慢融化 D.琼脂糖溶液中加入的核酸染料利于DNA在紫外灯下被检测 [解析]　利用PCR扩增目的基因时,需要已有的目的基因作模板,A正确;加样时需将扩增得到的PCR产物与内含指示剂的凝胶加样缓冲液混合,B错误;PCR所用缓冲液和酶应分装成小份后冷冻保存,使用前应放在冰块上缓慢融化,这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分,同样保护酶的活性不被破坏,C正确;DNA分子的大小和构象等有关,凝胶中的DNA分子通过染色,可以在紫外灯下被检测出来,D正确。 [答案]　B [层级训练评价] (一)澄清概念 1.判断下列叙述的正误 (1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中,细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段,并且不保留在子链中。 (√) (2)DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率。 (√) (3)利用PCR扩增DNA片段时,在第一轮循环的变性之前,通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性。 (√) (4)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。 (×) (二)落实知能 2.关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的描述中,不正确的是 (　　) A.PCR过程需要Taq酶 B.PCR过程需要DNA连接酶 C.PCR扩增区域由2种引物来决定 D.不同大小的DNA在电场中迁移速率不同 解析:选B　PCR反应需要高温使DNA变性解旋,所以复制过程中要用热稳定的DNA聚合酶(Taq酶),A正确;PCR过程中用热稳定的DNA聚合酶来催化脱氧核苷酸的聚合,不需要DNA连接酶,B错误;PCR过程中DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从引物的3'端延伸DNA链,因此PCR扩增区域由2种引物来决定,C正确;不同大小的DNA在电场中的迁移速率不同,因此可通过电泳的方法检测扩增产物,D正确。 3.(2025·淮安月考)[多选]为优化目的基因(700 bp)的PCR条件,研究者设计不同的复性温度进行实验,产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。据图分析,下列表述正确的是 (　　) A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板DNA,其他成分相同 B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关 C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 解析:选ACD　实验设计应遵循对照原则与单一变量原则,故对照组可用无菌蒸馏水代替模板DNA,其他成分相同,A正确;PCR技术中,反应最终的电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA含量呈正相关,B错误;PCR扩增时,温度会影响PCR扩增产物的纯度,故复性温度的设定是成败的关键,C正确;据图可知,58 ℃条件下条带最宽,即PCR扩增产物中目的基因含量最多,故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度,D正确。 (三)迁移应用 4.[多选]免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图:首先将抗体1固定在微板上,冲洗后加入待检的牛乳,再加入DNA标记的抗体2,进行PCR扩增,最后进行电泳检测,相关叙述错误的是 (　　) A.抗体1和抗体2是由同一种浆细胞分泌的两种不同抗体 B.如果第三次冲洗不充分则有可能出现假阳性现象 C.图示中的DNA是牛乳基因中的DNA片段 D.PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈负相关 解析:选ACD　每一种浆细胞只分泌一种抗体,则抗体1和抗体2是由不同种浆细胞分泌的两种不同抗体,A错误;免疫PCR利用的是PCR技术扩增“固定抗体1—抗生素—抗体2”上连接的DNA,如果第三次冲洗不充分,可能使残留的、呈游离状态的抗体2上的DNA也作为PCR的模板参与扩增,会出现假阳性现象,B正确;待检测的牛乳中可能含有牛乳腺细胞的DNA(其上含有牛乳基因的DNA片段),若图示中的DNA用牛乳基因中的DNA片段,经过PCR扩增后的产物中,不仅有抗体2上的DNA扩增产物,还可能有牛乳中本身含有的牛乳基因片段的扩增产物,使检测结果偏大,C错误;免疫PCR是通过PCR技术扩增抗体2上连接的DNA,最后通过检测扩增产物——DNA的量来确定抗生素的量的方法。因此,PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关,D错误。 5.流感病毒是RNA病毒。检测流感病毒特异序列的方法常见的是荧光定量PCR。由于PCR反应模板仅为DNA,因此在进行PCR反应前,首先合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。在PCR反应体系中,包含一对特异性引物以及一个Taqman探针,该探针为一种寡核苷酸链,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 (1)检测流感病毒的过程中,反应体系中应加入的酶是 　。 (2)在检测过程中要用到两种引物,引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。进行引物设计时需要注意的问题是　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。  (3)核酸检测过程中需要大量探针,若仅扩增探针这段单链,需要利用不对称PCR,即采用不等量的一对引物,经若干次循环后,低浓度的引物被耗尽,以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物,结果产生大量的单链DNA。这两种引物分别为限制性引物与非限制性引物,其最佳比例一般为1∶50~1∶100。据此分析,下图中的引物　　　　　应该为非限制性引物。假设反应体系中原来有1个模板DNA分子,最初20个循环扩增产生双链DNA,后15个循环均只扩增一条链,则需要限制性引物　　　　　个,需要非限制性引物　　　　　个。  解析:(1)由于PCR反应模板仅为DNA,因此在进行PCR反应前,先将流感病毒核酸RNA逆转录为cDNA,再以cDNA为模板,PCR扩增合成目的片段。所以检测流感病毒的过程中,反应体系中应加入的酶是逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。 (2)在检测过程中要用到两种引物,引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸;进行引物设计时需要注意的问题是引物长度要适宜、引物自身或两种引物之间不能存在互补序列。 (3)由题意分析可知,图中的引物1应该为非限制性引物;假设反应体系中原来有1个模板DNA分子,最初20个循环扩增产生双链DNA,产生的DNA分子数为220个,最初的两条模板链不需引物,所以需要限制性引物220-1(个);前20个循环需要非限制性引物的个数和限制性引物一样,也为220-1个,后15个循环,需要利用前20个循环扩增得到的DNA为模板,需要非限制性引物个数为220×15,所以一共需要非限制性引物个数为220-1+220×15=220×16-1=224-1(个)。 答案:(1)逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)　(2)使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　引物长度要适宜、引物自身或两种引物之间不能存在互补序列　(3)1　220-1　224-1 /课堂小结与随堂训练/ 一、知识体系构建 二、关键语句必背 1.聚合酶链式反应(PCR)技术所需条件:模板DNA、引物对、四种dNTP、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2+等。 2.PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。由于PCR过程在高温下进行,因此需要使用热稳定的DNA聚合酶。目的是通过指数式扩增获取大量的目的基因;前提是要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列,以便合成引物。 3.DNA迁移速率取决于琼脂糖凝胶的浓度、迁移分子的形状及大小等。 三、素养好题训练 1.实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测,其原理是在PCR退火过程中探针和引物一起与模板结合,探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团,新链延伸过程中,DNA聚合酶会破坏探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如下图所示。下列有关叙述错误的是 (　　) A.该技术需要用到解旋酶和Taq酶 B.该技术的原理是DNA半保留复制 C.该技术过程中需加入一对碱基序列不互补的引物 D.若检测结果有荧光发出,说明被检测者可能感染了病毒 解析:选A　逆转录合成cDNA的过程中,反应体系中需要加入逆转录酶,在PCR技术中需要用到Taq酶,不需要解旋酶,A错误;该技术运用了DNA半保留复制的原理,B正确;该技术需要一对特异性的引物,要求一对引物的碱基序列不能互相配对,否则引物之间会相互结合,C正确;若检测结果有荧光发出,说明被检测者可能感染了病毒,D正确。 2.(2025·连云港模拟)[多选]琼脂糖凝胶电泳通常用于鉴定PCR产物,如图为电泳图谱,相关叙述正确的是 (　　) A.DNA分子所带电荷越多,在凝胶中的迁移速率越快 B.在一定条件下,电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA含量呈正相关 C.样品组出现图示结果可能是因为复性温度过低,引物浓度过高 D.通过与Marker对比,可知待测样品的大小,其核苷酸组成要进一步测定 解析:选BCD　在琼脂糖凝胶电泳中,DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关,并不是DNA分子所带电荷越多,在凝胶中的迁移速率越快,A错误;在一定条件下,电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA含量呈正相关,B正确;复性温度过低、引物浓度过高,易导致引物与模板非特异性结合增强,出现多条杂带,与样品组电泳结果(多条带)相符,C正确;琼脂糖凝胶电泳只能分析DNA片段的大小,碱基的排列顺序要进行基因测序,D正确。 3.(2024·湖南高考)[多选]最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是 (　　) A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢 C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 解析:选AC　利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A正确。电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B错误。依据题干信息中双脱氧测序法的原理,可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3'终端的碱基,如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同,但终止点不同,可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基;图示电泳方向为从上→下,即对应的DNA片段为长→短,则对应的DNA测序结果为3'→5',如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带,则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3',C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,D错误。 4.PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题: (1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是　　　　　　(用序号表示)。  (2)操作③中使用的酶是　　　　　　　　。PCR中的每次循环可分为变性、退火、　　　　三步,其中退火的结果是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (3)为了做出正确的诊断,PCR所用的引物应该能与　　　　　特异性结合。  (4)PCR是　　　　　　　的缩写。它是一项根据　　　　　　　　的原理,在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术。PCR的产物常用　　　　　　　　来鉴定。  解析:(1)利用PCR技术检测病原菌的步骤:采集病人组织样本→从病人组织样本中提取DNA→利用PCR扩增DNA片段→分析PCR扩增结果,即④②③①。 (2)利用PCR扩增DNA片段需要热稳定的DNA聚合酶;PCR反应中的每次循环可分为变性、退火、延伸三步,其中退火的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。 (3)在DNA复制中引物所起的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物必须与病原菌DNA碱基互补配对。 (4)PCR全称为聚合酶链式反应,是在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术;PCR依据的原理是DNA半保留复制,其产物DNA常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 答案:(1)④②③①　(2)热稳定的DNA聚合酶　延伸　引物通过碱基互补配对与单链DNA结合　(3)病原菌DNA　(4)聚合酶链式反应　DNA半保留复制　琼脂糖凝胶电泳 学科网（北京）股份有限公司 $