微专题7 PCR技术及其应用（核心整合+能力进阶）（复习讲义）2026年高考生物二轮复习讲练测

微专题7 PCR技术及其应用 目录 01 析·考情精解 1 02 构·知能架构 3 03 串·核心通络 3 核心整合 PCR技术及其应用 3 自查探针 4道真题选改判，“探”出薄弱点，“诊”明提分路！ 核心串讲 串讲1 PCR中引物的设计 串讲2 PCR技术引导基因定点突变 能力进阶 能力1 PCR技术的精准优化 能力2 PCR技术的场景化应用 04 破·题型攻坚 9 真题动向 引入科技前沿、农业生产实践等新情境、融合新概念反套路命题！ 命题预测 考向1 传统发酵技术的应用 考向2 微生物的实验室培养 考向3 分离特定微生物并测定其数量 考向4 分离特定微生物并测定其数量 05 拓·素养提升 26 素养链接 情境拓展、长句表达！ 高考预测 5道最新模拟，精准预测素养考向！ 命题轨迹透视 从近三年高考试题来看，考查题型：命题以选择题为主，偶有实验相关的填空题或简答题，单题分值多为2-3分，常融入基因工程、实验探究等综合情境中。命题趋势：早期命题侧重基础概念记忆，比如直接考查PCR技术的定义、基本步骤等。近年转向核心考点的深度理解，聚焦三类重点内容：一是PCR的原理与操作，像对比细胞内DNA复制与PCR的解旋方式、反应体系组分及消耗情况等；二是PCR的实践应用，常结合基因工程、病原体检测、基因型鉴定考查，如验证重组质粒构建、检测基因编辑结果等；三是实验分析，围绕PCR引物设计、电泳结果判断、实验误差分析等，涉及实验操作易错点。核心素养导向：从单纯考知识记忆转向核心素养的综合考查。生命观念上，通过PCR体外扩增DNA的过程，强化物质与能量观、结构与功能观；科学思维上，常通过实验现象推理PCR反应异常原因，或结合引物设计考查逻辑推理能力；科学探究上，聚焦PCR实验设计与结果分析，考查实验原理应用和探究能力，贴合高考“素养导向、能力为重”的命题要求。 高考命题风向 近三年高考中，PCR技术及其应用的命题呈现“情境新颖、考法灵活、角度多元”的鲜明特点，摆脱传统单一知识考查，更侧重核心素养与实践应用的综合测评，具体风向如下。 新情境：以临床检测、基因工程实践为核心情境，如结合阿尔茨海默病相关基因检测，考查PCR技术在异常基因扩增与诊断中的应用；关联新冠病毒、结核杆菌等病原体检测，考查RT-PCR（逆转录PCR）的原理的操作流程；借助基因编辑、亲子鉴定等实际场景，考查PCR扩增的条件与结果分析，让知识点落地于真实应用。 新考法：不再单独考核PCR的原理或步骤，而是将其与核酸、蛋白质及其他技术综合考查。例如结合核酸-蛋白质复合体，分析PCR扩增中引物与模板DNA的结合机制，关联DNA聚合酶的功能；或结合电泳技术，考查PCR产物的鉴定与结果分析，体现技术间的协同应用。 新角度：跳出“PCR基础操作”的常规考查，聚焦特殊场景与差异分析。比如对比PCR与细胞内DNA复制的差异，分析体外扩增无需解旋酶的原因；或考查特殊PCR技术（如巢式PCR、实时荧光定量PCR）的应用优势，结合具体需求判断技术选择；还会结合不同生物的核酸特点，考查PCR引物设计的针对性，凸显命题的深度与灵活性，贴合高考“素养导向、应用为王”的命题趋势。 考点频次总结 考点 2025年 2024年 2023年 PCR定点诱变技术RT－PCR、反向PCR 2025·云南·T15　 2025·山东·T24 2024·河北·T18 2023·辽宁·T25　 基因编辑技术及其应用 2025·安徽卷·T15　 2024·安徽卷·T20 2024·天津卷·T15 2024·新课标卷·T35 2023·湖北卷·T4 2023·辽宁卷·T18 2023·海南卷·T20 2026命题预测 预计在2026年高考中，PCR技术及其应用仍会以非选择题为主要考查形式，核心围绕PCR的原理、操作流程及应用等基础知识点出题。还可能设置易错陷阱，比如混淆PCR与细胞内DNA复制的解旋方式、误判PCR反应体系中不需要解旋酶、或将RT-PCR与常规PCR的步骤混淆等，以此考查学生对概念的精准把握。同时关联生活与科研：命题会依托生活场景或科研实例设计情境，比如结合新冠病毒、流感病毒等病原体的快速检测，考查RT-PCR的原理与应用；或引入基因编辑、亲子鉴定、遗传病筛查等科研与生活场景，考查PCR技术在基因扩增、结果鉴定中的作用；也可能以陌生科研信息为载体，给出新型PCR技术（如实时荧光定量PCR）的相关资料，让学生提取信息并结合PCR基础知识点分析问题，体现“题在书外，理在书中”的命题特点。PCR相关实验探究仍是高频考点，2026年可能考查实验原理（如PCR引物的作用、DNA聚合酶的功能）、操作细节（如PCR反应的温度控制、引物设计的原则），还可能给出异常实验现象让学生分析原因，比如PCR产物无条带可能是引物设计不合理或退火温度过高，以此考查学生的科学探究能力，贴合高考“素养导向、能力为重”的命题趋势。 核心整合 PCR技术及其应用 (1)(2025·河北卷)PCR过程中DNA双链的解旋涉及酶的催化作用。 ( ) (2)(2024·河北卷)配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。 ( ) (3)(2025·广东卷)为了确保PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'⁃羟基。 ( ) (4)(2025·山东卷)利用动物体细胞核移植技术培育转基因牛丁，可用PCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛。( ) 串讲1 PCR中引物的设计 核心设计要点 具体要求 关键说明 引物长度 长度控制在18-25个碱基，最常用20-22个；不要短于18个或长于25个 引物太长或太短，都会影响PCR扩增效果，要么结合不精准，要么扩增效率低 引物特异性 引物序列只能和目标片段结合，不能和其他无关片段结合 特异性差会导致扩增出无关片段，干扰目标结果，无法得到想要的DNA片段 特殊修饰 可根据需求在引物一端添加标记（如荧光），另一端不能修改 修改引物的扩增起始端（3’端），会直接导致PCR无法延伸，扩增失败 引物方向 一对引物要分别结合目标片段的两端，方向正确才能扩增出目标长度的DNA 引物方向颠倒，无法扩增出目标片段，整个PCR实验都会失败 【易错一笔勾销】 1、引物过长或过短，会导致扩增效率低或特异性差，出现非特异性条带。 2、一对引物Tm 值相差过大，会造成退火不同步，PCR 扩增失败或效率极低。 3、引物3’端碱基错配或不稳定，会直接导致 DNA 聚合酶无法正常延伸，扩增中断。 4、引物间或引物自身互补配对，易形成二聚体和发夹结构，抢占引物资源导致目的片段扩增不足。 5、引物特异性不足，会与非目标序列结合，扩增出无关片段，干扰实验结果。 串讲2 PCR技术引导基因定点突变 核心内容 具体说明（高中生易懂版） 注意事项 核心原理 利用PCR技术，在引物中引入预设的碱基变化（突变），通过PCR扩增，让突变碱基整合到目标基因中，最终获得带有特定突变的基因，不改变基因其他序列。 核心是“引物带突变，扩增传突变”，只改变目标位点，不破坏基因整体结构，避免随机突变。 核心材料 1. 模板DNA（含目标基因）；2. 带突变位点的特异性引物（关键）；3. DNA聚合酶；4. 缓冲液、dNTP（合成DNA的原料）。 引物是核心，突变位点必须设计在引物上，且引物其他部分要与模板DNA完全互补。 关键步骤 1. 设计带突变的引物（突变碱基放在引物中间或3’端）；2. 以原始基因为模板，进行PCR扩增，得到含突变的DNA片段；3. 筛选、验证，获得纯合的突变基因。 步骤2的PCR扩增要保证效率，避免未突变的原始基因残留；步骤3的验证是关键，确保获得的是目标突变基因。 常见突变类型 1. 点突变：单个碱基替换（如A→T）；2. 缺失突变：删除1-几个碱基；3. 插入突变：插入1-几个碱基（高中生重点掌握点突变）。 点突变最常用、最易操作，缺失/插入突变需控制碱基数量，避免破坏基因的正常功能。 【易错一笔勾销】 1、 突变位点设计在引物3’端，导致引物无法与模板结合，PCR 扩增失败。 2、 突变引物与模板互补区域太短，特异性差，容易出现非特异性扩增。 3、 上下游引物未同时引入对应突变，最终得到的 DNA 片段不携带完整突变。 4、 PCR 扩增后未去除原始模板 DNA，造成突变产物与野生型模板混杂，突变效率低。 5、 突变碱基设计不合理，导致引物自身折叠或形成二聚体，影响扩增与突变效果。 能力1 PCR技术的精准优化 能力解读 核心优化模块 能力解读 具体优化操作 避坑提醒 退火温度优化 基础能力：知晓退火温度影响引物结合；进阶能力：理解温度与特异性、扩增效率的关联，能根据引物特性微调温度，实现精准配对，杜绝非特异性结合。 控制退火温度在55-65℃，保证一对引物Tm值差值≤2℃；温度偏高提升特异性，温度偏低保证扩增效率，找到适配平衡点。 温度过高引物无法结合模板，温度过低引物乱配对，出现杂带、非目标片段扩增。 引物设计优化 基础能力：掌握引物基础参数；进阶能力：结合实验目的优化引物结构，规避无效结构，保障引物只靶向目标片段，这是PCR精准扩增的核心前提。 控制引物长度18-25bp，G+C含量40%-60%；避开3’端突变、连续相同碱基，防止引物二聚体和发夹结构。 引物3’端设计失误、自身互补配对，会直接导致PCR无法延伸或扩增失败。 反应浓度优化 基础能力：了解各试剂作用；进阶能力：把控试剂浓度配比，避免浓度失衡影响扩增效果，保证反应体系稳定，实现高效且精准的扩增。 引物终浓度0.1-1.0μmol/L且正反引物浓度一致；模板DNA浓度适中，dNTP和DNA聚合酶用量规范。 引物浓度过高易形成二聚体，浓度过低无扩增条带；模板过多会加重非特异性扩增。 典题示例（2025·江苏南通期调研）hNaDC3（人钠/二羧酸协同转运蛋白-3）主要分布于肾脏等重要器官。为进一步研究hNaDC3的生理功能，科研人员利用基因工程技术构建了绿色荧光蛋白（GFP）基因与hNaDC3基因的融合基因，其过程如图所示。相关叙述正确的是（　　） A.设计引物的目的是为了能够从其5'端开始连接脱氧核苷酸 B.设计引物P1和P2的依据是GFP基因两端的核苷酸序列 C.PCR扩增GFP和hNaDC3基因，经过1轮可形成所需的等长片段 D.杂交链延伸生成GFP-hNaDC3融合基因的过程中需要加入引物P1和P4 能力2 PCR技术的场景化应用 能力解读 核心应用场景 能力解读 应用逻辑 易错提醒 基因工程 基础能力：知晓PCR可扩增目的基因；进阶能力：能结合基因工程流程，理解PCR在“获取目的基因”中的作用，能分析PCR与限制酶、DNA连接酶的配合逻辑，实现技术与知识点的关联。 利用PCR高效扩增目标基因片段，为基因克隆、基因表达（如转基因生物培育）提供足量的目的基因，替代传统提取方法，提高效率。 混淆PCR与基因工程其他步骤的作用，误认为PCR可直接实现基因导入；忽略PCR扩增的目的基因需进一步处理（如加酶切位点）。 遗传病检测 基础能力：了解PCR可检测基因突变；进阶能力：能结合遗传病病因（如单基因遗传病的碱基突变），理解PCR检测的原理，能区分PCR与其他检测方法的核心优势。 通过PCR扩增患者的目标基因片段，对比正常基因序列，判断是否存在致病突变（如镰状细胞贫血的碱基替换），实现遗传病的快速筛查。 误认为PCR可直接诊断遗传病，忽略“PCR扩增后需对比序列”的关键步骤；不清楚PCR的高灵敏度优势（可检测微量DNA）。 病原体检测 基础能力：知道PCR可检测病毒、细菌；进阶能力：能理解PCR“特异性扩增病原体DNA”的原理，结合疫情相关场景，解释PCR检测的高效性和准确性。 针对病原体（如新冠病毒、结核杆菌）的特有基因序列，设计特异性引物，通过PCR扩增该序列，若能扩增出条带，说明存在该病原体，实现快速检测。 混淆PCR检测与抗原检测的区别，误认为PCR可检测病原体抗原；忽略引物特异性对检测结果的影响（引物不特异会出现假阳性）。 基因定点突变 基础能力：回顾PCR引导基因定点突变的基础流程；进阶能力：能关联引物设计要点，理解PCR在突变中的核心作用，能分析突变后PCR的优化逻辑。 将突变碱基设计在引物上，通过PCR扩增，将突变碱基整合到目标基因中，实现基因的精准改造，用于研究基因功能或改良生物性状。 忘记“突变位点需设计在引物中间”的要点；忽略PCR扩增后需去除原始模板，导致突变效率低。 典题示例：用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，假设限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述正确的是（　　） A.用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到6个游离的磷酸基团 B.图1中X代表的碱基对数为4 500，Y是限制酶A的酶切位点 C.电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关 D.利用PCR技术从图1 DNA中扩增出等长的X片段，至少需要3次循环 1．（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（    ） A．1'-碱基 B．2'-氢 C．3'-羟基 D．5'-磷酸基团 命题解读 新情境：题目以Solexa高通量测序技术为背景，精准对接当下分子生物学科研热点，该技术是将PCR与荧光检测相结合的二代测序核心技术，依托“边合成边测序”的核心原理，广泛应用于基因组学、基因检测等科研领域，贴合高考“情境生活化、科研化”的命题导向。这种情境打破课本中PCR技术的孤立讲解，将PCR扩增与高通量测序、荧光检测等前沿技术结合，让考生感受到PCR技术在实际科研中的应用价值，凸显知识的实用性与前沿性。选项A、B、C、D均围绕脱氧核糖的结构特点设计，精准对应DNA聚合酶的催化特性，如选项C直接关联DNA聚合酶“只能从引物3'-羟基延伸DNA链”的核心特性，还原科研中“可逆末端终止”测序技术的关键原理，引导考生用课本基础知识点解读前沿科研技术的核心逻辑。 新考法：本题不只是单纯的PCR原理记忆题，更是科研素养与知识应用能力的测评题。正确选项C紧扣DNA聚合酶的催化机制，契合PCR技术“5'→3'延伸”的核心原理，同时关联Solexa测序中“可逆末端终止”技术的关键操作，落实“生命观念”和“科学思维”等核心素养。这种考法将PCR技术原理与DNA分子结构、酶的催化特性、前沿测序技术深度绑定，整合了分子生物学（DNA结构）、酶学（DNA聚合酶功能）、生物技术（高通量测序）等多领域知识。如分析各选项时，需串联脱氧核糖结构、DNA聚合酶催化特点、PCR延伸机制等知识点交叉判断，考查考生提取科研情境信息、关联课本知识、进行逻辑推理的能力，符合高考“综合性考查、能力为重”的命题趋势，体现“题在书外，理在书中”的命题特点。 2．（2025·江西·高考真题）天然色素可赋予稻米多样化颜色。为解析红色稻米品种ka的遗传机制，研究人员以连续自交表型均稳定遗传的纯合品种ka(红色)、Dr(白色)和Pu(白色)开展实验(本题涉及的基因名称依次定义为A/a、B/b……)。回答下列问题： (1)ka和Dr正反交，获得籽粒(F1)，种植后自交获得籽粒(F2)，F2自交获得F3，表型如下表，表明其遗传方式为母性影响(子代表型由母本的核基因控制)。完善表中表型数据。 亲本组合 F1 颜色 F2颜色 F3颜色 ♀ka(红)×♂Dr(白) 全红 全红 _______ ♀Dr(白)×♂Ka(红) 全白 ________ 红：白=3:1 (2)ka和Pu杂交，后代连续自交获得F3的表型比例为9红：3棕：4白，表明ka中籽粒颜色由两对基因控制，结出棕色籽粒的F2植株基因型为___________或___________。 (3)在定位好的A/a、B/b基因两侧设计PCR引物，引物对1和引物对2分别可扩增A/a、B/b全部序列。下图是对亲本ka、Dr、Pu和第(2)题中F2某个体PCR后电泳的结果。已知图中①为ka，②为Dr，可判断a基因由A基因发生___________突变形成；③结出的籽粒颜色是___________或___________。 (4) 回收第(3)题图中条带I和Ⅱ中的DNA，以speI(一种限制性内切核酸酶)处理，I中的DNA不能被切割，Ⅱ中的DNA被切割成4个片段，据此推测B基因突变为b基因的过程中至少有___________个碱基发生了突变。 命题解读 新情境：题目以红色稻米品种遗传机制解析为科研背景，精准对接农业育种与分子遗传学研究热点，将经典遗传规律与现代分子检测技术深度融合。该情境打破课本孤立知识点考查模式，以纯合水稻品系正反交、连续自交等真实育种实验为载体，串联母性影响、9:3:4 变式遗传、PCR 扩增、凝胶电泳、限制性内切酶酶切等核心知识，让考生在解析稻米颜色遗传的科研流程中，感受遗传学原理与分子技术在作物育种中的应用价值。题干围绕 ka、Dr、Pu 三个稳定遗传品系设计杂交实验，从表型比例推导遗传规律，再到分子水平验证基因突变，完整还原 “表型分析→遗传规律→分子验证” 的科研逻辑，凸显知识的实用性与科研性。 新考法：本题是遗传规律与分子技术的综合能力测评题，落实 “科学思维、科学探究、生命观念” 核心素养。考法上实现三大突破：一是特殊遗传规律深度考查，不局限于 9:3:3:1 常规比例，聚焦母性影响与9:3:4 基因互作变式，要求考生突破常规思维，推导子代表型与基因型关系，考查逻辑推理与知识迁移能力；二是分子技术与遗传分析深度融合，将 PCR、电泳、限制酶切等分子检测手段嵌入遗传题，通过条带差异判断基因型、推导突变类型，考查 “基因型 — 分子标记 — 表型” 的关联分析能力；三是科研思维与问题解决能力综合考查，从正反交实验设计、表型数据完善，到基因型推断、突变碱基数量计算，层层递进考查实验分析、信息提取与综合运用能力，契合高考 “综合性、应用性、创新性” 命题趋势，体现 “题在书外，理在书中” 的命题特点。 3．（2025·浙江·高考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 命题解读 新情境：题目以玉米雄性不育突变体的遗传解析为农业科研背景，精准对接作物育种与分子遗传学研究前沿。该情境打破课本孤立知识点考查模式，以雄性可育 / 不育性状的遗传分析为主线，串联基因突变类型、遗传规律推导、PCR 扩增、限制性内切酶酶切、凝胶电泳等核心知识，完整还原 “表型筛选→遗传分析→分子验证” 的科研流程浙江省教育考试院。题干围绕甲、乙、丙三个品系设计杂交实验，通过后代性状分离比推断基因显隐性与遗传方式，再利用分子标记（PCR - 酶切电泳）定位基因型，让考生在解决农业育种实际问题中，感受遗传学原理与分子技术的应用价值，凸显 “端牢中国饭碗” 的学科社会责任浙江省教育考试院。 新考法：本题是遗传规律与分子技术深度融合的综合能力测评题，全面落实 “科学思维、科学探究、生命观念” 核心素养。考法上实现三大突破：一是特殊遗传场景与突变类型综合考查，整合碱基替换、插入突变等基因突变形式，结合性状分离比推导显隐性、基因型与基因频率，考查逻辑推理与数据处理能力；二是分子技术与遗传分析一体化设计，将 PCR 引物设计、酶切位点分析、电泳条带解读与遗传题深度绑定，通过分子标记结果反推基因型与突变类型，考查 “基因型 — 分子标记 — 表型” 的关联分析能力；三是实验探究与综合应用能力进阶考查，涵盖遗传图解书写、实验方法拓展、PCR 原理正误判断等多维度设问，从知识记忆转向原理理解与问题解决，符合高考 “综合性、应用性、创新性” 命题趋势，体现 “题在书外，理在书中” 的特点。 4．（2025·河北·高考真题）T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。回答下列问题： (1)基因内碱基的增添、缺失或_____都可导致基因突变。 (2)以Aa植株为_____（填“父本”或“母本”）与野生型拟南芥杂交，F1中卡那霉素抗性植株的占比为0，其反交的F1中卡那霉素抗性植株的占比为_____。 (3)为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，该植株会产生_____种基因型的可育花粉，其中具有a基因的花粉占比为_____。该植株自交得到F1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型植株占比为_____。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为_____。 (4)实验中还获得了一个E基因被T-DNA插入突变为e基因的植株，e基因纯合的种子不能正常发育而退化。为分析基因E/e和A/a在染色体上的位置关系，进行下列实验： ①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出基因型为_____的F1植株。 ②选出的F1植株自交获得F2．不考虑其他突变，若F2植株中花粉和自交所结种子均发育正常的植株占比为0，E/e和A/a在染色体上的位置关系及染色体交换情况为_____；若两对基因位于非同源染色体，该类植株的占比为_____。除了上述两种占比，分析该类植株还可能的其他占比和原因：_____。 命题解读 新情境：题目以T‑DNA 插入失活技术研究拟南芥基因功能为前沿科研背景，精准对接分子遗传学与植物基因工程研究热点。该情境打破课本孤立知识点考查模式，以A/a、E/e 两对基因的遗传与功能验证为主线，串联基因突变类型、花粉不育的特殊遗传效应、外源基因插入、PCR‑电泳分子检测、基因连锁与交换等核心知识。题干围绕拟南芥雄性不育、种子发育异常等真实科研问题设计实验，从正反交验证花粉不育效应，到外源基因插入后的配子分析，再到两对基因位置关系探究，完整还原 “基因诱变→遗传分析→分子验证→基因定位” 的科研流程，让考生在解决植物基因功能研究的实际问题中，感受分子技术与遗传规律的融合应用，凸显生物学研究的科学性与实用性。 新考法：本题是分子技术与遗传规律深度融合的综合能力测评题，全面落实 “科学思维、科学探究、生命观念” 核心素养。考法上实现三大突破：一是特殊遗传效应深度考查，聚焦花粉不育、种子纯合致死等特殊遗传现象，突破常规孟德尔遗传比例，考查考生对特殊遗传条件下配子形成、受精过程与后代比例的逻辑推理能力；二是分子技术与遗传分析一体化设计，将T‑DNA 插入、PCR 引物设计、电泳条带解读与遗传题深度绑定，通过分子标记结果反推基因型、验证基因功能，考查 “基因型 — 分子标记 — 表型” 的关联分析能力；三是基因定位与综合探究能力进阶考查，从单基因遗传到两对基因位置关系分析，涵盖正反交实验、配子类型计算、自交后代比例推导、基因连锁与交换判断等多维度设问，从知识记忆转向原理理解与问题解决，符合高考 “综合性、应用性、创新性” 命题趋势，体现 “题在书外，理在书中” 的特点。 5．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3) 通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 命题解读 新情境：题目以小麦种子休眠与穗发芽防控的农业科研为背景，精准对接作物遗传改良与分子育种前沿。该情境打破课本孤立知识点考查模式，以农杆菌转化法、T‑DNA 插入突变、基因功能验证为主线，串联Ti 质粒结构、限制酶选择、黏性末端补平、重组质粒鉴定、PCR 扩增、DNA 测序与比对等核心知识。题干围绕小麦种子休眠基因的插入失活突变体筛选、基因定位与功能验证设计实验，完整还原 “载体构建→遗传转化→突变体筛选→基因定位→功能验证” 的科研流程，让考生在解决农业生产中穗发芽防控的实际问题中，感受基因工程技术在作物育种中的应用价值，凸显生物学服务农业生产的社会责任。 新考法：本题是基因工程技术与分子遗传分析深度融合的综合能力测评题，全面落实 “科学思维、科学探究、生命观念” 核心素养。考法上实现三大突破：一是技术流程与原理深度融合，聚焦Ti 质粒改造、限制酶选择、黏性末端补平、重组质粒鉴定等基因工程关键操作，突破常规记忆性考查，要求考生结合示意图分析酶切位点、判断重组方向，考查对技术原理的精准理解与应用能力；二是分子检测与遗传分析一体化设计，将PCR 扩增、电泳分析、DNA 测序与比对与基因定位、功能验证深度绑定，通过分子标记结果判断突变基因是否为同一基因，考查 “基因型 — 分子标记 — 表型” 的关联分析能力；三是实验探究与综合应用能力进阶考查，从单基因功能验证到基因定位分析，涵盖载体构建、分子检测、结果分析等多维度设问，从知识记忆转向原理理解与问题解决，符合高考 “综合性、应用性、创新性” 命题趋势，体现 “题在书外，理在书中” 的特点。 6．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 7．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落________（填序号），出现菌落④的可能原因是________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路________。 8．（2025·全国二卷·高考真题）东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 (1)研究发现，东方果蝇中dsx基因______出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 (2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是______（选填字母）。 ②由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为______（填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是______。 (3)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的端和端_____ ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）， ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若______，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在______℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 能力01 PCR中引物的设计 1．基因PCR定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR是发展最早的定点突变技术，其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（    ） A．蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质 B．应将引物1、2与引物3、4置于两个独立的反应体系中 C．步骤④使用DNA聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸 D．步骤⑤中如果完成6轮循环一共需要消耗63个引物1 2．SYBR是一种荧光染料，其与双链DNA结合后会发出荧光，未与双链DNA结合的SYBR不会发出荧光。科研小组在PCR反应管①、②中加入模板DNA、耐高温的DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、H2O、过量SYBR以及不同引物，进行PCR反应后观察荧光现象。模板DNA及引物序列如下表所示。下列叙述错误的是（    ） 模板DNA序列 —ATGCGTAATC……TCCGAGTAC— 反应管①中引物序列 —ATGCGTAATC—   —GTACTCGGA— 反应管②中引物序列 —CCGCGTAATC—   —GGACTCGGA— 注：“……”为未写出的序列，表中引物与模板DNA中未写出序列不会发生特异性结合。 A．反应管①PCR产物电泳后，可进行二苯胺染色以判断DNA条带位置 B．反应管②中引物序列不能与模板链完全碱基互补，仍会出现荧光现象 C．调节反应管①②的退火温度，可使两支反应管中出现相似的荧光强度 D．SYBR可用于比较不同PCR反应中反应管DNA模板初始含量的差异 3．反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如图。下列叙述正确的是（　　） A．PCR过程周期性改变温度是为了调控Taq DNA聚合酶活性 B．反向PCR过程中主要是以已知序列L作为DNA复制的模板 C．PCR过程需添加引物1和引物4以便DNA聚合酶延伸子链 D．PCR扩增的未知序列是否正确可以用二苯胺水浴加热来鉴定 4．根据某基因上游和下游的碱基序列，设计合成了用于该基因PCR的两段引物（单链DNA）。引物与该基因变性DNA（单链DNA）结合为双链DNA的过程称为复性。下图是两引物的Tm（引物熔解温度，即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度）测定结果，以下分析错误的是（　　） A．PCR过程中，复性温度应高于引物的Tm值以提高PCR效率 B．两引物分别与DNA的两条互补单链结合，是子链延伸的起点 C．若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的（G+C）含量较高 D．适当减少引物2的脱氧核苷酸数，可使其Tm值接近引物1 5．根据PCR的原理，复性温度要根据引物确定，下列说法错误的是（    ） A．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基互补配对的短单链核酸 B．引物偏长，则复性温度要相应地降低 C．引物设计的过短或者过长都可能会导致非特异性扩增 D．在一定温度范围内，提高复性温度可以增强PCR的特异性 能力02 PCR技术与电泳 6．PCR与琼脂糖凝胶电泳是分子生物学中非常重要的实验，下列叙述错误的是（　　） A．利用PCR技术扩增目的基因时，通常需要进行预实验来确定合适的退火温度 B．待分离的DNA片段较小时，配制的琼脂糖溶液的浓度应该适当提高 C．琼脂糖在沸水浴中加热至熔化，待溶液稍冷却后，加入适量的核酸染料 D．基因工程的基本操作程序中，琼脂糖凝胶电泳只能对PCR产物进行分离、鉴定和纯化 7．STR是真核生物基因组DNA中长度为2～6bp的短串联重复序列（如“…GTGTGT…”），常用于遗传标记。生物的基因组DNA中有很多个STR，分布在不同位置，每个STR的序列重复数均不同。研究人员从野外动物粪便中提取基因组DNA（混杂宿主与环境微生物等多种序列），利用PCR和电泳技术可实现个体识别，该技术可行的前提不包括（    ） A．电泳可以确定STR的碱基序列 B．粪便中的STR不被微生物彻底降解 C．不同个体间STR的差异可以稳定存在 D．已知STR上游和下游的部分碱基序列 8．某研究小组针对植物抗逆基因进行了以下实验：首先从耐旱植物叶片中提取总DNA，再利用PCR技术扩增抗逆基因，最后通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测与鉴定。下列实验操作正确的是（　　） A．叶片研磨液置于4℃冰箱中几分钟后，需充分摇匀再进行提取 B．PCR实验中设置75摄氏度的目的是便于引物与模板链结合 C．配制琼脂糖凝胶浓度时需要考虑待分离的抗逆基因片段的大小 D．通过电泳鉴定PCR产物时，正常情况下会出现5条DNA带 9．图甲表示限制酶切割某双链DNA分子的图示，其中Y为某种限制酶，X表示切割的DNA长度，限制酶对应切点一定能切开。图乙表示图甲用不同酶切后的产物电泳分离结果。下列相关叙述正确的是（　　） A．若经电泳分离后图乙没有相应电泳条带，则是PCR中延伸温度太高所致 B．由图可知，限制酶A、限制酶B分别酶切产生的黏性末端的碱基能互补配对 C．根据图乙中酶切电泳分离结果可推测，Y为限制酶B，X长度为4500bp D．限制酶A酶切电泳结果与图乙中的①相符，限制酶B酶切电泳结果与图乙中的②相符 10．研究发现，HIV通过细胞膜上的A蛋白侵染人体细胞，同时发现若A基因缺失了32个特定碱基对会导致A蛋白异常，从而aa个体天然免疫HIV。现为了快速辨别甲、乙、丙个体的基因型，用引物F和R分别对三人的基因组进行PCR，每组PCR产物都分为两份，一份直接电泳，一份用ApoI酶切割后电泳，结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．2号加样孔中的样品均为PCR产物直接电泳结果 B．乙个体两个加样孔条带一致可能是ApoI酶失活导致 C．测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列 D．DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关 能力03 PCR技术引导基因定点突变 11．研究人员利用基因工程技术编辑基因L，培育抗盐碱的大豆新品系。在载体上的限制酶Bsa I切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因L使其定点突变，以获得抗盐碱特性。载体信息及酶切位点如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．Bsa I酶对载体进行酶切后，载体上产生的黏性末端为5'-ATTG-3' 及5'-GTTT-3' B．使用含卡那霉素的培养基筛选导入重组载体的大豆细胞 C．对目标基因L进行PCR扩增，经3次循环后可获得两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 D．将转基因大豆与普通大豆共同种植于盐碱地，对比观察确定是否赋予大豆抗盐碱的特性 12．基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术。下图为利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是（    ） A．由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成 B．酶① 应为耐高温DNA聚合酶，引物X和Y应该为引物2和4 C．可以将引物1、引物2、引物3和引物4置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应，进而缩短实验时间 D．利用图示流程技术可以将两个不同的基因拼接到一起 13．乳腺癌严重威胁着人类的健康。癌细胞需要从内环境吸收天冬酰胺，使用外源天冬酰胺酶降解内环境中的天冬酰胺可抑制癌细胞增殖，正常细胞能合成天冬酰胺，受影响较小。回答下列问题： (1)使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入_________等天然成分。与正常组织细胞不同，乳腺癌细胞因失去_________特性，可在培养瓶中堆叠生长。培养箱中通入CO2的主要作用是_________ (2)天冬酰胺酶具有一定水解谷氨酰胺的酶活性，长期使用会对正常细胞造成损伤。为降低天冬酰胺酶的副作用，可通过_________工程改造其结构。已知天冬氨酸密码子为GAU/GAC，甘氨酸密码子为GGU/GGC/GGA/GGG，若通过单个碱基对的替换将天冬酰胺酶中第50位的天冬氨酸（见图1）替换为甘氨酸，需将模板链中5'-GTC-3＇序列突变为5'_________3'。 (3)为实现单碱基对的定点突变，应选用引物_________（填编号）对质粒1进行全质粒扩增。全质粒扩增产物为线性DNA，从DNA聚合酶作用角度分析，原因是_________。在去除模板质粒的PCR产物中加入_________以得到质粒2.将质粒1和质粒2分别导入大肠杆菌后，可用___法检测目的基因是否表达成功。 (4)图2显示了改造前后的天冬酰胺酶对两种氨基酸的水解活性，据图分析改造后的酶作为候选药物的优势为_________。 14．科学家通过基因工程改造大肠杆菌，实现规模化生产人胰岛素；利用蛋白质工程优化胰岛素结构，通过将胰岛素B链的第28位氨基酸-脯氨酸（密码子为CCU）替换为天冬氨酸（密码子为GAU），有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。图1是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，图2是利用大引物PCR技术引入特定位点突变的流程。回答下列问题。 (1)图1中质粒作为载体时未标出的必需结构是____。为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5’端应添加限制酶____的识别序列，下游引物5’端的15个碱基序列为5’-____-3’。 (2)β-半乳糖苷酶可以将无色的X-gal分解产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，培养基中需添加____，从____色菌落中选择。 (3)图2中，为了得到可表达出速效胰岛素类似物的改良基因，进行第一次PCR时，上游引物对应突变位点的碱基序列是5’-____-3’。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR时，至少要进行____次循环，才能获得完成定点突变、双链等长的改良基因。 15．人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，而为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。因此，利用蛋白质工程可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t-PA改良基因的重组质粒的示意图，图中重叠延伸PCR过程中，引物a、b用来扩增突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增突变位点的下游DNA序列。回答下列问题： (1)制造出性能优异的t-PA突变蛋白的途径：从预期的蛋白质功能出发→_____→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 (2)该案例中改造t-PA突变蛋白的策略是定点突变，引物_____中含有突变位点。PCR1和PCR2______（填“在”或“不在”）同一个反应体系中进行，从引物的角度分析，原因是_____。 (3)经PCR3获得t-PA改良基因后，对t-PA改良基因进行PCR扩增过程中，在设计引物时应在两个引物的5′端分别添加________。 (4)经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，应采用______法将大肠杆菌接种到添加了_______的培养基上，筛选出的_____色菌落即为工程菌种。 一、情境拓展·科技前沿（2024-2025热点聚焦） 1. 医学检测前沿：实时荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）广泛应用于新型病原体（如变异呼吸道病毒）、罕见遗传病、肿瘤早期筛查，核心考查荧光信号原理、定量分析及引物特异性，凸显技术在精准医疗中的价值，是高考选择题、简答题的高频情境。 2. 农业分子育种热点：PCR技术与T-DNA插入突变、基因编辑（CRISPR-Cas9）、分子标记辅助育种深度融合，应用于小麦、水稻等作物的抗逆、育性、品质基因鉴定，常结合电泳条带、酶切结果，考查基因型判断、外源基因检测，关联遗传规律与分子技术的综合应用。 3. 生态与环境监测新方向：环境DNA（eDNA）结合PCR技术，用于入侵物种监测、珍稀物种保护、水体污染生物检测，侧重考查微量DNA扩增、实验污染防控、对照设计，体现生物技术服务生态保护的社会责任，成为2025年命题新亮点。 二、新情境探究、结合教材分析以及长句作答 （一）结合教材分析类 1．分析并回答下列问题： (1)相比于体内DNA复制，PCR技术体外扩增DNA的优势是什么？原因是____________________________________________________________。 (2)PCR反应体系中，引物和模板DNA的结合（复性步骤）需要控制适宜的温度，原因是____________________________________________________________________。 (3)PCR技术中，每次循环都包括变性、复性、延伸三个步骤，其中延伸步骤的作用是什么？原因是___________________________________________________________________。 （二）长句作答类 2．某研究团队利用PCR技术检测某遗传病的致病基因（A基因），设计了A基因的特异性引物，同时设置了阳性对照（含A基因）、阴性对照（不含A基因）和3组患者样本（编号①②③），PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示：阳性对照组出现特异性条带，阴性对照组无条带，样本①②出现清晰的特异性条带，样本③无条带。回答下列问题： (1)样本①②出现特异性条带，说明_______________________________________________________，判断的依据是_______________________________________________________________。 (2)样本③无条带，可能的原因是___________________________________________________，判断的依据是_____________________________________________________。 3．分析并回答下列问题： (1)PCR技术广泛应用于基因诊断，其核心优势是什么？原因是________________________________。 (2)利用RT-PCR技术（逆转录PCR）检测RNA病毒（如新冠病毒）时，需先进行逆转录步骤，原因是_____________________________________________________________________。 (3)PCR扩增后，需通过琼脂糖凝胶电泳检测产物，为什么要设置DNA分子量标准（Marker）？其作用是____________________________________________________________________。 （三）新情境探究 情境素材：随着分子育种技术的发展，实时荧光定量PCR（qPCR）技术被广泛应用于作物抗逆基因的检测。某科研团队培育了抗干旱玉米品种（导入抗干旱基因D），为验证该基因是否成功导入并表达，利用qPCR技术检测玉米叶片中D基因的表达量（表达量越高，抗干旱能力越强），同时设置未导入D基因的普通玉米作为对照，检测结果如下图所示（横坐标为玉米品种，纵坐标为D基因相对表达量）。其中，qPCR技术通过荧光信号的强度实时监测PCR扩增过程，荧光信号强度与PCR产物量成正比，可实现对目标基因的定量分析。回答下列问题： (1)利用qPCR技术检测D基因表达量时，为什么要选择玉米自身的管家基因（如 actin基因）作为内参基因？原因是____________________________________________________________________。 (2)qPCR技术中，荧光信号强度与PCR产物量成正比，其核心原理是什么？_______________________。 (3)若检测结果显示，抗干旱玉米品种的D基因相对表达量显著高于普通玉米，其对玉米抗干旱育种的意义是______________________________________________________________。 1．（2026·江苏南通·二模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码合成双乙酰的关键酶，GSH1基因编码合成谷胱甘肽的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如下图1，其中CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜（会破坏膜结构、影响酶活性）产生抗性。请回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因时，反应体系中需要加入缓冲液及图中相关物质外，还需要______等物质。设计P1的依据是______。 (2)已知P3的序列为5′-TGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTT-3′，则P2的序列为______。 ①5′-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3′ ②5′-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3′ ③5′-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3′ ④5′-GAGGAGCGAAAACCGAGAGAGCTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3′ (3)过程②将质粒2导入大肠杆菌的目的是______。 (4)转化后的啤酒酵母应置于含______的培养基中初步筛选。进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，优先选用图示引物1（30bp）和______进行PCR扩增，再对产物进行______鉴定。若扩增产物的大小为______，则说明CUP1基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 (5)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，部分结果如图2。 ①据图2分析，啤酒酵母工程菌生产的啤酒抗老化能力______。 ②请在答题纸指定区域画出工程菌双乙酰含量的变化曲线______并阐述理由______。 2．（2026·河北保定·一模）水蛭素(Hirudin)可预防和治疗血栓。研究发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。研究人员利用重叠延伸PCR 技术，替换 Hirudin基因的一个碱基对，获得“Hirudin改良基因”，再构建基因表达载体，以获得含有“Hirudin 改良基因”的重组DNA 分子。相关过程、质粒及限制酶的酶切位点如图所示(Amp'表示氨苄青霉素抗性基因)。请回答下列问题。 (1)利用PCR 技术扩增含有 Hirudin基因的片段时，复性温度下发生的过程是___________。延伸DNA片段需要用到___________酶。 (2)将 Hirudin基因诱变为 Hirudin改良基因的过程中，发生了碱基对的___________(填“增添”“缺失”或“替换”)。由图可知，引物2和引物3___________(填“完全”或“不完全”)互补配对。 (3)图中参与重叠延伸过程的两条 DNA单链为___________(从“1、2、3、4”中选择)，理由是___________。 (4)为将 Hirudin改良基因与质粒高效连接，需用限制酶___________切割目的基因。若将重组质粒导入大肠杆菌制备工程菌，首先需用含___________的培养液处理大肠杆菌，之后用含___________的培养基培养大肠杆菌，以筛选工程菌。 3．（2026·重庆·模拟预测）微藻中的SqME基因在烟草（双子叶植物）中异源表达后，可增强光合效率并促进脂质积累。而在SqME基因下游插入DNA片段N（转录后会被剪接）可显著提升SqME的表达量，进而提高脂质产量。某研究单位构建了SqME超表达载体，将其导入烟草用于生产生物柴油，流程如图所示。 (1)运用PCR技术从微藻中获取SqME基因，可选择的一对引物是______。若该引物较长且G-C碱基对比例高，在PCR扩增过程中可适当______复性温度，从而提高SqME基因扩增准确性。 (2)为了使DNA片段N正确插入Ti-SqME的表达载体上，需要在扩增N时所用的两种引物的5′端加上______（填限制酶）的识别序列。 (3)若采用农杆菌转化法将Ti-SqME-N表达载体导入烟草，需先将Ti-SqME-N表达载体导入农杆菌，在培养农杆菌的培养基加入______和______分别有利于提高转化效率和筛选导入了Ti-SqME-N表达载体的农杆菌。为将农杆菌中Ti-SqME-N表达载体导入烟草，具体的转化方法可以是__________（填一种即可）。另外还可以采用我国科学家独创的方法：______________，将Ti-SqME-N表达载体导入烟草中。 4．（2026·陕西商洛·二模）土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，通过全基因关联分析，科研人员定位了一个盐碱响应通路中的关键基因AT1，为研究高粱植株中AT1的作用，研究人员拟构建AT1过表达植株（AT1-OE）和AT1基因敲除植株（AT1-KO）。 (1)构建AT1-OE植株：以高粱cDNA为模板，通过PCR获取目的基因。将AT1基因插入Ti质粒的_____片段中，将重组质粒转入农杆菌与高粱愈伤组织共培养，筛选后经再分化获得完整植株。 (2)构建AT1-KO植株：以图1中AT1基因的上、下游片段构建重组质粒（图2），然后通过同源重组（重组质粒中的上、下游片段分别与高粱基因组中AT1基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除高粱植株中的AT1基因。具体构建过程如下： ①以高粱基因组DNA为模板，选择引物_____进行PCR扩增，用限制酶_____对PCR产物进行酶切后电泳，结果如图3，回收片段_____（填字母），再与HindIII酶切后的质粒大片段连接，获得重组质粒。 ②将重组质粒转入高粱愈伤组织，将愈伤组织置于含_____的平板上初步筛选，最终获得高粱植株。 ③初步鉴定：提取高粱植株的核DNA，选择引物1和引物4进行PCR，若电泳获得_____条条带，则对应植株为AT1基因敲除杂合子，通过自交获得敲除纯合子。 (3)检测植株在盐碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株_____，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在盐碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 5．（2026·山东青岛·一模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 (1)PCR1经过________轮循环可初步获得图中A片段，PCR2扩增GFP基因时需依据________设计引物R2，据图分析扩增目的片段时所用的引物F1和R2可对应下表中的________（填序号）。 ① 5´-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3´ ② 5´-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3´ ③ 5´-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3´ ④ 5´-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3´ 据以上表格提示PCR1和PCR2通常________（“能”或者“不能”）在同一反应体系中进行。 (2)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________（填“5´→3´或“3´→5´”）的方向水解DNA，其目的是形成________。过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是________，过程③所需的酶有________。 (3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。 A．不受限制酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基，不会出现移码突变 C．操作相对简单，成功率高 D．不需要使用PCR技术扩增目的基因 (4)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中________，了解PA的分布和含量。 学科网(北京)股份有限公司1 学科网(北京)股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 微专题7 PCR技术及其应用 目录 01 析·考情精解 1 02 构·知能架构 3 03 串·核心通络 3 核心整合 PCR技术及其应用 3 自查探针 4道真题选改判，“探”出薄弱点，“诊”明提分路！ 核心串讲 串讲1 PCR中引物的设计 串讲2 PCR技术引导基因定点突变 能力进阶 能力1 PCR技术的精准优化 能力2 PCR技术的场景化应用 04 破·题型攻坚 8 真题动向 引入科技前沿、农业生产实践等新情境、融合新概念反套路命题！ 命题预测 考向1 传统发酵技术的应用 考向2 微生物的实验室培养 考向3 分离特定微生物并测定其数量 考向4 分离特定微生物并测定其数量 05 拓·素养提升 38 素养链接 情境拓展、长句表达！ 高考预测 5道最新模拟，精准预测素养考向！ 命题轨迹透视 从近三年高考试题来看，考查题型：命题以选择题为主，偶有实验相关的填空题或简答题，单题分值多为2-3分，常融入基因工程、实验探究等综合情境中。命题趋势：早期命题侧重基础概念记忆，比如直接考查PCR技术的定义、基本步骤等。近年转向核心考点的深度理解，聚焦三类重点内容：一是PCR的原理与操作，像对比细胞内DNA复制与PCR的解旋方式、反应体系组分及消耗情况等；二是PCR的实践应用，常结合基因工程、病原体检测、基因型鉴定考查，如验证重组质粒构建、检测基因编辑结果等；三是实验分析，围绕PCR引物设计、电泳结果判断、实验误差分析等，涉及实验操作易错点。核心素养导向：从单纯考知识记忆转向核心素养的综合考查。生命观念上，通过PCR体外扩增DNA的过程，强化物质与能量观、结构与功能观；科学思维上，常通过实验现象推理PCR反应异常原因，或结合引物设计考查逻辑推理能力；科学探究上，聚焦PCR实验设计与结果分析，考查实验原理应用和探究能力，贴合高考“素养导向、能力为重”的命题要求。 高考命题风向 近三年高考中，PCR技术及其应用的命题呈现“情境新颖、考法灵活、角度多元”的鲜明特点，摆脱传统单一知识考查，更侧重核心素养与实践应用的综合测评，具体风向如下。 新情境：以临床检测、基因工程实践为核心情境，如结合阿尔茨海默病相关基因检测，考查PCR技术在异常基因扩增与诊断中的应用；关联新冠病毒、结核杆菌等病原体检测，考查RT-PCR（逆转录PCR）的原理的操作流程；借助基因编辑、亲子鉴定等实际场景，考查PCR扩增的条件与结果分析，让知识点落地于真实应用。 新考法：不再单独考核PCR的原理或步骤，而是将其与核酸、蛋白质及其他技术综合考查。例如结合核酸-蛋白质复合体，分析PCR扩增中引物与模板DNA的结合机制，关联DNA聚合酶的功能；或结合电泳技术，考查PCR产物的鉴定与结果分析，体现技术间的协同应用。 新角度：跳出“PCR基础操作”的常规考查，聚焦特殊场景与差异分析。比如对比PCR与细胞内DNA复制的差异，分析体外扩增无需解旋酶的原因；或考查特殊PCR技术（如巢式PCR、实时荧光定量PCR）的应用优势，结合具体需求判断技术选择；还会结合不同生物的核酸特点，考查PCR引物设计的针对性，凸显命题的深度与灵活性，贴合高考“素养导向、应用为王”的命题趋势。 考点频次总结 考点 2025年 2024年 2023年 PCR定点诱变技术RT－PCR、反向PCR 2025·云南·T15　 2025·山东·T24 2024·河北·T18 2023·辽宁·T25　 基因编辑技术及其应用 2025·安徽卷·T15　 2024·安徽卷·T20 2024·天津卷·T15 2024·新课标卷·T35 2023·湖北卷·T4 2023·辽宁卷·T18 2023·海南卷·T20 2026命题预测 预计在2026年高考中，PCR技术及其应用仍会以非选择题为主要考查形式，核心围绕PCR的原理、操作流程及应用等基础知识点出题。还可能设置易错陷阱，比如混淆PCR与细胞内DNA复制的解旋方式、误判PCR反应体系中不需要解旋酶、或将RT-PCR与常规PCR的步骤混淆等，以此考查学生对概念的精准把握。同时关联生活与科研：命题会依托生活场景或科研实例设计情境，比如结合新冠病毒、流感病毒等病原体的快速检测，考查RT-PCR的原理与应用；或引入基因编辑、亲子鉴定、遗传病筛查等科研与生活场景，考查PCR技术在基因扩增、结果鉴定中的作用；也可能以陌生科研信息为载体，给出新型PCR技术（如实时荧光定量PCR）的相关资料，让学生提取信息并结合PCR基础知识点分析问题，体现“题在书外，理在书中”的命题特点。PCR相关实验探究仍是高频考点，2026年可能考查实验原理（如PCR引物的作用、DNA聚合酶的功能）、操作细节（如PCR反应的温度控制、引物设计的原则），还可能给出异常实验现象让学生分析原因，比如PCR产物无条带可能是引物设计不合理或退火温度过高，以此考查学生的科学探究能力，贴合高考“素养导向、能力为重”的命题趋势。 核心整合 PCR技术及其应用 (1)(2025·河北卷)PCR过程中DNA双链的解旋涉及酶的催化作用。 ( ×) (2)(2024·河北卷)配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。 (×) (3)(2025·广东卷)为了确保PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'⁃羟基。 ( √ ) (4)(2025·山东卷)利用动物体细胞核移植技术培育转基因牛丁，可用PCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛。( √) 串讲1 PCR中引物的设计 核心设计要点 具体要求 关键说明 引物长度 长度控制在18-25个碱基，最常用20-22个；不要短于18个或长于25个 引物太长或太短，都会影响PCR扩增效果，要么结合不精准，要么扩增效率低 引物特异性 引物序列只能和目标片段结合，不能和其他无关片段结合 特异性差会导致扩增出无关片段，干扰目标结果，无法得到想要的DNA片段 特殊修饰 可根据需求在引物一端添加标记（如荧光），另一端不能修改 修改引物的扩增起始端（3’端），会直接导致PCR无法延伸，扩增失败 引物方向 一对引物要分别结合目标片段的两端，方向正确才能扩增出目标长度的DNA 引物方向颠倒，无法扩增出目标片段，整个PCR实验都会失败 【易错一笔勾销】 1、引物过长或过短，会导致扩增效率低或特异性差，出现非特异性条带。 2、一对引物Tm 值相差过大，会造成退火不同步，PCR 扩增失败或效率极低。 3、引物3’端碱基错配或不稳定，会直接导致 DNA 聚合酶无法正常延伸，扩增中断。 4、引物间或引物自身互补配对，易形成二聚体和发夹结构，抢占引物资源导致目的片段扩增不足。 5、引物特异性不足，会与非目标序列结合，扩增出无关片段，干扰实验结果。 串讲2 PCR技术引导基因定点突变 核心内容 具体说明（高中生易懂版） 注意事项 核心原理 利用PCR技术，在引物中引入预设的碱基变化（突变），通过PCR扩增，让突变碱基整合到目标基因中，最终获得带有特定突变的基因，不改变基因其他序列。 核心是“引物带突变，扩增传突变”，只改变目标位点，不破坏基因整体结构，避免随机突变。 核心材料 1. 模板DNA（含目标基因）；2. 带突变位点的特异性引物（关键）；3. DNA聚合酶；4. 缓冲液、dNTP（合成DNA的原料）。 引物是核心，突变位点必须设计在引物上，且引物其他部分要与模板DNA完全互补。 关键步骤 1. 设计带突变的引物（突变碱基放在引物中间或3’端）；2. 以原始基因为模板，进行PCR扩增，得到含突变的DNA片段；3. 筛选、验证，获得纯合的突变基因。 步骤2的PCR扩增要保证效率，避免未突变的原始基因残留；步骤3的验证是关键，确保获得的是目标突变基因。 常见突变类型 1. 点突变：单个碱基替换（如A→T）；2. 缺失突变：删除1-几个碱基；3. 插入突变：插入1-几个碱基（高中生重点掌握点突变）。 点突变最常用、最易操作，缺失/插入突变需控制碱基数量，避免破坏基因的正常功能。 【易错一笔勾销】 1、 突变位点设计在引物3’端，导致引物无法与模板结合，PCR 扩增失败。 2、 突变引物与模板互补区域太短，特异性差，容易出现非特异性扩增。 3、 上下游引物未同时引入对应突变，最终得到的 DNA 片段不携带完整突变。 4、 PCR 扩增后未去除原始模板 DNA，造成突变产物与野生型模板混杂，突变效率低。 5、 突变碱基设计不合理，导致引物自身折叠或形成二聚体，影响扩增与突变效果。 能力1 PCR技术的精准优化 能力解读 核心优化模块 能力解读 具体优化操作 避坑提醒 退火温度优化 基础能力：知晓退火温度影响引物结合；进阶能力：理解温度与特异性、扩增效率的关联，能根据引物特性微调温度，实现精准配对，杜绝非特异性结合。 控制退火温度在55-65℃，保证一对引物Tm值差值≤2℃；温度偏高提升特异性，温度偏低保证扩增效率，找到适配平衡点。 温度过高引物无法结合模板，温度过低引物乱配对，出现杂带、非目标片段扩增。 引物设计优化 基础能力：掌握引物基础参数；进阶能力：结合实验目的优化引物结构，规避无效结构，保障引物只靶向目标片段，这是PCR精准扩增的核心前提。 控制引物长度18-25bp，G+C含量40%-60%；避开3’端突变、连续相同碱基，防止引物二聚体和发夹结构。 引物3’端设计失误、自身互补配对，会直接导致PCR无法延伸或扩增失败。 反应浓度优化 基础能力：了解各试剂作用；进阶能力：把控试剂浓度配比，避免浓度失衡影响扩增效果，保证反应体系稳定，实现高效且精准的扩增。 引物终浓度0.1-1.0μmol/L且正反引物浓度一致；模板DNA浓度适中，dNTP和DNA聚合酶用量规范。 引物浓度过高易形成二聚体，浓度过低无扩增条带；模板过多会加重非特异性扩增。 典题示例（2025·江苏南通期调研）hNaDC3（人钠/二羧酸协同转运蛋白-3）主要分布于肾脏等重要器官。为进一步研究hNaDC3的生理功能，科研人员利用基因工程技术构建了绿色荧光蛋白（GFP）基因与hNaDC3基因的融合基因，其过程如图所示。相关叙述正确的是（　　） A.设计引物的目的是为了能够从其5'端开始连接脱氧核苷酸 B.设计引物P1和P2的依据是GFP基因两端的核苷酸序列 C.PCR扩增GFP和hNaDC3基因，经过1轮可形成所需的等长片段 D.杂交链延伸生成GFP-hNaDC3融合基因的过程中需要加入引物P1和P4 【答案】C　 【解析】子链延伸的方向是5'→3'，设计引物的目的是为了能够从其3'端开始连接脱氧核苷酸，A错误；结合图分析，设计引物P1和P2的依据是GFP基因两端的核苷酸序列以及引物P2和引物P3部分核苷酸序列的互补配对，B错误；PCR扩增GFP和hNaDC3基因，利用引物P1和引物P4经过1轮可形成所需的等长片段，C正确；杂交链延伸生成GFP-hNaDC3融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3'端，D错误。 能力2 PCR技术的场景化应用 能力解读 核心应用场景 能力解读 应用逻辑 易错提醒 基因工程 基础能力：知晓PCR可扩增目的基因；进阶能力：能结合基因工程流程，理解PCR在“获取目的基因”中的作用，能分析PCR与限制酶、DNA连接酶的配合逻辑，实现技术与知识点的关联。 利用PCR高效扩增目标基因片段，为基因克隆、基因表达（如转基因生物培育）提供足量的目的基因，替代传统提取方法，提高效率。 混淆PCR与基因工程其他步骤的作用，误认为PCR可直接实现基因导入；忽略PCR扩增的目的基因需进一步处理（如加酶切位点）。 遗传病检测 基础能力：了解PCR可检测基因突变；进阶能力：能结合遗传病病因（如单基因遗传病的碱基突变），理解PCR检测的原理，能区分PCR与其他检测方法的核心优势。 通过PCR扩增患者的目标基因片段，对比正常基因序列，判断是否存在致病突变（如镰状细胞贫血的碱基替换），实现遗传病的快速筛查。 误认为PCR可直接诊断遗传病，忽略“PCR扩增后需对比序列”的关键步骤；不清楚PCR的高灵敏度优势（可检测微量DNA）。 病原体检测 基础能力：知道PCR可检测病毒、细菌；进阶能力：能理解PCR“特异性扩增病原体DNA”的原理，结合疫情相关场景，解释PCR检测的高效性和准确性。 针对病原体（如新冠病毒、结核杆菌）的特有基因序列，设计特异性引物，通过PCR扩增该序列，若能扩增出条带，说明存在该病原体，实现快速检测。 混淆PCR检测与抗原检测的区别，误认为PCR可检测病原体抗原；忽略引物特异性对检测结果的影响（引物不特异会出现假阳性）。 基因定点突变 基础能力：回顾PCR引导基因定点突变的基础流程；进阶能力：能关联引物设计要点，理解PCR在突变中的核心作用，能分析突变后PCR的优化逻辑。 将突变碱基设计在引物上，通过PCR扩增，将突变碱基整合到目标基因中，实现基因的精准改造，用于研究基因功能或改良生物性状。 忘记“突变位点需设计在引物中间”的要点；忽略PCR扩增后需去除原始模板，导致突变效率低。 典题示例：用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，假设限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述正确的是（　　） A.用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到6个游离的磷酸基团 B.图1中X代表的碱基对数为4 500，Y是限制酶A的酶切位点 C.电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关 D.利用PCR技术从图1 DNA中扩增出等长的X片段，至少需要3次循环 【答案】BCD　 【解析】由题可知，图2中三列条带分别对应用A和B两种限制酶同时以及单独使用限制酶A、限制酶B处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，再通过①和②的结果结合图1，分析可知①是单独使用限制酶A处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，②是单独使用限制酶B处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果。限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段最终得到8个游离的磷酸基团，A错误；结合图1和图2中第一列A＋B酶同时处理的电泳条带结果分析可知，图1中X代表的碱基对数为4 500，根据图2中①电泳分离结果存在3 500 bp长度的条带可知①是单独使用限制酶A处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，再根据①电泳分离结果存在500 bp长度和6 000 bp长度的条带可知Y是限制酶A的酶切位点，B正确；电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关，C正确；设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要3次PCR，D正确。 1．（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（    ） A．1'-碱基 B．2'-氢 C．3'-羟基 D．5'-磷酸基团 命题解读 新情境：题目以Solexa高通量测序技术为背景，精准对接当下分子生物学科研热点，该技术是将PCR与荧光检测相结合的二代测序核心技术，依托“边合成边测序”的核心原理，广泛应用于基因组学、基因检测等科研领域，贴合高考“情境生活化、科研化”的命题导向。这种情境打破课本中PCR技术的孤立讲解，将PCR扩增与高通量测序、荧光检测等前沿技术结合，让考生感受到PCR技术在实际科研中的应用价值，凸显知识的实用性与前沿性。选项A、B、C、D均围绕脱氧核糖的结构特点设计，精准对应DNA聚合酶的催化特性，如选项C直接关联DNA聚合酶“只能从引物3'-羟基延伸DNA链”的核心特性，还原科研中“可逆末端终止”测序技术的关键原理，引导考生用课本基础知识点解读前沿科研技术的核心逻辑。 新考法：本题不只是单纯的PCR原理记忆题，更是科研素养与知识应用能力的测评题。正确选项C紧扣DNA聚合酶的催化机制，契合PCR技术“5'→3'延伸”的核心原理，同时关联Solexa测序中“可逆末端终止”技术的关键操作，落实“生命观念”和“科学思维”等核心素养。这种考法将PCR技术原理与DNA分子结构、酶的催化特性、前沿测序技术深度绑定，整合了分子生物学（DNA结构）、酶学（DNA聚合酶功能）、生物技术（高通量测序）等多领域知识。如分析各选项时，需串联脱氧核糖结构、DNA聚合酶催化特点、PCR延伸机制等知识点交叉判断，考查考生提取科研情境信息、关联课本知识、进行逻辑推理的能力，符合高考“综合性考查、能力为重”的命题趋势，体现“题在书外，理在书中”的命题特点。 【答案】C 【分析】在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的催化作用下，将一个个的脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯键，使子链延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′。 【详解】已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，C正确。 故选C。 2．（2025·江西·高考真题）天然色素可赋予稻米多样化颜色。为解析红色稻米品种ka的遗传机制，研究人员以连续自交表型均稳定遗传的纯合品种ka(红色)、Dr(白色)和Pu(白色)开展实验(本题涉及的基因名称依次定义为A/a、B/b……)。回答下列问题： (1)ka和Dr正反交，获得籽粒(F1)，种植后自交获得籽粒(F2)，F2自交获得F3，表型如下表，表明其遗传方式为母性影响(子代表型由母本的核基因控制)。完善表中表型数据。 亲本组合 F1 颜色 F2颜色 F3颜色 ♀ka(红)×♂Dr(白) 全红 全红 _______ ♀Dr(白)×♂Ka(红) 全白 ________ 红：白=3:1 (2)ka和Pu杂交，后代连续自交获得F3的表型比例为9红：3棕：4白，表明ka中籽粒颜色由两对基因控制，结出棕色籽粒的F2植株基因型为___________或___________。 (3)在定位好的A/a、B/b基因两侧设计PCR引物，引物对1和引物对2分别可扩增A/a、B/b全部序列。下图是对亲本ka、Dr、Pu和第(2)题中F2某个体PCR后电泳的结果。已知图中①为ka，②为Dr，可判断a基因由A基因发生___________突变形成；③结出的籽粒颜色是___________或___________。 (4) 回收第(3)题图中条带I和Ⅱ中的DNA，以speI(一种限制性内切核酸酶)处理，I中的DNA不能被切割，Ⅱ中的DNA被切割成4个片段，据此推测B基因突变为b基因的过程中至少有___________个碱基发生了突变。 命题解读 新情境：题目以红色稻米品种遗传机制解析为科研背景，精准对接农业育种与分子遗传学研究热点，将经典遗传规律与现代分子检测技术深度融合。该情境打破课本孤立知识点考查模式，以纯合水稻品系正反交、连续自交等真实育种实验为载体，串联母性影响、9:3:4 变式遗传、PCR 扩增、凝胶电泳、限制性内切酶酶切等核心知识，让考生在解析稻米颜色遗传的科研流程中，感受遗传学原理与分子技术在作物育种中的应用价值。题干围绕 ka、Dr、Pu 三个稳定遗传品系设计杂交实验，从表型比例推导遗传规律，再到分子水平验证基因突变，完整还原 “表型分析→遗传规律→分子验证” 的科研逻辑，凸显知识的实用性与科研性。 新考法：本题是遗传规律与分子技术的综合能力测评题，落实 “科学思维、科学探究、生命观念” 核心素养。考法上实现三大突破：一是特殊遗传规律深度考查，不局限于 9:3:3:1 常规比例，聚焦母性影响与9:3:4 基因互作变式，要求考生突破常规思维，推导子代表型与基因型关系，考查逻辑推理与知识迁移能力；二是分子技术与遗传分析深度融合，将 PCR、电泳、限制酶切等分子检测手段嵌入遗传题，通过条带差异判断基因型、推导突变类型，考查 “基因型 — 分子标记 — 表型” 的关联分析能力；三是科研思维与问题解决能力综合考查，从正反交实验设计、表型数据完善，到基因型推断、突变碱基数量计算，层层递进考查实验分析、信息提取与综合运用能力，契合高考 “综合性、应用性、创新性” 命题趋势，体现 “题在书外，理在书中” 的命题特点。 【答案】(1) 红：白=3：1 全红 (2) AAbb Aabb (3) 增添/插入 红 棕 (4)3/三 【分析】基因自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。 【详解】（1）分析题意可知，该性状的遗传方式为母性影响(子代表型由母本的核基因控制)，分析表格数据，组合1ka（红，设基因型为AA） × Dr（白，设基因型是aa），F₁基因型为Aa（由母本ka控制，籽粒全红），但F₂籽粒表型由F₁母本（Aa）决定，故全红，F₂植株基因型为1 AA ： 2 Aa ： 1 aa，但F₃籽粒表型由F₂母本决定：AA和Aa母本→籽粒红色（3/4），aa母本→籽粒白色（1/4），故最终表现为红 ： 白 = 3 ： 1；组合2Dr（aa） × ka（AA），F₁基因型：Aa（由母本Dr控制，籽粒全白，因母本为aa），F₁植株基因型为Aa，但F₂籽粒表型由F₁母本（Aa）决定，故全红。 （2）ka和Pu杂交，后代连续自交获得F3的表型比例为9红：3棕：4白，是9：3：3：1的变式，表明ka中籽粒颜色由两对基因控制，相关基因型是A/a、B/b，亲代ka(红)基因型是AABB，Dr(白)应为AAbb或aaBB，ka（AABB）和Pu（aabb）杂交，子一代基因型是AaBb，则F2个体中应为A-B-∶A-bb∶aaB-∶aabb=9∶3∶3∶1，且白色是隐性上位性状（此时纯合）对应基因型aa_，A和B同时存在时籽粒红色，A存在B不存在时为棕色， 可推测Ka(红色）、Dr(白色）和Pu(白色）基因型分别为AABB、aaBB和 aabb，据此可知结出棕色籽粒的F2植株基因型为AAbb或Aabb。 （3）结合（2）可知，亲代ka(红)基因型是AABB，Dr(白)为aaBB，Pu（aabb）杂交，已知引物对1和引物对2分别可扩增A/a、B/b全部序列，分析电泳图，①为ka，②为Dr，其中ka（①）引物对1长度为1320bp，而②Dr引物对1是1920bp，说明a基因由A基因发生增添/插入所致；③的基因型由电泳图分析为Aa_，显然不是Pu，④才是Pu，其基因型为 aabb，表明B/b基因长度一致，无法用电泳检测，则么③的基因型可能为 AaB_或Aabb，它所结出籽粒的颜色由这两种基因型决定，为红色或棕色。 （4）根据ka和Pu的基因型，条带I和II对应的基因分别为B和b，B基因对应的DNA序列不能被切割，b基因对应的DNA序列可 被切割为4个片段，表明B突变到b过程中出现了3个新的酶切位点，产 生一个新酶切位点至少要1个碱基发生突变，所以B基因突变为b基因的过程中至少有3个碱基发生了突变。 3．（2025·浙江·高考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 命题解读 新情境：题目以玉米雄性不育突变体的遗传解析为农业科研背景，精准对接作物育种与分子遗传学研究前沿。该情境打破课本孤立知识点考查模式，以雄性可育 / 不育性状的遗传分析为主线，串联基因突变类型、遗传规律推导、PCR 扩增、限制性内切酶酶切、凝胶电泳等核心知识，完整还原 “表型筛选→遗传分析→分子验证” 的科研流程浙江省教育考试院。题干围绕甲、乙、丙三个品系设计杂交实验，通过后代性状分离比推断基因显隐性与遗传方式，再利用分子标记（PCR - 酶切电泳）定位基因型，让考生在解决农业育种实际问题中，感受遗传学原理与分子技术的应用价值，凸显 “端牢中国饭碗” 的学科社会责任浙江省教育考试院。 新考法：本题是遗传规律与分子技术深度融合的综合能力测评题，全面落实 “科学思维、科学探究、生命观念” 核心素养。考法上实现三大突破：一是特殊遗传场景与突变类型综合考查，整合碱基替换、插入突变等基因突变形式，结合性状分离比推导显隐性、基因型与基因频率，考查逻辑推理与数据处理能力；二是分子技术与遗传分析一体化设计，将 PCR 引物设计、酶切位点分析、电泳条带解读与遗传题深度绑定，通过分子标记结果反推基因型与突变类型，考查 “基因型 — 分子标记 — 表型” 的关联分析能力；三是实验探究与综合应用能力进阶考查，涵盖遗传图解书写、实验方法拓展、PCR 原理正误判断等多维度设问，从知识记忆转向原理理解与问题解决，符合高考 “综合性、应用性、创新性” 命题趋势，体现 “题在书外，理在书中” 的特点。 【答案】(1) 碱基对替换 终止密码子提前 (2) 隐性 E2E2 2/两/二 1/3 1/4 (3) (4)测交，自交，核酸分子杂交，基因测序 (5)C 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，过程包括：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）由图1可知，E1基因与E基因相比，由于碱基对替换，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。由图1可知，E2基因与E基因相比，编码区增加了插入序列，结果编码的蛋白质中氨基酸数目减少，说明翻译提前终止，故反推出编码区增加了插入序列，导致mRNA上终止密码子提前。 （2）由题意可知，甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，即F2中雄性可育：雄性不育=285：94≈3：1，可知雄性不育为隐性性状，雄性可育为显性性状。甲基因型为EE，故图2中b片段对应E基因，E2基因长度大于E1，故a片段为E2，E1内部存在限制酶SnaBⅠ的识别序列，可被切割为c和d，据此可知乙的基因型为E2E2，丙的基因型为E1E1。甲×丙产生的F1的基因型为EE1，故其可产生2种类型的雌配子，分别是E、E1，F1自交，F2中的基因型及比例为EE：EE1：E1E1=1：2：1，其中EE、EE1雄性可育，因此F2可育植株中纯合子占1/3。由图2可知戊的基因型为E1E2，甲×戊的F1的基因型及比例为EE1：EE2=1：1，F1均可育，随机交配，基因频率不变，因此F2中E1的基因频率与F1中的相同，为1/2×1/2=1/4。 （3）由图2可知戊的基因型为E1E2，雄性不育，可作母本，产生两种类型的雌配子，分别是E1：E2=1：1；丁基因型为EE1，雄性可育，可作父本，产生两种类型雄配子，分别是E：E1=1：1，雌雄配子随机结合，F1的基因型为EE1：EE2：E1E1：E1E2=1：1：1：1，其中EE1和EE2为雄性可育，E1E1和E2E2为雄性不可育，因此丁×戊获得F1的遗传图解为： （4）鉴定基因有无常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、基因测序等，同时也可采用自交和杂交的方法进行鉴定，如含不育基因的杂合子EE1或EE2，测交后代雄性可育：雄性不育=1：1；自交后代雄性可育：雄性不育=3：1。 （5）A、PCR反应中的引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸，A正确； B、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，因此若图2中胶板的上端是电泳时的负极，电泳时DNA片段由负极向正极泳动，B正确； CD、在PCR扩增中，1对引物中的每个引物P1和P2分别结合互补的链后进行延伸。每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得24=16个双链DNA分子，其中的15个双链DNA分子都有1条链结合P1引物。若用32P标记引物P1，可获得15条含32P标记的DNA单链，其中第1次扩增时，与P2引物结合的链最终形成的双链DNA分子没有被32P标记。同时获得长度为b，即目的基因片段长度的双链DNA分子为24-2×4=8个。C错误，D正确。 故选C。 4．（2025·河北·高考真题）T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。回答下列问题： (1)基因内碱基的增添、缺失或_____都可导致基因突变。 (2)以Aa植株为_____（填“父本”或“母本”）与野生型拟南芥杂交，F1中卡那霉素抗性植株的占比为0，其反交的F1中卡那霉素抗性植株的占比为_____。 (3)为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，该植株会产生_____种基因型的可育花粉，其中具有a基因的花粉占比为_____。该植株自交得到F1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型植株占比为_____。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为_____。 (4)实验中还获得了一个E基因被T-DNA插入突变为e基因的植株，e基因纯合的种子不能正常发育而退化。为分析基因E/e和A/a在染色体上的位置关系，进行下列实验： ①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出基因型为_____的F1植株。 ②选出的F1植株自交获得F2．不考虑其他突变，若F2植株中花粉和自交所结种子均发育正常的植株占比为0，E/e和A/a在染色体上的位置关系及染色体交换情况为_____；若两对基因位于非同源染色体，该类植株的占比为_____。除了上述两种占比，分析该类植株还可能的其他占比和原因：_____。 命题解读 新情境：题目以T‑DNA 插入失活技术研究拟南芥基因功能为前沿科研背景，精准对接分子遗传学与植物基因工程研究热点。该情境打破课本孤立知识点考查模式，以A/a、E/e 两对基因的遗传与功能验证为主线，串联基因突变类型、花粉不育的特殊遗传效应、外源基因插入、PCR‑电泳分子检测、基因连锁与交换等核心知识。题干围绕拟南芥雄性不育、种子发育异常等真实科研问题设计实验，从正反交验证花粉不育效应，到外源基因插入后的配子分析，再到两对基因位置关系探究，完整还原 “基因诱变→遗传分析→分子验证→基因定位” 的科研流程，让考生在解决植物基因功能研究的实际问题中，感受分子技术与遗传规律的融合应用，凸显生物学研究的科学性与实用性。 新考法：本题是分子技术与遗传规律深度融合的综合能力测评题，全面落实 “科学思维、科学探究、生命观念” 核心素养。考法上实现三大突破：一是特殊遗传效应深度考查，聚焦花粉不育、种子纯合致死等特殊遗传现象，突破常规孟德尔遗传比例，考查考生对特殊遗传条件下配子形成、受精过程与后代比例的逻辑推理能力；二是分子技术与遗传分析一体化设计，将T‑DNA 插入、PCR 引物设计、电泳条带解读与遗传题深度绑定，通过分子标记结果反推基因型、验证基因功能，考查 “基因型 — 分子标记 — 表型” 的关联分析能力；三是基因定位与综合探究能力进阶考查，从单基因遗传到两对基因位置关系分析，涵盖正反交实验、配子类型计算、自交后代比例推导、基因连锁与交换判断等多维度设问，从知识记忆转向原理理解与问题解决，符合高考 “综合性、应用性、创新性” 命题趋势，体现 “题在书外，理在书中” 的特点。 【答案】(1)替换 (2) 父本 1/2 (3) 3 1/3 2/3 a花粉不育，无法形成纯合aa植株 (4) AaEe E/e和A/a连锁且无交换，F₂中无同时含A和E的配子 1/6 若基因连锁但发生交换，正常植株占比介于0～1/6 【分析】自由组合定律的实质：控制不同性状的遗传因子的分离和组合是互不干扰的；在形成配子时，决定同一性状的成对的遗传因子彼此分离，决定不同性状的遗传因子自由组合。 【详解】（1）基因突变是指DNA分子上碱基对增添、缺失或替换引起基因结构的改变。基因内碱基的增添、缺失或替换都可导致基因突变。 （2）据题分析可知，带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能缺失（a基因）会导致不育，因此Aa植株作为父本时，其含a基因花粉不育，无法参与受精，仅产生含A基因的花粉，故以Aa植株为父本与野生型（AA）拟南芥杂交，F1（AA）中卡那霉素抗性植株的占比为0；若Aa植株作为母本，其卵细胞可育（含a基因），而野生型父本花粉（含A基因）可育，F1基因型为Aa（抗性）和AA（非抗性），比例为1：1，因此卡那霉素抗性植株占比为1/2。 （3）为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，插入A基因后，植株基因型为Aa（2号染色体为Aa，3号染色体为A0）。该植株会产生4种基因型的花粉，即AA、A0、Aa、a0，其中a不育，即产生3种可育基因型的花粉，而具有a基因的花粉占比为1/3。该植株雌配子即AA、A0、Aa、a0，均可育，其自交得到F1，利用棋盘法可知，F1的基因型为AAAA：AAA0：AA00：AAAa：AAa0：AAaa：Aa00：Aaa0=1∶2∶1∶2∶3∶1∶1∶1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型（含A、a）：PCR扩增出900bp（A）和600bp（a）条带。Ⅱ型（仅含A）：仅扩增出900bp条带。其中Ⅰ型植株占比为（2+3+1+1+1）/（1+2+1+2+3+1+1+1）=2/3。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为a花粉不育，无法形成纯合aa植株。 （4）①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出F1中AaEe植株（双杂合）。若E/e和A/a连锁且无交换，F2中无同时含A和E的配子（花粉或种子致死），正常植株占比为0。若两基因独立遗传（非同源染色体），F1植株（AaEe）产生雌配子为AE：Ae：aE：ae=1：1：1：1，均可育，而雄配子AE：Ae=1；1，aE和ae不可育，利用棋盘法可知，F2为AAEE：AAEe：AaEE：AaEe=1：2：1：2，其中只有AAEE的花粉和自交所结种子均发育正常，即正常植株（AAEE）占比为1/6。其他可能：若基因连锁但发生交换，正常植株占比介于0～1/6。 5．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3) 通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 命题解读 新情境：题目以小麦种子休眠与穗发芽防控的农业科研为背景，精准对接作物遗传改良与分子育种前沿。该情境打破课本孤立知识点考查模式，以农杆菌转化法、T‑DNA 插入突变、基因功能验证为主线，串联Ti 质粒结构、限制酶选择、黏性末端补平、重组质粒鉴定、PCR 扩增、DNA 测序与比对等核心知识。题干围绕小麦种子休眠基因的插入失活突变体筛选、基因定位与功能验证设计实验，完整还原 “载体构建→遗传转化→突变体筛选→基因定位→功能验证” 的科研流程，让考生在解决农业生产中穗发芽防控的实际问题中，感受基因工程技术在作物育种中的应用价值，凸显生物学服务农业生产的社会责任。 新考法：本题是基因工程技术与分子遗传分析深度融合的综合能力测评题，全面落实 “科学思维、科学探究、生命观念” 核心素养。考法上实现三大突破：一是技术流程与原理深度融合，聚焦Ti 质粒改造、限制酶选择、黏性末端补平、重组质粒鉴定等基因工程关键操作，突破常规记忆性考查，要求考生结合示意图分析酶切位点、判断重组方向，考查对技术原理的精准理解与应用能力；二是分子检测与遗传分析一体化设计，将PCR 扩增、电泳分析、DNA 测序与比对与基因定位、功能验证深度绑定，通过分子标记结果判断突变基因是否为同一基因，考查 “基因型 — 分子标记 — 表型” 的关联分析能力；三是实验探究与综合应用能力进阶考查，从单基因功能验证到基因定位分析，涵盖载体构建、分子检测、结果分析等多维度设问，从知识记忆转向原理理解与问题解决，符合高考 “综合性、应用性、创新性” 命题趋势，体现 “题在书外，理在书中” 的特点。 【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3)不能 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 6．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】(1) 序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 7．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落________（填序号），出现菌落④的可能原因是________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路________。 【答案】(1) 稀释涂布平板法 探究内生放线菌最适的营养条件和温度 (2) 指数级扩增 ② 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中 (3) 设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测 【分析】基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 【详解】（1） 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是为了探究内生放线菌最适的营养条件和温度。 （2）PCR技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、延伸），使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R基因 (2000bp) + R-D (500bp) = 3000 bp。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R-D (500bp) = 1000 bp。对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒（大小为3000bp质粒骨架 + 500bp R-U + 500bp R-D = 4000bp）整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp)，即 3000 + 4000 = 7000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。 （3）设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低铁）浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。预期结果与结论： 如果实验组（高铁培养基）中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组（低铁培养基）中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。 8．（2025·全国二卷·高考真题）东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 (1)研究发现，东方果蝇中dsx基因______出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 (2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是______（选填字母）。 ②由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为______（填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是______。 (3)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的端和端_____ ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）， ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若______，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在______℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 【答案】(1)转录 (2) ad C 在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡 (3) 18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，东方果蝇中dsx基因（DNA）通过转录形成前体RNA，故前体RNA是由dsx基因转录出的。 （2）①用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游和下游，根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是ad。 ②RTA基因表达出的蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为C。而在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡，因此雄性个体不会致死。 （3）①图2虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3’端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下： 。 ②由题意可知：RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）（全为转基因雄性果蝇）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若G1具有cs效应，则18℃组雄性个体所占比例小于29℃组。 ⅳ：在18℃时可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培养具有cs效应的G1果蝇。 能力01 PCR中引物的设计 1．基因PCR定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR是发展最早的定点突变技术，其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（    ） A．蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质 B．应将引物1、2与引物3、4置于两个独立的反应体系中 C．步骤④使用DNA聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸 D．步骤⑤中如果完成6轮循环一共需要消耗63个引物1 【答案】C 【详解】A、蛋白质工程是通过改造基因来设计具有新功能的蛋白质，能够创造自然界中原本不存在的蛋白质，A正确； B、引物1、2用于扩增含突变位点的上游片段，引物3、4用于扩增含突变位点的下游片段。若将四组引物置于同一反应体系，会导致引物交叉结合、干扰PCR产物的特异性，因此需在两个独立的反应体系中分别扩增上下游片段，B正确； C、步骤④使用DNA聚合酶可对分子乙进行延伸，甲不可延伸，C错误； D、PCR过程中，引物的消耗数量为2n+1－2（n为循环数），初始模板不消耗引物。6轮循环后，总产物数为27－2=126，因此消耗的引物1数量为126÷2=63，D正确。 故选C。 2．SYBR是一种荧光染料，其与双链DNA结合后会发出荧光，未与双链DNA结合的SYBR不会发出荧光。科研小组在PCR反应管①、②中加入模板DNA、耐高温的DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、H2O、过量SYBR以及不同引物，进行PCR反应后观察荧光现象。模板DNA及引物序列如下表所示。下列叙述错误的是（    ） 模板DNA序列 —ATGCGTAATC……TCCGAGTAC— 反应管①中引物序列 —ATGCGTAATC—   —GTACTCGGA— 反应管②中引物序列 —CCGCGTAATC—   —GGACTCGGA— 注：“……”为未写出的序列，表中引物与模板DNA中未写出序列不会发生特异性结合。 A．反应管①PCR产物电泳后，可进行二苯胺染色以判断DNA条带位置 B．反应管②中引物序列不能与模板链完全碱基互补，仍会出现荧光现象 C．调节反应管①②的退火温度，可使两支反应管中出现相似的荧光强度 D．SYBR可用于比较不同PCR反应中反应管DNA模板初始含量的差异 【答案】A 【详解】A、二苯胺染色是一种用于溶液中DNA定性的比色法，需要沸水浴加热，通过颜色变化（蓝色）检测DNA，但无法用于琼脂糖凝胶电泳后DNA条带位置的判断；凝胶电泳中常用溴化乙锭（EB）或SYBR类荧光染料进行染色，在紫外灯下观察荧光条带，A错误； B、反应管②中引物序列（5'-CCGCGTAATC-3'和5'-GGACTCGGA-3'）与模板DNA（5'-ATGCGTAATC...TCCGAGTAC-3'）不完全碱基互补，导致扩增效率低或无特异性扩增；但PCR反应初始时存在双链模板DNA，SYBR与之结合可发出荧光，因此PCR后仍会出现荧光现象，B正确； C、调节退火温度可影响引物与模板的特异性结合：反应管①在最佳退火温度下扩增效率高，荧光强度大；反应管②在较低退火温度下可能发生非特异性结合和扩增，产生一定量双链DNA，出现荧光。通过调整退火温度（如提高温度使管①扩减少，或降低温度使管②非特异性扩增增加），可使两支反应管的荧光强度相似，C正确； D、SYBR与双链DNA结合后荧光强度与DNA量成正比，在实时荧光定量PCR（qPCR）中，通过监测荧光信号（如Ct值）可比较不同反应管中DNA模板初始含量的差异，D正确。 故选A。 3．反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如图。下列叙述正确的是（　　） A．PCR过程周期性改变温度是为了调控Taq DNA聚合酶活性 B．反向PCR过程中主要是以已知序列L作为DNA复制的模板 C．PCR过程需添加引物1和引物4以便DNA聚合酶延伸子链 D．PCR扩增的未知序列是否正确可以用二苯胺水浴加热来鉴定 【答案】C 【详解】A、PCR过程周期性改变温度不是为了调控Taq DNA聚合酶活性，而是为了让DNA分子的双链在不同温度下能够解开螺旋或恢复螺旋，A错误； B、据图可知，反向PCR过程中主要是以未知序列作为DNA复制的模板，B错误； C、DNA聚合酶从引物的3′端延伸子链。根据图中3'、5'的相关信息可知，PCR过程需添加引物1和引物4，以便沿着正确的方向延伸子链，从而实现未知序列的大量扩增，C正确； D、二苯胺水浴加热只能证明是否存在DNA分子，无法知道碱基序列，所以PCR扩增的未知序列是否正确不能用二苯胺水浴加热来鉴定，D错误。 故选C。 4．根据某基因上游和下游的碱基序列，设计合成了用于该基因PCR的两段引物（单链DNA）。引物与该基因变性DNA（单链DNA）结合为双链DNA的过程称为复性。下图是两引物的Tm（引物熔解温度，即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度）测定结果，以下分析错误的是（　　） A．PCR过程中，复性温度应高于引物的Tm值以提高PCR效率 B．两引物分别与DNA的两条互补单链结合，是子链延伸的起点 C．若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的（G+C）含量较高 D．适当减少引物2的脱氧核苷酸数，可使其Tm值接近引物1 【答案】A 【分析】分析曲线图：引物2的Tm高于引物1，说明引物2的热稳定性较高。 【详解】A、PCR过程中，复性温度应低于引物的Tm值以提高PCR效率，A错误； B、PCR过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链互补结合，合成的子链在DNA聚合酶的作用下进行延伸，所以两引物分别与DNA的两条互补单链结合，是子链延伸的起点，B正确； C、DNA含有的氢键数越多，其热稳定性越高，而A和T碱基对间有两个氢键，C和G碱基对间有三个氢键，曲线图显示：引物2的Tm高于引物1，说明引物2的热稳定性较高，因此若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的（G+C）含量较高，C正确； D、适当减少引物2的脱氧核苷酸数，会降低引物2的热稳定性，可使其Tm值接近引物1，D正确。 故选A。 5．根据PCR的原理，复性温度要根据引物确定，下列说法错误的是（    ） A．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基互补配对的短单链核酸 B．引物偏长，则复性温度要相应地降低 C．引物设计的过短或者过长都可能会导致非特异性扩增 D．在一定温度范围内，提高复性温度可以增强PCR的特异性 【答案】B 【分析】PCR是利用DNA在体外95℃左右高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着5'-3'的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，A正确； B、引物偏长时，由于碱基配对增多，引物与模板DNA的结合更稳定，因此复性温度应提高，B错误； C、引物设计过短，特异性差，易与非目标序列结合，过长时，可能形成二级结构或与非特异序列结合，两者均可能导致非特异性扩增，C正确； D、在一定温度范围内，提高复性温度可增强引物与目标序列结合的严格性，减少非特异性结合，从而提高PCR的特异性，D正确。 故选B。 能力02 PCR技术与电泳 6．PCR与琼脂糖凝胶电泳是分子生物学中非常重要的实验，下列叙述错误的是（　　） A．利用PCR技术扩增目的基因时，通常需要进行预实验来确定合适的退火温度 B．待分离的DNA片段较小时，配制的琼脂糖溶液的浓度应该适当提高 C．琼脂糖在沸水浴中加热至熔化，待溶液稍冷却后，加入适量的核酸染料 D．基因工程的基本操作程序中，琼脂糖凝胶电泳只能对PCR产物进行分离、鉴定和纯化 【答案】D 【详解】A、退火温度会影响PCR扩增的特异性和效率，不同引物对应的适宜退火温度存在差异，通常需要通过预实验确定合适的退火温度，A正确； B、琼脂糖浓度越高，凝胶孔径越小，分离较小的DNA片段时，提高琼脂糖浓度可缩小孔径，更利于小片段的分离，B正确； C、核酸染料在高温下易分解失效，因此需待熔化的琼脂糖溶液稍冷却后再加入核酸染料，避免染料结构被破坏，C正确； D、琼脂糖凝胶电泳的应用范围广泛，除PCR产物外，还可对酶切后的DNA片段、重组质粒等各类核酸样品进行分离、鉴定和纯化，并非只能处理PCR产物，D错误。 故选D。 7．STR是真核生物基因组DNA中长度为2～6bp的短串联重复序列（如“…GTGTGT…”），常用于遗传标记。生物的基因组DNA中有很多个STR，分布在不同位置，每个STR的序列重复数均不同。研究人员从野外动物粪便中提取基因组DNA（混杂宿主与环境微生物等多种序列），利用PCR和电泳技术可实现个体识别，该技术可行的前提不包括（    ） A．电泳可以确定STR的碱基序列 B．粪便中的STR不被微生物彻底降解 C．不同个体间STR的差异可以稳定存在 D．已知STR上游和下游的部分碱基序列 【答案】A 【详解】A、电泳无法确定STR的碱基序列，但可以区分STR的长度(短串联重复序列的重复次数)，A正确； B、粪便中的STR不能被微生物彻底降解，否则检测不到结果，B错误； C、不同个体间STR的差异必须稳定存在，才能根据检测结果的不同确认为不同个体，C错误； D、已知STR上游和下游的部分碱基序列才能设计引物将STR通过PCR扩增出来，D错误。 故选A。 8．某研究小组针对植物抗逆基因进行了以下实验：首先从耐旱植物叶片中提取总DNA，再利用PCR技术扩增抗逆基因，最后通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测与鉴定。下列实验操作正确的是（　　） A．叶片研磨液置于4℃冰箱中几分钟后，需充分摇匀再进行提取 B．PCR实验中设置75摄氏度的目的是便于引物与模板链结合 C．配制琼脂糖凝胶浓度时需要考虑待分离的抗逆基因片段的大小 D．通过电泳鉴定PCR产物时，正常情况下会出现5条DNA带 【答案】C 【详解】A、叶片研磨液置于4℃冰箱中静置是为了使细胞碎片等杂质沉淀，此时若摇匀会重新混入杂质，影响DNA纯度，应取上清液进行后续提取，A错误； B、PCR实验中75℃的温度属于延伸阶段（Taq酶最适温度约72℃），而引物与模板结合发生在退火阶段（通常50-60℃），B错误； C、琼脂糖凝胶浓度影响DNA迁移速率，浓度越高，小片段分离效果越好，反之适合大片段。因此需根据目标基因片段大小选择合适浓度，C正确； D、PCR扩增特异性产物时，正常情况应仅出现目标DNA条带（可能含少量引物二聚体），但“5条带”明显异常，说明非特异性扩增或污染，D错误。 故选C。 9．图甲表示限制酶切割某双链DNA分子的图示，其中Y为某种限制酶，X表示切割的DNA长度，限制酶对应切点一定能切开。图乙表示图甲用不同酶切后的产物电泳分离结果。下列相关叙述正确的是（　　） A．若经电泳分离后图乙没有相应电泳条带，则是PCR中延伸温度太高所致 B．由图可知，限制酶A、限制酶B分别酶切产生的黏性末端的碱基能互补配对 C．根据图乙中酶切电泳分离结果可推测，Y为限制酶B，X长度为4500bp D．限制酶A酶切电泳结果与图乙中的①相符，限制酶B酶切电泳结果与图乙中的②相符 【答案】D 【详解】A、若PCR反应没有扩增出任何产物，则可能的原因是复性、延伸温度太高，也可能是引物设计出现问题等，A错误； B、酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，故限制酶A与限制酶B产生的黏性末端不一定能互补配对，B错误； C、从图乙的A+B酶一组结果可知，限制酶A和B切完后总共有4个片段，长度分别为500、1500、3500、4500，可得出X代表的碱基对数为4500，①电泳结果6000、3500、500，②电泳结果8000、2000，可推测①是限制酶A，Y为限制酶A，C错误； D、根据以上结论，图甲中有两个限制酶A的酶切位点，切割完后得到三个长度的片段：3500、（4500+1500）、500，正好与图乙中的①结果相符，故推测图乙中①是限制酶A处理得到的酶切产物，②是限制酶B酶切电泳结果，D正确。 故选D。 10．研究发现，HIV通过细胞膜上的A蛋白侵染人体细胞，同时发现若A基因缺失了32个特定碱基对会导致A蛋白异常，从而aa个体天然免疫HIV。现为了快速辨别甲、乙、丙个体的基因型，用引物F和R分别对三人的基因组进行PCR，每组PCR产物都分为两份，一份直接电泳，一份用ApoI酶切割后电泳，结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．2号加样孔中的样品均为PCR产物直接电泳结果 B．乙个体两个加样孔条带一致可能是ApoI酶失活导致 C．测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列 D．DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关 【答案】B 【分析】题干信息分析，A基因和a基因碱基对数量不同，直接电泳形成两种条带，根据图示可知，A基因具有Apol酶切位点，A基因被酶切后经过电泳会形成两个条带，a基因不能被酶切，因此PCR产物直接电泳最多有两个条带，用Apol切割后电泳最多有三个条带，1号加样孔是用Apol切割后电泳结果，2号加样孔是直接电泳的结果。 【详解】AC、A基因和a基因碱基对数量不同，电泳形成两种条带，根据图示可知，A基因具有Apol酶切位点，A基因被酶切后经过电泳会形成两个条带，a基因不能被酶切，因此PCR产物直接电泳最多有两个条带，用Apol切割后电泳最多有三个条带，而甲的1号加样孔有三个条带，说明1号加样孔是用Apol切割后电泳结果，2号加样孔是直接电泳的结果。由于a基因是A基因缺失了32个特定碱基对突变而来，A基因分子更大，电泳时移动速度更慢，故3表示A基因，4表示a基因，测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列，AC正确； B、根据乙的1号加样孔用ApoI酶切割后电泳的产物可知，该个体的基因型为aa，由于a基因不能被ApoI酶切，因此出现乙个体两个加样孔条带一致的情况，B错误； D、DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关，D正确。 故选B。 能力03 PCR技术引导基因定点突变 11．研究人员利用基因工程技术编辑基因L，培育抗盐碱的大豆新品系。在载体上的限制酶Bsa I切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因L使其定点突变，以获得抗盐碱特性。载体信息及酶切位点如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．Bsa I酶对载体进行酶切后，载体上产生的黏性末端为5'-ATTG-3' 及5'-GTTT-3' B．使用含卡那霉素的培养基筛选导入重组载体的大豆细胞 C．对目标基因L进行PCR扩增，经3次循环后可获得两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 D．将转基因大豆与普通大豆共同种植于盐碱地，对比观察确定是否赋予大豆抗盐碱的特性 【答案】A 【分析】1、基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 2、PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用PCR可以快速的获取和扩增目的基因。 【详解】A、据图可知，用Bsa l酶对载体进行酶切后，载体上保留的黏性末端为5'-CAAT-3' 及5'-GTTT-3'，A错误； B、卡那霉素抗性基因位于T－DNA上，因此可以使用含卡那霉素的培养基筛选出成功导入的细胞，获得重组植株，B正确； C、PCR扩增经3次循环可获得具两条脱氧核苷酸链等长DNA片段，C正确； D、进行个体水平的鉴定，即检测是否具有抗盐碱性，即将转基因大豆与普通大豆共同种植于盐碱地，对比观察确定是否赋予大豆抗盐碱的特性，D正确。 故选A。 12．基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术。下图为利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是（    ） A．由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成 B．酶① 应为耐高温DNA聚合酶，引物X和Y应该为引物2和4 C．可以将引物1、引物2、引物3和引物4置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应，进而缩短实验时间 D．利用图示流程技术可以将两个不同的基因拼接到一起 【答案】C 【分析】PCR是一项体外复制DNA的技术，利用的原理是DNA的双链复制。 【详解】A、基因控制蛋白质的合成，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成，A正确; B、酶① 要在高温条件下延伸DNA，所以酶① 为耐高温的DNA聚合酶，由图可知，要得到两条链一样长的DNA单链，应选择引物2和引物4，所以引物X和Y应该为引物2和4，B正确; C、由图可知，引物1和引物3存在互补配对片段，置于同一个反应系统时它们会发生结合而失去作用，C错误； D、图示的过程为重叠延伸PCR技术，利用重叠互补引物将两个不同的基因拼接到一起，D正确。 故选C。 13．乳腺癌严重威胁着人类的健康。癌细胞需要从内环境吸收天冬酰胺，使用外源天冬酰胺酶降解内环境中的天冬酰胺可抑制癌细胞增殖，正常细胞能合成天冬酰胺，受影响较小。回答下列问题： (1)使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入_________等天然成分。与正常组织细胞不同，乳腺癌细胞因失去_________特性，可在培养瓶中堆叠生长。培养箱中通入CO2的主要作用是_________ (2)天冬酰胺酶具有一定水解谷氨酰胺的酶活性，长期使用会对正常细胞造成损伤。为降低天冬酰胺酶的副作用，可通过_________工程改造其结构。已知天冬氨酸密码子为GAU/GAC，甘氨酸密码子为GGU/GGC/GGA/GGG，若通过单个碱基对的替换将天冬酰胺酶中第50位的天冬氨酸（见图1）替换为甘氨酸，需将模板链中5'-GTC-3＇序列突变为5'_________3'。 (3)为实现单碱基对的定点突变，应选用引物_________（填编号）对质粒1进行全质粒扩增。全质粒扩增产物为线性DNA，从DNA聚合酶作用角度分析，原因是_________。在去除模板质粒的PCR产物中加入_________以得到质粒2.将质粒1和质粒2分别导入大肠杆菌后，可用___法检测目的基因是否表达成功。 (4)图2显示了改造前后的天冬酰胺酶对两种氨基酸的水解活性，据图分析改造后的酶作为候选药物的优势为_________。 【答案】(1) 血清 接触抑制 维持培养液的pH (2) 蛋白质 5'-GGC-3' (3) 2和3 DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3'端，不能将线性DNA相连 DNA连接酶 抗原—抗体杂交 (4)与改造前相比，改造后的天冬酰胺酶水解天冬酰胺的酶活性显著提高、水解谷氨酰胺的酶活性明显降低，说明显著提高了对癌细胞增殖的抑制作用，降低了长期使用对正常细胞造成损伤的副作用。 【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由于人们对动物细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入血清等天然成分。癌细胞具有无限增殖的能力，培养癌细胞的过程中不会发生接触抑制现象。可见，与正常组织细胞不同，乳腺癌细胞因失去接触抑制的特性，可在培养瓶中堆叠生长。培养箱中通入CO2的主要作用是维持培养液的pH。 （2）天冬酰胺酶的化学本质为蛋白质，可通过蛋白质工程改造其结构。编码第50位的天冬氨酸模板链中对应的碱基序列为5'-GTC-3'，则mRNA中对应的天冬氨酸密码子为5'-GAC-3'。若通过单个碱基对的替换将第50位的天冬氨酸替换为甘氨酸，则甘氨酸密码子应为5'-GGC-3'，因此需将模板链中5'-GTC-3＇序列突变为5'-GGC-3'。 （3）PCR的子链延伸方向是5′→3′，引物必须与模板链的3′端结合，才能保证子链从引物的3′端（-OH）开始延伸，所以为实现单碱基对的定点突变，应选用引物2和引物3对质粒1进行全质粒扩增。由于DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3'端，不能将线性DNA相连，所以全质粒扩增产物为线性DNA。在去除模板质粒的PCR产物中加入DNA连接酶，能够将产物的两端连接形成闭环，以便得到质粒2。若目的基因在受体细胞内控制合成了相应的蛋白质，则表明目的基因表达成功，可采用抗原—抗体杂交法进行检测。 （4）由图2可知改造后的酶作为候选药物的优势为：与改造前相比，改造后的天冬酰胺酶水解天冬酰胺的酶活性显著提高、水解谷氨酰胺的酶活性明显降低，说明改造后的天冬酰胺酶显著提高了对癌细胞增殖的抑制作用，降低了长期使用对正常细胞造成损伤的副作用。 14．科学家通过基因工程改造大肠杆菌，实现规模化生产人胰岛素；利用蛋白质工程优化胰岛素结构，通过将胰岛素B链的第28位氨基酸-脯氨酸（密码子为CCU）替换为天冬氨酸（密码子为GAU），有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。图1是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，图2是利用大引物PCR技术引入特定位点突变的流程。回答下列问题。 (1)图1中质粒作为载体时未标出的必需结构是____。为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5’端应添加限制酶____的识别序列，下游引物5’端的15个碱基序列为5’-____-3’。 (2)β-半乳糖苷酶可以将无色的X-gal分解产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，培养基中需添加____，从____色菌落中选择。 (3)图2中，为了得到可表达出速效胰岛素类似物的改良基因，进行第一次PCR时，上游引物对应突变位点的碱基序列是5’-____-3’。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR时，至少要进行____次循环，才能获得完成定点突变、双链等长的改良基因。 【答案】(1) 终止子 XhoI CAATTGGTAGTCGAA (2) 氨苄青霉素和X-gal 白 (3) GAT 2 【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】（1）载体需具备启动子、终止子、标记基因、复制原点和限制酶切割位点等，图1质粒未标出的必需结构是终止子。为保证目的基因与载体正向连接且不破坏目的基因和标记基因，SalⅠ和NheⅠ会破坏目的基因，MunⅠ会破坏两个标记基因，所以选择MunⅠ和XhoⅠ进行双酶切，因此为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5'端应添加限制酶XhoⅠ的识别序列，下游引物的5'端应添加限制酶MunⅠ的识别序列，所以下游引物5'端的15个碱基序列为5'-CAATTGGTAGTCGAA-3'。 （2）已知β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。而结合题图，目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达，无法产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，则菌落呈现白色。故应将转化后的大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上，筛选出的白色的菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。 （3）根据碱基互补配对原则，B链的第28位氨基酸—脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸 (密码子为GAU)，则需要将转录模板链相应位置GGA改为CTA，那么与之结合的相应引物的序列应由CCT改为GAT。利用大引物②链作为下游引物和常规上游引物共同进行PCR时，根据PCR过程和DNA分子半保留复制特点可知，第一轮得到两个DNA分子，其中一个DNA分子一条链含大引物②（含突变位点）另一条链为模板链（不含突变位点），两条链不等长；另一个DNA分子和模板DNA一样（无突变位点）。第二次循环中，以含有大引物②的DNA单链为模板，以常规引物复制得到的DNA分子即为完成定点突变、双链等长的改良基因。 15．人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，而为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。因此，利用蛋白质工程可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t-PA改良基因的重组质粒的示意图，图中重叠延伸PCR过程中，引物a、b用来扩增突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增突变位点的下游DNA序列。回答下列问题： (1)制造出性能优异的t-PA突变蛋白的途径：从预期的蛋白质功能出发→_____→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 (2)该案例中改造t-PA突变蛋白的策略是定点突变，引物_____中含有突变位点。PCR1和PCR2______（填“在”或“不在”）同一个反应体系中进行，从引物的角度分析，原因是_____。 (3)经PCR3获得t-PA改良基因后，对t-PA改良基因进行PCR扩增过程中，在设计引物时应在两个引物的5′端分别添加________。 (4)经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，应采用______法将大肠杆菌接种到添加了_______的培养基上，筛选出的_____色菌落即为工程菌种。 【答案】(1)设计预期的蛋白质结构 (2) c和b 不在 引物c和引物b会互补配对而失效 (3)XmaI、BglⅡ的识别序列 (4) 稀释涂布平板 新霉素 白 【分析】1、蛋白质工程是指通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。蛋白质工程的一般过程是：根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质，蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。 2、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）制造出性能优异的t-PA突变蛋白的途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 （2）该案例中改造t-PA突变蛋白的策略是定点突变，引物c和b中应含有突变位点。引物c和引物b会互补配对而失效，故PCR1和PCR2不在同一个反应体系中进行。 （3）根据图中t-PA改良基因的黏性末端可知，对t-PA改良基因进行PCR扩增的过程中，在设计引物时应在两个引物的5′端分别添加XmaI、BglⅡ的识别序列。 （4）经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，由于重组质粒的neoR未被切断，具有新霉素抗性，因此应采用稀释涂布平板法将大肠杆菌接种到添加了新霉素的培养基上。重组质粒的mlacZ被切断，菌落表现为白色。 一、情境拓展·科技前沿（2024-2025热点聚焦） 1. 医学检测前沿：实时荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）广泛应用于新型病原体（如变异呼吸道病毒）、罕见遗传病、肿瘤早期筛查，核心考查荧光信号原理、定量分析及引物特异性，凸显技术在精准医疗中的价值，是高考选择题、简答题的高频情境。 2. 农业分子育种热点：PCR技术与T-DNA插入突变、基因编辑（CRISPR-Cas9）、分子标记辅助育种深度融合，应用于小麦、水稻等作物的抗逆、育性、品质基因鉴定，常结合电泳条带、酶切结果，考查基因型判断、外源基因检测，关联遗传规律与分子技术的综合应用。 3. 生态与环境监测新方向：环境DNA（eDNA）结合PCR技术，用于入侵物种监测、珍稀物种保护、水体污染生物检测，侧重考查微量DNA扩增、实验污染防控、对照设计，体现生物技术服务生态保护的社会责任，成为2025年命题新亮点。 二、新情境探究、结合教材分析以及长句作答 （一）结合教材分析类 1．分析并回答下列问题： (1)相比于体内DNA复制，PCR技术体外扩增DNA的优势是什么？原因是____________________________________________________________。 答案：优势是扩增效率高、可快速获得大量目标DNA片段、不受体内生理条件限制，且能定向扩增特定片段；原因是PCR技术通过人工控制变性、复性、延伸的温度循环，模拟体内DNA复制的核心机制，利用热稳定的Taq DNA聚合酶避免高温失活，同时通过特异性引物精准结合目标序列，实现定向扩增，无需依赖活细胞，可在体外快速完成大量DNA复制，这也符合教材中“PCR技术是体外快速扩增DNA片段的核心技术”的核心原理。 (2)PCR反应体系中，引物和模板DNA的结合（复性步骤）需要控制适宜的温度，原因是____________________________________________________________________。 答案：原因是引物与模板DNA的结合具有特异性，温度是影响二者结合效率和特异性的关键因素；温度过高会导致引物无法与模板结合，温度过低则会导致引物非特异性结合（与非目标DNA片段结合），产生杂带，影响扩增效果；适宜的复性温度可保证引物精准结合目标序列，提高PCR扩增的特异性和效率，这与教材中“PCR反应的温度控制是保证扩增成功的关键”的原理一致。 (3)PCR技术中，每次循环都包括变性、复性、延伸三个步骤，其中延伸步骤的作用是什么？原因是___________________________________________________________________。 答案：作用是合成与模板DNA互补的子链，实现DNA片段的扩增；原因是延伸步骤中，Taq DNA聚合酶以引物3’端为起点，以四种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，沿着模板DNA的5’→3’方向合成子链，每次延伸都会使DNA片段数量翻倍，经过多次循环后，可实现目标DNA片段的指数级扩增，这符合教材中“DNA聚合酶的催化特性决定PCR的延伸过程”的核心要求。 （二）长句作答类 2．某研究团队利用PCR技术检测某遗传病的致病基因（A基因），设计了A基因的特异性引物，同时设置了阳性对照（含A基因）、阴性对照（不含A基因）和3组患者样本（编号①②③），PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示：阳性对照组出现特异性条带，阴性对照组无条带，样本①②出现清晰的特异性条带，样本③无条带。回答下列问题： (1)样本①②出现特异性条带，说明_______________________________________________________，判断的依据是_______________________________________________________________。 答案：样本①②中含有该遗传病的致病基因（A基因）；判断的依据是PCR技术中，特异性引物只能与目标基因（A基因）特异性结合，进而启动扩增，只有含有A基因的样本，才能在PCR扩增后产生特异性条带；结合对照实验结果，阳性对照组有带、阴性对照组无带，说明实验体系无污染、操作规范，因此样本①②的特异性条带可证明其含有A基因。 (2)样本③无条带，可能的原因是___________________________________________________，判断的依据是_____________________________________________________。 答案：样本③中不含致病基因（A基因），或PCR反应体系异常（如引物失效、Taq酶失活）；判断的依据是若样本中不含A基因，特异性引物无法结合模板，无法启动PCR扩增，因此无条带；若反应体系异常，即使样本含A基因，也无法完成扩增，导致无条带；但结合阳性对照组有清晰条带，可排除反应体系异常的可能，因此最可能的原因是样本③不含致病基因，这也符合教材中“PCR扩增的前提是存在目标模板DNA”的原理。 3．分析并回答下列问题： (1)PCR技术广泛应用于基因诊断，其核心优势是什么？原因是________________________________。 答案：原因是PCR技术具有极高的灵敏度和特异性，可检测微量、降解的目标DNA；基因诊断中，患者体内的致病基因含量往往较低，甚至为微量，PCR可通过指数级扩增，将微量致病基因放大到可检测水平，同时特异性引物能精准识别致病基因序列，避免与正常基因混淆，从而实现致病基因的精准检测，这与教材中“PCR技术适用于微量生物样本检测”的应用特点一致。 (2)利用RT-PCR技术（逆转录PCR）检测RNA病毒（如新冠病毒）时，需先进行逆转录步骤，原因是_____________________________________________________________________。 答案：原因是PCR技术的扩增模板是DNA，而RNA病毒的遗传物质是RNA，无法直接作为PCR的模板；逆转录步骤可在逆转录酶的作用下，将RNA逆转录为cDNA（互补DNA），cDNA可作为PCR的模板，进而通过PCR扩增检测病毒的存在，这符合教材中“PCR技术只能扩增DNA片段，RNA需先逆转录为DNA才能扩增”的核心原理。 (3)PCR扩增后，需通过琼脂糖凝胶电泳检测产物，为什么要设置DNA分子量标准（Marker）？其作用是____________________________________________________________________。 答案：作用是判断PCR产物的大小，验证是否为目标片段；原因是DNA分子量标准（Marker）含有已知大小的DNA片段，电泳时会形成清晰的条带，可作为参照，将样本的PCR产物条带与Marker的条带进行对比，就能判断样本产物的具体大小，进而确定其是否为预期的目标DNA片段，避免扩增出非目标杂带，这契合教材中“琼脂糖凝胶电泳是PCR产物鉴定的常用方法”的原理。 （三）新情境探究 情境素材：随着分子育种技术的发展，实时荧光定量PCR（qPCR）技术被广泛应用于作物抗逆基因的检测。某科研团队培育了抗干旱玉米品种（导入抗干旱基因D），为验证该基因是否成功导入并表达，利用qPCR技术检测玉米叶片中D基因的表达量（表达量越高，抗干旱能力越强），同时设置未导入D基因的普通玉米作为对照，检测结果如下图所示（横坐标为玉米品种，纵坐标为D基因相对表达量）。其中，qPCR技术通过荧光信号的强度实时监测PCR扩增过程，荧光信号强度与PCR产物量成正比，可实现对目标基因的定量分析。回答下列问题： (1)利用qPCR技术检测D基因表达量时，为什么要选择玉米自身的管家基因（如 actin基因）作为内参基因？原因是____________________________________________________________________。 答案：原因是内参基因（actin基因）在玉米所有细胞中均稳定表达，且表达量不受环境因素影响；qPCR检测的是D基因的相对表达量，需要通过内参基因的表达量进行校准，排除样本RNA提取量、PCR扩增效率等无关变量的干扰，确保检测结果的准确性，使不同样本之间的D基因表达量具有可比性，这符合教材中“定量PCR需设置内参基因以校准实验误差”的原理。 (2)qPCR技术中，荧光信号强度与PCR产物量成正比，其核心原理是什么？_______________________。 答案：核心原理是qPCR反应体系中加入了荧光染料（或荧光探针），该染料可与PCR扩增产生的双链DNA特异性结合，且结合的DNA数量越多，荧光信号强度越强；随着PCR循环次数增加，目标DNA（D基因）不断扩增，双链DNA数量不断增多，荧光信号强度也随之增强，因此荧光信号强度可实时反映PCR产物量，进而实现对D基因的定量分析，这体现了教材中“PCR扩增的指数级增长特性与荧光检测技术的结合”的核心原理。 (3)若检测结果显示，抗干旱玉米品种的D基因相对表达量显著高于普通玉米，其对玉米抗干旱育种的意义是______________________________________________________________。 答案：意义是证明抗干旱基因D已成功导入玉米并高效表达，为抗干旱玉米品种的培育提供了分子水平的证据；因为D基因表达量越高，玉米的抗干旱能力越强，qPCR的定量检测结果可精准判断玉米的抗干旱潜力，帮助科研人员筛选出抗干旱能力强的优良品种，加快育种进程，同时也为后续抗干旱基因的功能验证提供了依据，符合教材中“分子检测技术可推动作物育种的精准化和高效化”的原理。 1．（2026·江苏南通·二模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码合成双乙酰的关键酶，GSH1基因编码合成谷胱甘肽的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如下图1，其中CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜（会破坏膜结构、影响酶活性）产生抗性。请回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因时，反应体系中需要加入缓冲液及图中相关物质外，还需要______等物质。设计P1的依据是______。 (2)已知P3的序列为5′-TGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTT-3′，则P2的序列为______。 ①5′-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3′ ②5′-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3′ ③5′-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3′ ④5′-GAGGAGCGAAAACCGAGAGAGCTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3′ (3)过程②将质粒2导入大肠杆菌的目的是______。 (4)转化后的啤酒酵母应置于含______的培养基中初步筛选。进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，优先选用图示引物1（30bp）和______进行PCR扩增，再对产物进行______鉴定。若扩增产物的大小为______，则说明CUP1基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 (5)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，部分结果如图2。 ①据图2分析，啤酒酵母工程菌生产的啤酒抗老化能力______。 ②请在答题纸指定区域画出工程菌双乙酰含量的变化曲线______并阐述理由______。 【答案】(1) 4种脱氧核苷酸（dNTP）、TaqDNA聚合酶 CUP1基因左端的序列和Bgl Ⅱ的识别序列 (2)③ (3)扩增质粒2 (4) 一定浓度硫酸铜 引物2 琼脂糖凝胶电泳 1330bp (5) 增强（或提高） 峰值低于未转化组，整体趋势先升后降 ILV2基因是合成双乙酰的关键酶基因，工程菌中该基因表达被抑制，双乙酰合成减少，故含量更低 【分析】本题图1展示基因工程流程：通过PCR扩增目的基因，构建含CLPI和GSH1基因的重组质粒，导入大肠杆菌扩增后转化啤酒酵母。图2显示工程菌谷胱甘肽含量显著高于对照，双乙酰含量低于对照，说明工程菌抗氧化能力增强且双乙酰产量降低，达到育种目标。 【详解】（1）PCR技术需要的条件包括模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）和缓冲液。P1需扩增含CUP1左端的目的片段，故依据CUP1基因左端序列设计；同时为便于后续与载体连接，需在引物5'端引入BglⅡ识别序列。因此，P1设计依据是CUP1基因左端序列和BglⅡ识别序列的组合。 （2）P3序列5'端为TGCC...，其反向互补序列应以...GGCA结尾。选项③（5'-CGCT...GCA...-3'）的3'端含GCA，能与P3的5'端TGC形成互补配对（C-G, G-C, A-T）。在重叠延伸PCR中，这种3'端互补是引物退火并延伸的关键，使P2能作为P3的“搭档”扩增出融合基因片段，而其他选项无此互补特征，故选③。 （3）质粒2含CUP1-GSH1融合基因。大肠杆菌繁殖快、易培养，导入后可利用其快速分裂大量复制重组质粒，从而获得足量DNA用于后续转化酵母，解决直接转化酵母效率低、获量少的问题。 （4）CUP1为铜诱导型启动子，需添加一定浓度硫酸铜诱导融合基因表达；验证GSH1是否插入，需用引物2（结合GSH1）与通用引物进行PCR，若扩增出条带则证明存在；PCR产物需经琼脂糖凝胶电泳分离检测；图中 ILV2 左边界片段长度为270bp，总扩增片段长度= 引物1（30 bp）+CUP1（1030 bp）+ILV2左边界片段（270 bp）=1330 bp。 这说明CUP1和GSH1已通过同源重组整合到酵母染色体ILV2位点，PCR可扩增出该特征长度片段。 （5）据图2分析，工程菌谷胱甘肽含量显著高于未转化受体菌，因此啤酒抗老化能力增强（提高）；工程菌双乙酰含量变化曲线：整体低于未转化受体菌，呈先上升后下降趋势，峰值更低。理由：ILV2基因是合成双乙酰的关键酶基因，工程菌中 ILV2基因被抑制（或敲低），双乙酰合成减少，故含量低于受体菌。 2．（2026·河北保定·一模）水蛭素(Hirudin)可预防和治疗血栓。研究发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。研究人员利用重叠延伸PCR 技术，替换 Hirudin基因的一个碱基对，获得“Hirudin改良基因”，再构建基因表达载体，以获得含有“Hirudin 改良基因”的重组DNA 分子。相关过程、质粒及限制酶的酶切位点如图所示(Amp'表示氨苄青霉素抗性基因)。请回答下列问题。 (1)利用PCR 技术扩增含有 Hirudin基因的片段时，复性温度下发生的过程是___________。延伸DNA片段需要用到___________酶。 (2)将 Hirudin基因诱变为 Hirudin改良基因的过程中，发生了碱基对的___________(填“增添”“缺失”或“替换”)。由图可知，引物2和引物3___________(填“完全”或“不完全”)互补配对。 (3)图中参与重叠延伸过程的两条 DNA单链为___________(从“1、2、3、4”中选择)，理由是___________。 (4)为将 Hirudin改良基因与质粒高效连接，需用限制酶___________切割目的基因。若将重组质粒导入大肠杆菌制备工程菌，首先需用含___________的培养液处理大肠杆菌，之后用含___________的培养基培养大肠杆菌，以筛选工程菌。 【答案】(1) 两种引物分别与 Hirudin 基因的两条单链结合 耐高温的DNA聚合酶 (2) 替换 完全 (3) 1、4 延伸开始端为游离的3'端，可直接在DNA聚合酶作用下延伸形成改良Hirudin基因 (4) BamHI和EcoRI Ca2+ 氨苄青霉素 【详解】（1）利用PCR 技术扩增含有 Hirudin基因的片段时，复性温度下发生的过程是两种引物分别与 Hirudin 基因的两条单链结合，该过程遵循碱基互补配对原则。延伸DNA片段需要用到耐高温的DNA聚合酶，因为反应体系需要经过高温处理。 （2）题意显示，研究人员利用重叠延伸PCR 技术，替换 Hirudin基因的一个碱基对，获得“Hirudin改良基因”，可见，将 Hirudin基因诱变为 Hirudin改良基因的过程中，发生了碱基对的“替换”。由图可知，引物2和引物3“完全”互补配对，为后续重叠延伸作准备。 （3）图中参与重叠延伸过程的两条 DNA单链为1和4，因为这两条链有互补的部分，且子链延伸开始端为游离的3'端，可直接在DNA聚合酶作用下延伸形成改良Hirudin基因。 （4）根据模板链的方向可知 Hirudin改良基因的转录方向为从左向右，基因上游只能用BamH Ⅰ切割，而质粒无相同酶切位点，选择同尾酶BglⅡ；下游则选用两者都有的EcoRⅠ，因此用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ切割目的基因,用BglⅡ和EcoRⅠ切割质粒。若将重组质粒导入大肠杆菌制备工程菌，首先需用含Ca2+的培养液处理大肠杆菌使其成为感受态，之后用含氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，以筛选工程菌，因为重组质粒中含有抗氨苄青霉素的基因。 3．（2026·重庆·模拟预测）微藻中的SqME基因在烟草（双子叶植物）中异源表达后，可增强光合效率并促进脂质积累。而在SqME基因下游插入DNA片段N（转录后会被剪接）可显著提升SqME的表达量，进而提高脂质产量。某研究单位构建了SqME超表达载体，将其导入烟草用于生产生物柴油，流程如图所示。 (1)运用PCR技术从微藻中获取SqME基因，可选择的一对引物是______。若该引物较长且G-C碱基对比例高，在PCR扩增过程中可适当______复性温度，从而提高SqME基因扩增准确性。 (2)为了使DNA片段N正确插入Ti-SqME的表达载体上，需要在扩增N时所用的两种引物的5′端加上______（填限制酶）的识别序列。 (3)若采用农杆菌转化法将Ti-SqME-N表达载体导入烟草，需先将Ti-SqME-N表达载体导入农杆菌，在培养农杆菌的培养基加入______和______分别有利于提高转化效率和筛选导入了Ti-SqME-N表达载体的农杆菌。为将农杆菌中Ti-SqME-N表达载体导入烟草，具体的转化方法可以是__________（填一种即可）。另外还可以采用我国科学家独创的方法：______________，将Ti-SqME-N表达载体导入烟草中。 【答案】(1) S-F和S-R 提高 (2)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ (3) Ca2+ 卡那霉素 方案1：将农杆菌与烟草组织共同培养，利用植物组织培养技术获得烟草植株，再进行筛选、鉴定。方案2：将烟草花直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。（填一种即可） 花粉管通道法 【分析】基因工程基本操作步骤包括：目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定等。 【详解】（1）据图可知运用PCR技术从微藻中获取SqME基因，可选择的一对引物是S-F和S-R，引物需要与扩增DNA片段的上下游碱基互补配对，将引物之间的DNA片段扩增出来。若该引物较长且G-C碱基对比例高，G-C之间三个氢键，破坏氢键耗能多，因此在PCR扩增过程中可适当提高复性温度，从而提高SqME基因扩增准确性。 （2）据图可知，DNA片段N正确插入SqME的下游，且需要在启动子和终止子之间，因此在扩增N时所用的两种引物的5′端加上EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ的识别序列。 （3）将目的基因导入农杆菌细胞中，需要用钙离子处理，使其处于能够吸收周围质粒的生理状态，提高转化效率。重组质粒上含有卡那霉素抗性基因，因此可以在培养基中加入卡那霉素来筛选导入了Ti-SqME-N表达载体的农杆菌。将目的基因导入植物细胞中常用农杆菌转化法，具体操作：方案1：将农杆菌与烟草组织共同培养，利用植物组织培养技术获得烟草植株，再进行筛选、鉴定。方案2：将烟草花直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。另外还可以采用我国科学家独创的方法：花粉管通道法，将Ti-SqME-N表达载体导入烟草中。 4．（2026·陕西商洛·二模）土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，通过全基因关联分析，科研人员定位了一个盐碱响应通路中的关键基因AT1，为研究高粱植株中AT1的作用，研究人员拟构建AT1过表达植株（AT1-OE）和AT1基因敲除植株（AT1-KO）。 (1)构建AT1-OE植株：以高粱cDNA为模板，通过PCR获取目的基因。将AT1基因插入Ti质粒的_____片段中，将重组质粒转入农杆菌与高粱愈伤组织共培养，筛选后经再分化获得完整植株。 (2)构建AT1-KO植株：以图1中AT1基因的上、下游片段构建重组质粒（图2），然后通过同源重组（重组质粒中的上、下游片段分别与高粱基因组中AT1基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除高粱植株中的AT1基因。具体构建过程如下： ①以高粱基因组DNA为模板，选择引物_____进行PCR扩增，用限制酶_____对PCR产物进行酶切后电泳，结果如图3，回收片段_____（填字母），再与HindIII酶切后的质粒大片段连接，获得重组质粒。 ②将重组质粒转入高粱愈伤组织，将愈伤组织置于含_____的平板上初步筛选，最终获得高粱植株。 ③初步鉴定：提取高粱植株的核DNA，选择引物1和引物4进行PCR，若电泳获得_____条条带，则对应植株为AT1基因敲除杂合子，通过自交获得敲除纯合子。 (3)检测植株在盐碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株_____，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在盐碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 【答案】(1)T-DNA (2) 1和4 NotⅠ和HindⅢ b和c 潮霉素 二 (3)幼苗长势好、作物产量高 【分析】基因工程的基本原理是让目的基因在宿主细胞中稳定高效地表达。为了实现基因工程的目标，通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作，它包括目的基因的获得、基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）构建AT1-OE植株：若最终需要将目的基因整合到植物染色体上，则需要将AT1基因插入Ti质粒的T-DNA上，因为Ti质粒上的T-DNA可以转移到宿主细胞的染色体DNA上，因此应将重组质粒导入农杆菌。 （2）①以高粱基因组DNA为模板，选择引物1和4进行PCR扩增，获得ATI基因及其上、下游片段；据图2可知，用NotⅠ和HindⅢ对PCR产物进行酶切后电泳，可得到三种不同大小的片段，上游片段、下游片段和AT1基因片段。根据片段大小，回收片段b(下游片段)和c(上游片段)，再与HindⅢ酶切后的质粒大片段连接，获得重组质粒。 ②将重组质粒转入高粱愈伤组织，利用标记基因(潮霉素抗性基因)进行初步筛选。 ③选择引物1和引物4进行PCR，若高粱为杂合子，则应有两条条带(2.7 kb和1.1 kb)。 （3）因AT1在盐碱胁迫的响应过程中起负调控作用，故敲除后应表现为幼苗长势好、作物产量高。 5．（2026·山东青岛·一模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 (1)PCR1经过________轮循环可初步获得图中A片段，PCR2扩增GFP基因时需依据________设计引物R2，据图分析扩增目的片段时所用的引物F1和R2可对应下表中的________（填序号）。 ① 5´-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3´ ② 5´-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3´ ③ 5´-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3´ ④ 5´-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3´ 据以上表格提示PCR1和PCR2通常________（“能”或者“不能”）在同一反应体系中进行。 (2)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________（填“5´→3´或“3´→5´”）的方向水解DNA，其目的是形成________。过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是________，过程③所需的酶有________。 (3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。 A．不受限制酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基，不会出现移码突变 C．操作相对简单，成功率高 D．不需要使用PCR技术扩增目的基因 (4)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中________，了解PA的分布和含量。 【答案】(1) 2 GFP基因的一端和PABD基因一端的核苷酸序列 ①、④ 不能 (2) 5'→3' 黏性末端 过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列） DNA聚合酶和DNA连接酶 (3)ABC (4) 草胺膦 绿色荧光点的分布 【详解】（1）PCR第1轮：得到长短不一的链；PCR第2轮：首次出现长度正好等于A片段的 DNA。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于下表中的①。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于下表中的④。PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行，因为PCR1与PCR2的引物F1和R2之间存在互补序列，若在同一体系中扩增，引物会相互配对形成其他产物，干扰正常PCR反应，无法获得正确的目的片段。 （2）据图可知，T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA（单链），暴露出3' 端非互补序列，即黏性末端。过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列），因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶（DNA聚合酶将游离的单个脱氧核苷酸加到子链3′末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 （3）传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切位点的限制，不会引入多余碱基，不会出现移码突变，操作时间短，成功率高，ABC正确，D错误。 （4）由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 学科网(北京)股份有限公司1 学科网(北京)股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $