1.2纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得课件-2025-2026学年高二下学期生物浙科版选择性必修3

第二节 纯净的目标微生物可通过 分离和纯化获得 人们在研究或利用微生物时需要使用纯种。因为只有使用纯种才能保证实验的可重复性和结果的可靠性，才能保证产品的品质。那么，如何从混杂的微生物中分离得到纯种的目标微生物？ 1.平板划线法 2.稀释涂布平板法 平板划线法（streak plate method）接种时，通常用接种环蘸取液体培养物或挑取固体表面的微生物后，在固体培养基表面进行划线以实现接种的目的。 平板划线法 C.多次连续平行划线 划线的过程也是对菌种进行分散的过程，接种环上的菌液逐渐减少，划线最后部分的细菌间距离加大大。接种后经过培养，在划线尾部得到单个细胞生长繁殖形成的单菌落。 哪一种平板划线法？ 1.平板划线法 https://www.bilibili.com/video/av35114600/?spm_id_from=333.788.videocard.1 多次连续平行划线法 1）蘸取菌种几次？ 如何多次连续划线？ 2）接种环共灼烧了几次？ 1.只蘸一次菌液，连续划线多次，首尾不能相接，不能划破培养基； 1）蘸取菌种几次？ 如何多次连续划线？ 2）接种环共灼烧了几次？ 2.共灼烧n+1次，你为划线区数； 多次连续平行划线操作中以下三种灼烧的目的是否相同？ 1. 蘸取菌液前灼烧 2. 下一次划线前灼烧 3. 划线操作结束后灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端。 及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。 3）划线后,培养皿在恒温培养箱中倒置培养12-24h。为什么要倒置培养? 培养基蒸发的水蒸气在培养皿盖子上凝结成形成小水滴，会落入培养基表面并扩散开，导致菌体随水扩散，达不到单菌落分离目的。 扇形划线法，单菌落一般出现在划线的什么位置？ A.连续平行划线 B.扇形划线 平板划线法能分离纯化微生物，那能否用于微生物计数？ 平板划线法 稀释涂布平板法 接种时，通常需要先将菌液_________，移液器取0.1mL稀释度不同的菌液加在平板培养基表面，用________均匀涂布在培养基平面上，然后进行培养。 2.稀释涂布平板法 梯度稀释 涂布器 9ml无菌水 0.1mL稀释液 稀释度是？ 稀释度越大，培养基菌落数越_____ 少 无法计数 159 17 2 0 稀释涂布平板法单落菌落分离容易，但操作复杂，可用于计数， 划线平板法方法简单，但单菌落较难分开，不能计数 平板划线法 稀释涂布平板法 哪种方法单菌落更容易分离？操作哪个更简单？ 孔雀石绿（简称MG）是广泛使用的有机染料，在自然环境中极难降解，容易引起土壤污染，进而危害人体健康。因此从土壤中分离和筛选出高效的MG降解菌有非常重要的意义。已知MG在水中溶解度低，含过量MG的固体培养基不透明。 (1)培养基的配制：MG降解菌富集培养基需含有NaH2PO4、KH2PO4、NaCl、NH4Cl、CaCl2、MgSO4、水等，再加_______________作为唯一碳源。培养基配制好后，需用_______________法进行灭菌。 孔雀石绿（MG） 高压蒸汽灭菌 (2)MG高效降解菌株的富集：如图所示，将1.0g土样接入含上述配制好的培养液的三角瓶中，将三角瓶置于30℃、180r/min摇床中振荡培养1～2天，振荡培养的目的是_______________________________________________________________，直至培养液变浑浊后，换瓶重复操作2﹣3次，以达到富集的目的。 孔雀石绿（简称MG）是广泛使用的有机染料，在自然环境中极难降解，容易引起土壤污染，进而危害人体健康。因此从土壤中分离和筛选出高效的MG降解菌有非常重要的意义。已知MG在水中溶解度低，含过量MG的固体培养基不透明。 使目的菌充分接触培养液中的营养物质，增大培养基中O2含量 (3)MG高效降解菌株的分离和纯化：图中所示的分离纯化细菌的方法是__________。实验中在对应稀释倍数为106的培养基中，取0．2ml稀释液涂布，得到以下统计结果；涂布了三个平板，统计的菌落数是210、240和246；请计算每毫升原液中的菌体数是_____________个。用这种方法测得的菌体数比实际活菌数量_______。 孔雀石绿（简称MG）是广泛使用的有机染料，在自然环境中极难降解，容易引起土壤污染，进而危害人体健康。因此从土壤中分离和筛选出高效的MG降解菌有非常重要的意义。已知MG在水中溶解度低，含过量MG的固体培养基不透明。 稀释涂布 平板法 1.16×109 少 (4)MG高效降解菌株的鉴定：将纯化获得的菌种接种于含过量MG的固体培养基（其他营养成分等适宜）上，根据培养基是否出现________，就可以鉴别出目的菌株，原因是_________________________________________________________。 孔雀石绿（简称MG）是广泛使用的有机染料，在自然环境中极难降解，容易引起土壤污染，进而危害人体健康。因此从土壤中分离和筛选出高效的MG降解菌有非常重要的意义。已知MG在水中溶解度低，含过量MG的固体培养基不透明。 透明圈 目的菌株通过降解MG生长，使菌落周围的培养基变透明，出现透明圈 活动：接种、培养并分离酵母菌 1.判断液体培养基成功接种酵母菌的依据是什么？ 2.如何判断是否分离出酵母菌的单菌落？判断依据是什么？ 与未接种的培养基相比，接种的培养基由于酵母菌的增殖而变浑浊。 与用酵母菌纯种在固体培养基表面接种的结果相比，用样品稀释液接种的固体培养基表面出现特征相同的、最小菌落即认为可能是分离出了酵母菌单菌落。 3.在固体培养基表面涂布的菌种是否出现形态、颜色不同的单菌落？你认为出现 该现象的原因是什么？ 4.仅从菌落特征是否能够认定你分离出了酵母菌？怎样进行进一步的鉴定？ 活动：接种、培养并分离酵母菌 否。① 挑取单菌落接入糖水中,厌氧环境培养一段时间检查是否能产生酒味； ② 接入面团中观察能否发面; ③ 挑取菌落样品，制作临时装片，在显微镜下观察、识别。 若出现，可能是在接种过程中有杂菌污染 显微镜计数法 可测定微生物的数量 19 对酵母菌逐个计数是非常困难的，可利用__________________采用抽样检测的方法进行计数。 血细胞计数板 注意：先盖盖玻片再滴加菌液，让菌液自行渗入，多余的菌液用滤纸吸去。 滴加菌液时避免菌液滴到盖玻片上，还要防止产生气泡。 正面图 侧面图 计数区 用滴管从试管中取1滴培养液到血细胞计数板的方格区，在滴加培养液之前要拧紧试管盖，将试管轻轻倒转几次，使得__________________；静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。观察时，计数板放在载物台的中央，观察酵母菌时光线应______________，在_____（低/高）倍镜下观察、计数。 酵母菌均匀分布 不要太强 高 酵母菌 培养 取样 制片 观察、计数 图1-26 计数区的划分 蓝色：大方格 橘色：中方格 绿色：小方格 白 白 白 白 血细胞计数板计数区 计数区 25×16型 （共计80小方格） （共计100小方格） 红细胞计数区总计400个小方格 16×25型 图1-26 计数区的划分 0.1mm3 / 0.4mm3 1mm×1mm×0.1mm（深度） 计数区两种容积规格： ① 计数顺序 左上 → 右上 → 右下 → 左下 ② 压线 只计左线和上线 ③ 出芽 芽体达到母细胞一半时，则算独立个体。 出芽 ④ 粘连 要数出团块中的每一个细胞。 ⑤ 浓度 计数总数不少于300个细胞，在培养后期 的样液需要稀释后计数 ⑥ 清洗 血球计数板使用后冲洗、晾干，切勿 用硬物洗刷。 计数区进行3次计数后求平均值,调整细准焦螺旋，测出不同深度的酵母菌 25 总细胞数计算： 该兴趣小组为了探究发酵液中酵母菌种群数量的动态变化，定期用血细胞计数板对其进行计数，右图是某次取样稀释100倍后观察到的一个中方格中酵母菌的数量，则10ml发酵液中酵母菌的数量大约是___________个 400个小方格细胞数/容积 × 稀释倍数 × 培养液总体积（mm3） 不同自然环境中生活着的微生物代谢类型不尽相同。尿素是蛋白质降解的产物，人和其他哺乳动物的尿中都含有尿素，土壤中大量存在会污染环境。有一些土壤细菌含有脲酶，可以通过脲酶将尿素降解为NH3和CO2，NH3作为其生长的氮源。 怎么调整培养基配方, 从土壤中分离出能分泌脲酶的细菌呢？ 调整培养基的配方和培养方式可有目的的培养某种微生物 尿素培养基 尿素8g 葡萄糖 0.1g 、 NaCl 0.48g、 K2HPO4 0.48g 、琼脂糖 2g、 酚红 1mg （尿素为唯一氮源) 1. 分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物作为碳源，其原因是？培养基中加 入碳源葡萄糖的作用是？ 分解尿素的细菌时异样型生物，不能利用无机碳合成有机物； 葡萄糖的作用：①为生命活动提供能量；②是自身其他有机物合成的原料； 如何验证尿素培养基对土壤中的细菌确实确有选择作用？ 1. 作为缓冲剂保持PH稳定 2. 提供无机营养 LB固体培养基（细菌通用培养基） 蛋白胨 1g 、酵母粉0.48g 、NaCl 1g、琼脂2g 1.配制培养基 尿素培养基 尿素8g 葡萄糖 0.1g 、 NaCl 0.48g、 K2HPO4 0.48g 、琼脂糖 2g、 酚红 1mg （尿素为唯一氮源) LB固体培养基（细菌通用培养基） 蛋白胨 1g 、酵母粉0.48g 、NaCl 1g、琼脂2g 1.配制培养基 2.为什么尿素固体培养基用凝固剂琼脂糖代替琼脂？ 琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，会为细菌提供一定 非尿素氮源，这样会在尿素固体培养上还会生长以非尿素为氮源的细菌。 酸碱指示剂酚红在酸性环境中呈黄色，碱性中呈红色。细菌向胞外分泌脲酶使培养基中尿素水解产生碱性氨，遇酚红指示剂使培养基变红。 红色环带 1.配制培养基 尿素培养基 尿素8g 葡萄糖 0.1g 、 NaCl 0.48g、 K2HPO4 0.48g 、琼脂糖 2g、 酚红 1mg （尿素为唯一氮源) LB固体培养基（细菌通用培养基） 蛋白胨 1g 、酵母粉0.48g 、NaCl 1g、琼脂2g 3.尿素固体培养基生长的细菌能够分解尿素，如何鉴别？ 三角瓶加封口膜后灭菌 尿素溶液40ml 过滤灭菌法 尿素固体培养基 尿素8g 葡萄糖 0.1g NaCl 0.48g K2HPO4 0.48g 琼脂糖 2g 酚红 1mg LB全营养培养基 蛋白胨 1g 酵母粉0.48g NaCl 1g 琼脂糖2g 三角瓶加封口膜后灭菌 在_______g /cm2_______℃下灭菌______min 500 112 30 1000 121 15 2.灭菌 盛有9ml蒸馏水的5支试管、盛有99ml蒸馏水的250ml三角瓶，移液器，枪头、接种环、培养皿、涂布器等 在_____g /cm2______℃以上灭菌______min 待冷却至 60 ℃时，加入 3.倒平板 在超净工作台酒精灯火焰旁，将三角瓶中的培养基分别进行倒平板 从有哺乳动物排泄的地方取得 平行重复实验，增加科学准确性 4.制备土壤细菌悬液 1.土样可以在哪里获取？ 2.各种稀释度的尿素固体培养基做 三个培养皿的目的？ 1.配制培养基 2.灭菌 3.倒平板 4.制备土壤细菌悬液 5.接种 6.培养 用移液器按照稀释度由大到小的顺序依次取0.1ml土壤稀释液，并在酒精灯火焰旁分别加入对应标记的培养皿中。 培养：将培养皿倒置，置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时。 1.本实验接种过程中，若用同一移液管吸取菌液，不按照稀释度由大到小的顺序 依次操作，是否会影响实验结果？为什么？ 会，如果先用稀释度小的菌液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致统计误差。 讨 论 2.根据图1-20所示的培养结果，估算土壤中能分泌脲酶的微生物的数量时，应 统计哪个稀释度的培养皿？为什么？ 应统计稀释度为10-3的3个培养皿中的菌落数后取平均值。因为这个浓度的培养皿中菌落数比较适中，计数的结果误差较小。 2.根据图1-20中，培养皿F中还有许多菌落周围颜色未发生明显改变，针对这种 现象，有人认为“这些未变色的菌落可能是能自生固氮的微生物，而不是能产 生脲酶的微生物。你认为这个解释合理吗？请说明理由。 意见①：合理，因为自生固氮微生物能在固氮酶的作用下，将N2转化为可利用 的氮源，故可在没有氮源的培养基上生长。可以挑取培养基未变色区 域的菌落，清洗除去细胞表面的培养基后接种在无氮源的培养基上， 观察其生长情况，从而证明其是否为能固氮的微生物。 意见②：不合理，可能是某些分泌脲酶能力较弱的微生物，菌落周围尿素水解少， 培养基pH变化小。 意见③：不合理，这些可能是能直接吸收尿素并作为氮源的微生物。 （1）将土壤中的固氮菌分离出来 （2）将土壤中自养微生物分离出来 （3）筛选出抗青霉素的微生物 （4）筛选出耐高浓度食盐的微生物 在培养基中加入青霉素，以抑制细菌的生长从而分离到酵母菌和霉菌。 在培养基中加入高浓度的食盐,可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将该菌分离出来。 培养基中不加入氮源 培养基中不加入碳源 调整培养基的配方和培养方式可有目的的培养某种微生物 一、目的要明确（微生物代谢类型） 1.自养型微生物 /异养型微生物（P5/42,44） 调整培养基的配方和培养方式可有目的的培养某种微生物 水某环保部门为了检测该地受污染的地表水水质，进行取样分析。再进行污水微生物种类和数量分析之前配置了相应培养基。属于自养型生物培养基的有？ 流状粉10g K2HPO4 4g FeSO4 0.5g 蔗糖 10g (NH4)2SO4 0.4g MgSO4 9g CaCl2 0.5g NaCl 10g 酵母浸膏 5g 蛋白胨10g 琼脂 20g 甲 + + + + - + + - - - + 乙 + + + + + + - - - - 丙 + + + + + + + - - - - 丁 - - - - - - - + + + + 2.代谢方式不唯一。（书本P18紫色非硫细菌、作业本P12/38） 二、营养要协调：培养基中营养物质的浓度和比例会影响微生物的生长。（书本P18） 1.过高的蔗糖浓度会抑制微生物的生长，过低度又不能满足微生物的生长需要。 2.发酵生产谷氨酸时，培养基C/N=4：1菌体大量繁殖，降为3：1时菌体繁殖减缓。 3.微囊藻在N/P比为4.5时生长最好,颤藻在N/P比为0.45时生长最好。 调整培养基的配方和培养方式可有目的的培养某种微生物 三、培养条件要适宜： 溶解氧：需氧型微生物和厌氧型微生物（P19） 光：光能自养型 如：蓝细菌、藻类 调整培养基的配方和培养方式可有目的的培养某种微生物 pH:细菌最适pH6.5-7.5。 $