专题14基因工程（2大考点）（江苏专用）2026年高考生物一模分类汇编

专题14基因工程 2大考点概览 考点01 基因工程基础操作 考点02 基因工程相关技术 基因工程基础操作 考点1 一、单选题 1．（2026·江苏徐州·一模）【新情境·基因改造】人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因（下图），下列说法错误的是（　　） A．PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高 B．30轮PCR后，所得突变基因和正常基因含量相当 C．上述方法可将待突变序列改造成5'-AAGCCC-3' D．通过电泳检测PCR产物，不能确定基因是否改造成功 二、多选题 2．（2026·江苏·一模）【新情境·实验顺序辨析】实验操作顺序直接影响实验结果。下列相关叙述正确的有（    ） A．检测生物组织中的蛋白质，向待测样液中先加双缩脲试剂A液，再加B液 B．观察叶绿体的形态和分布，先用低倍镜找到特定区域的黑藻叶肉细胞，再换高倍镜观察 C．DNA粗提取与鉴定，将含DNA的丝状物溶于二苯胺试剂，沸水浴加热后观察颜色反应 D．利用琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳后添加核酸染料，在紫外灯下观察结果 3．（2026·江苏·一模）【新载体·双向启动子】双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　） A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 D．为连入GUS基因，需用Sal I和Age I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 三、非选择题 4．（2026·江苏·一模）Zbtb7A蛋白是抑癌基因的特异性抑制物，在人类许多肿瘤组织中高度表达。科研人员合成了优化的Zbtb7A-His6基因序列，将其导入毕赤酵母并成功表达出融合His标签(由6个组氨酸组成)的Zbtb7A蛋白，为后续研究其功能奠定基础。下图1为两步法PCR合成密码子优化的Zbtb7A编码序列的过程。图2为构建基因表达载体的过程。请回答下列问题。 (1)为了使毕赤酵母在合成Zbtb7A蛋白时能高效利用自身的tRNA，应根据毕赤酵母的___________，优化Zbtb7A编码序列。 (2)科研人员根据优化后的Zbtb7A编码序列，设计了66种引物。为了获得完整的Zbtb7A序列，引物2应与引物___________存在互补的碱基序列。PCR1反应体系中除加入66种引物外，还需加入___________等成分。 (3)为了使PCR扩增产物与质粒定向连接，并最终表达出Zbtb7A-His6融合蛋白，PCR2选择的上游引物(引物1)和下游引物(引物66)分别是___________、___________。(注：Zbtb7A的编码链序列：5'-GCAGGTGGA……GGATTGGCC-3'；终止密码子为UAA，UAG，UGA；组氨酸的密码子：CAC、CAU) a．5'-TTTACGTAGCAGGTGGAGTTGATGGTCCTA-3' b．5'-TTTACGTAGCTTAGGTGGAGTTGATGGTCCTA-3' c．5'-TTTGAATTCTTAATGATGATGATGATGGTGGGCCAATCC-3' d．5'-TTTGAGCTCATGATGATGATGATGGTGTTAGGATTGGCC-3' (4)用电击法转化毕赤酵母前，需先用预冷的山梨醇溶液处理毕赤酵母，目的是___________。将转化后的毕赤酵母置于___________(填“含”或“不含”)组氨酸的培养基中进行筛选。 (5)为了研究重组菌株表达并分泌Zbtb7A蛋白的适宜条件，科研人员用含不同浓度甲醇的培养液培养重组菌株，3d后收集___________(填“上清液”或“细胞沉淀”)，获取蛋白质并电泳，结果如图所示。结果表明甲醇浓度为___________是Zbtb7A蛋白表达的最适宜浓度。为了进一步探究诱导Zbtb7A蛋白表达的最佳时间，尝试写出实验设计思路___________ 5．（2026·江苏无锡·一模）小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切，因此将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。其中PAM序列可帮助复合体定位目标DNA序列3'端。相关过程如图1所示。 (1)gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循___________原则，Cas9蛋白作用的化学键是___________。 (2)为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'___________3'(写出12个碱基)。 (3)利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有___________，最终表达载体还应具备的基本元件有___________(写出两点)。表达载体导入农杆菌后，利用含___________的培养基筛选出阳性菌落。 (4)对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测。电泳时需要用___________缓冲液来配制琼脂糖凝胶。若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因___________(填“敲除”或“未敲除”)的植株。 6．（2026·江苏镇江·一模）酵母双杂交技术是一种用于检测两种蛋白质间是否存在相互作用的分子生物学技术，其基本原理如图1所示。研究人员拟利用该技术探究水稻SH蛋白与ELC蛋白之间是否存在相互作用，图2所示为分别用于构建重组质粒pAD-SH和pBD-ELC的两种空白质粒。请回答下列问题： (1)构建重组质粒时需要使用PCR技术扩增目的基因，扩增时除加入模板、含Mg2+的缓冲液、引物外，还需添加______（答两点），当温度下降到50℃时，PCR反应体系中发生的反应是______。 (2)为使ELC基因正确插入质粒pBD，利用PCR扩增ELC基因时应在两种引物的______端分别添加______限制酶的识别序列，宜用______（选填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）将质粒pBD和ELC基因的末端进行连接。 (3)将不同类型的质粒导入自身不能合成色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和组氨酸的营养缺陷型酵母细胞（含有图1所示启动子和报告基因）中，然后分别接种于两种选择培养基上培养，结果如下表所示。请回答： 选择培养基类型导入质粒类型 培养基1（-Trp-Leu） 培养基2（-Trp-Leu-Ade-His） 甲组:pAD和pBD-ELC 乙组:pAD-SH和pBD 丙组:pAD-SH和pBD-ELC 注:“-”表示培养基中缺乏该物质；Trp:色氨酸Leu:亮氨酸Ade:腺嘌呤His:组氨酸； ①三组酵母菌均可在只缺少色氨酸和亮氨酸的培养基上生长，说明______。该实验的报告基因为______合成基因。设置甲和乙实验组目的是______。 ②根据结果分析，SH蛋白与ELC蛋白______（选填“能”或“不能”）相互作用，理由是______。 7．（2026·江苏·一模）科研人员利用Isia70基因编码链（与DNA模板链互补）的部分已知序列设计并合成了相应circRNA疫苗，具体过程如图所示。请回答下列问题： (1)过程①产生的mRNA1前八个碱基序列为_____（方向为5'→3'）。对Isia70基因的编码区段进行PCR时，需要设计_____对引物，其中结合到模板链上的引物前八个碱基序列是_____（方向为5'→3'）。 (2)过程②需要______酶的催化，得到的cDNA序列需含有Isia70基因的______（填字母）部分，否则基因将失去表达出所需蛋白质的能力。 A．启动子  B．外显子  C．内含子  D．终止子 (3)过程④需将mRNA2的5'和3'连接形成______键。过程⑤通常采用反向PCR技术，需先用_____处理circRNA使其线性化后，再自连环化形成模板；过程⑥在circRNA外面包裹一层脂质外膜后，才能作为疫苗注射到志愿者体内，并使用______技术检测志愿者体内是否产生相应抗体。 (4)上述过程中cDNA纯度对circRNA疫苗的效果影响很大，通常需要构建基因表达载体对cDNA进行检测。构建基因表达载体时，应选用的限制酶是_____。将基因表达载体导入大肠杆菌时，需要提前处理菌株使其处于_____的生理状态。已知β-半乳糖苷酶基因的表达产物能催化白色底物形成蓝色化合物。若实验中含目的基因的大肠杆菌菌落呈白色，则目的基因在重组质粒中的插入位点是在_____中。 8．（2026·江苏·一模）CBF基因是一类转录调节因子，其与植物的生长发育密切相关。科学家将马铃薯CBF基因导入烟草中获得转基因烟草。回答下列问题： (1)获取和扩增目的基因：对马铃薯幼苗进行取样，每株幼苗取6~8片叶，从叶片中提取总RNA，再经____________过程合成cDNA，将合成的cDNA作为模板，利用PCR技术进行扩增。扩增完成后，利用____________检测产物，其结果如图1所示，若CBF基因片段的长度为775bp，则在图1中CBF基因片段位于第____________泳道。 (2)构建基因表达载体：CBF基因片段和Ti质粒的酶切位点如图2、3所示，为使PCR扩增出的CBF基因片段能插入T-DNA中，需在两个引物的____________（填“5'”或“3'”）端分别添加限制酶____________的识别序列。构建重组Ti质粒时，需要利用____________将CBF基因与Ti质粒连接起来。 (3)用____________处理农杆菌，使其处于____________，再将重组质Ti粒与处理后的农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌，完成转化。 (4)使用农杆菌转化法将重组Ti质粒中的CBF基因片段导入烟草细胞中，之后可通过向培养基中加入____________来初步筛选出含有目的基因的烟草细胞；对导入目的基因的烟草细胞进行组织培养时，烟草细胞先经脱分化形成____________，该过程____________（填“需要”或“不需要”）光照。 9．（2026·江苏·一模）羊口疮是由羊口疮病毒（Orfvirus，OrfV）引起的一种人兽共患传染病。为研制羊口疮疫苗，将OrfV基因组中的B2L和FlL基因融合，并运用重组DNA技术构建重组质粒，如图1所示。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，具有LacZ基因的细菌能利用培养基中的物质X-gal进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。请回答下列问题： (1)为将B2L基因和FIL基因成功连接，引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生________。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后，________（填“能”或“不能”）延伸获得B2L-FIL融合基因，请从DNA聚合酶的作用特点考虑其原因是________。 (2)为了检测PCR扩增产物与预期是否相符，将三个PCR体系的扩增产物进行回收并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，条带________最可能表示B2L-FIL融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________。 (3)若B2L-F1L融合基因转录的模板链是a链，则在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶________识别序列，以便构建重组质粒。转录时，与启动子结合的酶是________。 (4)转化时常用________处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的DNA分子；用含有________的培养基筛选大肠杆菌，挑选________色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 10．（2026·江苏·一模）别藻蓝蛋白（APC）是蓝细菌及藻类中的一种色素蛋白，其生物合成过程如图1。通过构建双质粒表达系统，实现重组别藻蓝蛋白（rAPC）合成通路在大肠杆菌中的完整表达，如图2，请回答下列问题： (1)根据图1中PCB的合成过程可判断，基因表达产物与性状之间的关系是________。APC的合成受到多种基因的控制，说明基因和性状之间并非_______关系。 (2)据图2可知，构建双质粒表达系统时，引物_______的5′端分别引入相同的限制酶识别序列，并且构建过程_______（选填“可以”或“不可以”）在同一反应体系中进行。为使不同目的基因的表达量达到适宜比例，启动子1的强度应_______（选填“大于”或“等于”或“小于”）启动子2。将APC合成通路中的关键基因分别导入两个不同质粒的优点是_______。 (3)一般用_______处理大肠杆菌以提高转化的效率。比较图2中过程④和⑤使用的培养基，前者比后者多出的成分有_______。 (4)科研人员为探究rAPC对小鼠肝癌的影响，进行了相关实验。下表为部分实验结果： 组别 抑癌率% 细胞灰度值 COX-2 VEGF PCNA 对照组 0 148.3 151.1 155.7 rAPC 低剂量组 25.2 156.2 159.2 157.5 中剂量组 36.7 161.2 159.9 162.3 高剂量组 43.1 165.1 163.5 164.9 化疗药物（CY）组 51.0 165.2 166.2 206.8 注：COX-2、VEGF和PCNA基因与肿瘤生长有关；细胞灰度值越大，相对应的基因表达量越小。 下列关于实验结果的分析，合理的有_________。 a.rAPC组与CY组对比，能说明rAPC具有抑癌作用 b.rAPC能抑制肿瘤的生长，但抑制作用不具有剂量效应 c.rAPC和CY均能抑制肿瘤细胞中COX-2、VEGF和PCNA基因的表达 d.COX-2、VEGF和PCNA在肝癌的发生和发展过程中可能具有协同作用 基因工程相关技术 考点2 一、非选择题 1．（2026·江苏南通·一模）限制性核酸内切酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmBⅠ实现多DNA片段无缝连接的技术称为Golden Gate克隆，其过程如图2.请回答下列问题。 (1)由图1可知，BsmBⅠ酶切DNA中的________键，产生________（类型）末端。BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端________（填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。 (2)PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，其原因有________、________。过程②需要的酶有________。 (3)片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为________（接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列________（接头序列用小写字母表示）。 (4)据图1、2分析，GoldenGate克隆技术的优点有________。 a.不受天然酶切位点的限制 b.实现多片段一次性有序连接 c.有利于大片段DNA的高效连接 d.片段1~n之间不会引入外源序列实现无缝连接 2．（2026·江苏·一模）环介导恒温扩增技术（LAMP），因操作简便，能快速、精确地进行基因扩增而得到广泛的应用。LAMP使用的酶是有链置换效应的Bst DNA聚合酶，其原理如下图1所示，请回答下列问题： (1)LAMP技术温度控制在63℃左右，与常规PCR相比，其简化之处是不需要_______；另一个简化之处是通过肉眼观察有无白色沉淀焦磷酸镁即可判断靶基因是否复制，推测其中的焦磷酸来自_______水解。 (2)如上图1，针对靶基因上的6个区域设计了4条引物，其中决定主要产物长度的是___，由引物F3延伸出子链的作用是_______。部分单链DNA两端成环状，环状结构中局部双链的形成依赖_______原则。 (3)将LAMP技术用于猕猴桃褪绿环斑相关病毒（AcCRaV）的核酸检测，为找到最适宜的靶序列扩增温度，研究者设定56-63℃温度梯度，并进行染色、电泳等操作后，得到下图2实验结果。据图可知，此靶序列最佳扩增的温度为_______℃，电泳后出现梯形条带，该结果说明_______。 (4)将LAMP技术用于新冠病毒（SARS-CoV-2）的核酸检测，先要进行如下操作： 实验步骤 简要操作过程 _______ 用医用棉签从上呼吸道采集咽拭子或鼻拭子，然后低温封存并送检测机构进行检测 _______ 向样本中加入Trizol裂解蛋白质成分，再加入氯仿并离心，吸取上层水相置于新的EP离心管中，加入等体积的异丙醇，离心弃上清液，加入乙醇洗涤，离心弃上清液，晾干后加入DEPC水解液破坏RNA水解酶。 合成cDNA 向样本中加入缓冲液、______和dNTP，在PCR仪中获得cDNA产物。 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14基因工程 基因工程基础操作 考点1 一、单选题 1．B 二、多选题 2．AB 3．BD 三、非选择题 4．(1)密码子偏好性 (2) 引物1、3 dNTP、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液 (3) a c (4) 使毕赤酵母处于易吸收周围环境中DNA的状态(使毕赤酵母处于感受态) 不含 (5) 上清液 1% 用含1%甲醇的培养基在相同且适宜的条件下培养重组菌种，分别在不同时间收集上清液中的蛋白质，比较Zbtb7A蛋白的含量 5．(1) 碱基互补配对 磷酸二酯键 (2)AGAUUGGGUCCU (3) SpeI和NheI 复制原点、终止子 潮霉素 (4) 电泳 敲除 6．(1) dNTP、耐高温的DNA聚合酶 引物结合到互补DNA链上（复性） (2) 5' NdeI、SmaI（顺序可颠倒） T4DNA连接酶 (3) 质粒导入酵母菌，并成功表达相关基因 腺嘌呤和组氨酸 排除AD与ECL蛋白及BD与SH蛋白的相互作用（出现假阳性）的可能 能 丙组酵母菌能在缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基上长出菌落，说明报告基因成功表达 7．(1) 5'UGCUCGAG3' 一 5'TGCTCGAG3' (2) 逆转录 B (3) 磷酸二酯键 限制酶 抗原-抗体杂交 (4) Xbal、XhoⅠ 能够吸收环境中DNA分子 β-半乳糖苷酶基因 8．(1) 逆转录/反转录 琼脂糖凝胶电泳 4 (2) 5' SacⅠ和NotⅠ DNA连接酶 (3) Ca2+ 感受态 (4) 潮霉素 愈伤组织 不需要 9．(1) 碱基互补配对 不能 DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端） (2) 3/三 电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列（及是否产生突变） (3) EcoR I RNA聚合酶 (4) Ca2+（CaCl2溶液） 氨苄青霉素和X-gal 白 10．(1) 基因通过控制酶的合成控制代谢过程，进而控制生物的性状 （简单的）一一对应 (2) 2和3 不可以 大于 分别调控不同基因的表达（降低载体构建的难度、避免单个载体容量有限、减轻受体细胞在代谢上的负担） (3) Ca2+ 壮观霉素和卡那霉素和琼脂 (4)cd 基因工程相关技术 考点2 一、非选择题 1．(1) 磷酸二酯 黏性 可能相同 (2) 不同PCR反应的退火温度有差异 不同引物间会互补配对 BsmBⅠ酶、DNA连接酶 (3) 5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3' 5'CGTCTCNgtgcTGTA……3' (4)abd 2．(1) 变性、复性、延伸过程的循环/温度循环 dNTP (2) 2条内部引物/FIP、BIP 促进链置换，增加模板数量 碱基互补配对 (3) 62 LAMP技术扩增得到的DNA不等长 (4) 采集样本 提取RNA 逆转录酶#引物 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14基因工程 2大考点概览 考点01 基因工程基础操作 考点02 基因工程相关技术 基因工程基础操作 考点1 一、单选题 1．（2026·江苏徐州·一模）【新情境·基因改造】人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因（下图），下列说法错误的是（　　） A．PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高 B．30轮PCR后，所得突变基因和正常基因含量相当 C．上述方法可将待突变序列改造成5'-AAGCCC-3' D．通过电泳检测PCR产物，不能确定基因是否改造成功 【答案】B 【详解】A、PCR每次循环一 般可以分为变性（超过90℃）、复性（50℃左右）和延伸（72℃左右）三步，PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高，A正确； B、PCR扩增过程中，一条为突变引物，一条为正常引物，经过2轮循环即可得到目标基因，30轮PCR后，得到230个DNA分子，其中一个DNA分子只含有正常引物，一个DNA分子只含有突变引物，剩下的DNA分子既含有正常引物又含有突变引物，可见突变基因多于正常基因，B错误； C、根据图示，正常引物延伸方向是从5'到3'，突变引物延伸方向也是从5'到3'，按照碱基互补配对原则，最终得到的突变序列应该是5'-AAGCCC-3’，C正确； D、PCR 产物电泳主要是用于检测 PCR 扩增是否成功，即是否得到了预期大小的 DNA 片段。但仅通过电泳检测 PCR 产物，并不能确定基因是否改造成功。基因改造成功与否不仅取决于是否扩增出特定片段，还涉及到基因序列的精确改变、是否插入或缺失特定碱基对、基因表达情况以及是否产生预期的功能变化等多方面。电泳只能直观呈现 DNA 片段的大小和数量，无法反映基因内部序列的精确改变以及功能上的变化，D正确。 故选B。 二、多选题 2．（2026·江苏·一模）【新情境·实验顺序辨析】实验操作顺序直接影响实验结果。下列相关叙述正确的有（    ） A．检测生物组织中的蛋白质，向待测样液中先加双缩脲试剂A液，再加B液 B．观察叶绿体的形态和分布，先用低倍镜找到特定区域的黑藻叶肉细胞，再换高倍镜观察 C．DNA粗提取与鉴定，将含DNA的丝状物溶于二苯胺试剂，沸水浴加热后观察颜色反应 D．利用琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳后添加核酸染料，在紫外灯下观察结果 【答案】AB 【详解】A、检测生物组织中的蛋白质时，双缩脲试剂的使用方法是先向待测样液中加入双缩脲试剂A液（创造碱性环境），摇匀后，再加入双缩脲试剂B液，该操作顺序正确，A正确； B、观察叶绿体的形态和分布时，显微镜的使用遵循先低倍镜后高倍镜的原则，先用低倍镜找到特定区域的黑藻叶肉细胞，再换高倍镜观察，这样能更清晰地观察叶绿体的形态和分布，B正确； C、DNA粗提取与鉴定时，应先将含DNA的丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，然后进行沸水浴加热观察颜色反应（变蓝则说明有DNA），而不是直接将含DNA的丝状物溶于二苯胺试剂，C错误； D、利用琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳时，应该是在制胶时就加入核酸染料，然后进行电泳，之后在紫外灯下观察结果，而不是电泳后添加核酸染料，D错误。 故选AB。 3．（2026·江苏·一模）【新载体·双向启动子】双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　） A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 D．为连入GUS基因，需用Sal I和Age I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 【答案】BD 【详解】A、由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，而RNA聚合酶在转录时，只能识别模板链的3'端，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误； B、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光和生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，B正确； C、T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误； D、根据题图分析可知，在不破坏破坏LUC基因前提下，为连入GUS基因，需用Sal I和Age I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，D正确。 故选BD。 三、非选择题 4．（2026·江苏·一模）Zbtb7A蛋白是抑癌基因的特异性抑制物，在人类许多肿瘤组织中高度表达。科研人员合成了优化的Zbtb7A-His6基因序列，将其导入毕赤酵母并成功表达出融合His标签(由6个组氨酸组成)的Zbtb7A蛋白，为后续研究其功能奠定基础。下图1为两步法PCR合成密码子优化的Zbtb7A编码序列的过程。图2为构建基因表达载体的过程。请回答下列问题。 (1)为了使毕赤酵母在合成Zbtb7A蛋白时能高效利用自身的tRNA，应根据毕赤酵母的___________，优化Zbtb7A编码序列。 (2)科研人员根据优化后的Zbtb7A编码序列，设计了66种引物。为了获得完整的Zbtb7A序列，引物2应与引物___________存在互补的碱基序列。PCR1反应体系中除加入66种引物外，还需加入___________等成分。 (3)为了使PCR扩增产物与质粒定向连接，并最终表达出Zbtb7A-His6融合蛋白，PCR2选择的上游引物(引物1)和下游引物(引物66)分别是___________、___________。(注：Zbtb7A的编码链序列：5'-GCAGGTGGA……GGATTGGCC-3'；终止密码子为UAA，UAG，UGA；组氨酸的密码子：CAC、CAU) a．5'-TTTACGTAGCAGGTGGAGTTGATGGTCCTA-3' b．5'-TTTACGTAGCTTAGGTGGAGTTGATGGTCCTA-3' c．5'-TTTGAATTCTTAATGATGATGATGATGGTGGGCCAATCC-3' d．5'-TTTGAGCTCATGATGATGATGATGGTGTTAGGATTGGCC-3' (4)用电击法转化毕赤酵母前，需先用预冷的山梨醇溶液处理毕赤酵母，目的是___________。将转化后的毕赤酵母置于___________(填“含”或“不含”)组氨酸的培养基中进行筛选。 (5)为了研究重组菌株表达并分泌Zbtb7A蛋白的适宜条件，科研人员用含不同浓度甲醇的培养液培养重组菌株，3d后收集___________(填“上清液”或“细胞沉淀”)，获取蛋白质并电泳，结果如图所示。结果表明甲醇浓度为___________是Zbtb7A蛋白表达的最适宜浓度。为了进一步探究诱导Zbtb7A蛋白表达的最佳时间，尝试写出实验设计思路___________ 【答案】(1)密码子偏好性 (2) 引物1、3 dNTP、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液 (3) a c (4) 使毕赤酵母处于易吸收周围环境中DNA的状态(使毕赤酵母处于感受态) 不含 (5) 上清液 1% 用含1%甲醇的培养基在相同且适宜的条件下培养重组菌种，分别在不同时间收集上清液中的蛋白质，比较Zbtb7A蛋白的含量 【分析】1、PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿，也需要模板、原料、缓冲液、酶和引物等。待扩增的DNA分子是模板，原料是4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。 2、基因工程的基本操作步骤包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA 分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。 【详解】（1）密码子具有简并性，一种氨基酸可能对应多种密码子。为使毕赤酵母在合成Zbtb7A蛋白时高效利用自身tRNA，应根据毕赤酵母密码子偏好性优化Zbtb7A编码序列，这样能让合成蛋白过程更顺畅。 （2）为获得完整Zbtb7A序列，引物2应与引物1、引物3存在互补碱基序列，从而实现拼接。PCR1反应体系除66种引物外，还需加入Taq酶、dNTP、缓冲液等成分，Taq酶催化DNA合成，dNTP是原料和能量，缓冲液维持pH稳定。 （3）要使PCR扩增产物与质粒定向连接并表达出Zbtb7A-His6融合蛋白，Zbtb7A的编码链序列为5'-GCAGGTGGA……GGATTGGCC-3'，结合限制酶和密码子情况，上游引物（引物1）选a，下游引物（引物 66）需包含终止密码子和 His6标签的编码序列，应选c（含终止相关序列）。 （4）用电击法转化前，用预冷山梨醇溶液处理毕赤酵母，目的是使酵母细胞处于感受态，利于吸收外源DNA。因为融合蛋白含His标签，所以将转化后的毕赤酵母置于不含组氨酸的培养基筛选，不能生长的是未转化或未正确表达的菌株。 （5）Zbtb7A蛋白是分泌蛋白，所以3d后收集上清液。由电泳结果可知，1%甲醇组的Zbtb7A 蛋白条带最明显，故最适浓度为1%；探究最佳诱导时间的实验设计思路为：用甲醇浓度为1%的培养基培养重组菌株，分别在不同时间（如1d、2d、3d、4d等）收集上清液，进行电泳检测，比较不同时间点Zbtb7A蛋白的含量，以确定最佳时间。 5．（2026·江苏无锡·一模）小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切，因此将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。其中PAM序列可帮助复合体定位目标DNA序列3'端。相关过程如图1所示。 (1)gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循___________原则，Cas9蛋白作用的化学键是___________。 (2)为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'___________3'(写出12个碱基)。 (3)利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有___________，最终表达载体还应具备的基本元件有___________(写出两点)。表达载体导入农杆菌后，利用含___________的培养基筛选出阳性菌落。 (4)对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测。电泳时需要用___________缓冲液来配制琼脂糖凝胶。若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因___________(填“敲除”或“未敲除”)的植株。 【答案】(1) 碱基互补配对 磷酸二酯键 (2)AGAUUGGGUCCU (3) SpeI和NheI 复制原点、终止子 潮霉素 (4) 电泳 敲除 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选和获取从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。 （3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循碱基互补配对原则。 gRNA能够识别DNA特定序列，引导Cas9蛋白通过催化磷酸二酯键的断裂发挥作用，即Cas9蛋白作用的化学键是磷酸二酯键。 （2）观察图2，目标DNA序列为5′-AGATGCATATCCCGGAGATTGGGTCCTGCGTGACGG-3′，其3′端PAM右侧序列是“AGATTG”；复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链（3′端-5′端）互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除；可见gRNA靶向序列应该与目标DNA序列（5′端-3′端）序列基本一致，但需要将DNA序列上的T换成U，又在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-AGAUUGGGUCCU-3'。 （3）通过限制酶SpeⅠ和NheⅠ将载体1启动子a和gRNA基因剪切，该片段两端的黏性末端相同，因此再用SpeⅠ将载体2切开，通过DNA连接酶将该片段连接到载体2即可成为最终载体。基因表达载体除了图中所示的目的基因、启动子、标记基因外，还应具有复制原点、终止子等元件。由于载体中含有潮霉素抗性基因，所以可用含潮霉素的培养基筛选出阳性菌落。 （4）对小麦植株 M 基因进行 PCR 扩增后，用电泳缓冲液来配制琼脂糖凝胶。AvaⅡ酶切位点存在于M基因中，若M基因未被敲除，AvaⅡ酶切后会产生两个条带；若M基因被敲除，M基因序列改变，AvaⅡ酶切位点消失，酶切后会出现1个条带，所以检测结果出现1个条带时，该植株为M基因敲除的植株。 6．（2026·江苏镇江·一模）酵母双杂交技术是一种用于检测两种蛋白质间是否存在相互作用的分子生物学技术，其基本原理如图1所示。研究人员拟利用该技术探究水稻SH蛋白与ELC蛋白之间是否存在相互作用，图2所示为分别用于构建重组质粒pAD-SH和pBD-ELC的两种空白质粒。请回答下列问题： (1)构建重组质粒时需要使用PCR技术扩增目的基因，扩增时除加入模板、含Mg2+的缓冲液、引物外，还需添加______（答两点），当温度下降到50℃时，PCR反应体系中发生的反应是______。 (2)为使ELC基因正确插入质粒pBD，利用PCR扩增ELC基因时应在两种引物的______端分别添加______限制酶的识别序列，宜用______（选填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）将质粒pBD和ELC基因的末端进行连接。 (3)将不同类型的质粒导入自身不能合成色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和组氨酸的营养缺陷型酵母细胞（含有图1所示启动子和报告基因）中，然后分别接种于两种选择培养基上培养，结果如下表所示。请回答： 选择培养基类型导入质粒类型 培养基1（-Trp-Leu） 培养基2（-Trp-Leu-Ade-His） 甲组:pAD和pBD-ELC 乙组:pAD-SH和pBD 丙组:pAD-SH和pBD-ELC 注:“-”表示培养基中缺乏该物质；Trp:色氨酸Leu:亮氨酸Ade:腺嘌呤His:组氨酸； ①三组酵母菌均可在只缺少色氨酸和亮氨酸的培养基上生长，说明______。该实验的报告基因为______合成基因。设置甲和乙实验组目的是______。 ②根据结果分析，SH蛋白与ELC蛋白______（选填“能”或“不能”）相互作用，理由是______。 【答案】(1) dNTP、耐高温的DNA聚合酶 引物结合到互补DNA链上（复性） (2) 5' NdeI、SmaI（顺序可颠倒） T4DNA连接酶 (3) 质粒导入酵母菌，并成功表达相关基因 腺嘌呤和组氨酸 排除AD与ECL蛋白及BD与SH蛋白的相互作用（出现假阳性）的可能 能 丙组酵母菌能在缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基上长出菌落，说明报告基因成功表达 【分析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）扩增目的基因的PCR反应体系，除了模板、含Mg²⁺的缓冲液、引物外，还需要加入Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）和dNTP（脱氧核苷酸）。 当温度下降到55℃时，PCR反应体系中发生的反应是引物结合到互补DNA链上（复性）。 （2）分析图2pBD载体上的酶切位点，选择NdeI、SmaI限制酶可以保证ELC基因正确插入pBD。故利用PCR扩增ELC基因时应在两种引物的5'端分别添加NdeI、SmaI限制酶的识别序列，再用T4DNA连接酶（既可以连接黏性末端，又连接平末端）将其与pBD载体连接。 （3）①三组酵母菌都能在只缺少色氨酸（Trp）和亮氨酸（Leu）的培养基（培养基1）上生长，说明质粒导入酵母菌，并成功表达相关基因。该实验的报告基因为腺嘌呤（Ade）和组氨酸（His）的合成基因，因为培养基2同时缺少这两种物质，只有报告基因表达时酵母菌才能生长。设置甲、乙组的目的是作为对照，排除AD与ELC蛋白及BD与SH蛋白的相互作用（出现假阳性）的可能； ② 根据结果分析，SH蛋白与ELC蛋白能相互作用，理由是丙组酵母菌能在缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基上长出菌落，说明报告基因成功表达。 7．（2026·江苏·一模）科研人员利用Isia70基因编码链（与DNA模板链互补）的部分已知序列设计并合成了相应circRNA疫苗，具体过程如图所示。请回答下列问题： (1)过程①产生的mRNA1前八个碱基序列为_____（方向为5'→3'）。对Isia70基因的编码区段进行PCR时，需要设计_____对引物，其中结合到模板链上的引物前八个碱基序列是_____（方向为5'→3'）。 (2)过程②需要______酶的催化，得到的cDNA序列需含有Isia70基因的______（填字母）部分，否则基因将失去表达出所需蛋白质的能力。 A．启动子  B．外显子  C．内含子  D．终止子 (3)过程④需将mRNA2的5'和3'连接形成______键。过程⑤通常采用反向PCR技术，需先用_____处理circRNA使其线性化后，再自连环化形成模板；过程⑥在circRNA外面包裹一层脂质外膜后，才能作为疫苗注射到志愿者体内，并使用______技术检测志愿者体内是否产生相应抗体。 (4)上述过程中cDNA纯度对circRNA疫苗的效果影响很大，通常需要构建基因表达载体对cDNA进行检测。构建基因表达载体时，应选用的限制酶是_____。将基因表达载体导入大肠杆菌时，需要提前处理菌株使其处于_____的生理状态。已知β-半乳糖苷酶基因的表达产物能催化白色底物形成蓝色化合物。若实验中含目的基因的大肠杆菌菌落呈白色，则目的基因在重组质粒中的插入位点是在_____中。 【答案】(1) 5'UGCUCGAG3' 一 5'TGCTCGAG3' (2) 逆转录 B (3) 磷酸二酯键 限制酶 抗原-抗体杂交 (4) Xbal、XhoⅠ 能够吸收环境中DNA分子 β-半乳糖苷酶基因 【分析】基因工程的基本操作程序包括四个步骤：目的基因的获得、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。其中需要用的基本工具有限制性核酸内切酶（简称限制酶）、DNA连接酶和运载体。限制酶能够识别DNA上特定的碱基序列，将DNA从特定的位置切开，用同种的限制酶处理目的DNA和运载体，得到相同的末端，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接起来，形成重组运载体。 【详解】（1）转录是以DNA的一条链为模板合成mRNA的过程，编码链与DNA模板链互补，mRNA与DNA模板链互补，由此可知mRNA与编码链碱基序列类似，即mRNA1前八个碱基序列为5'UGCUCGAG3'。对Isia70基因的编码区段进行PCR时，需要设计一对引物，与模板链的3'端碱基互补配对，其中结合到模板链上的引物前八个碱基序列是5'TGCTCGAG3'、结合到编码链上的引物前八个碱基序列是5'TTTCTAGA3'。 （2）过程②为逆转录过程，需要逆转录酶的催化，cDNA 对应的是成熟 mRNA，不含内含子，故只保留B外显子才能正常表达蛋白，否则基因将失去表达出所需蛋白质的能力。 （3）过程④是将mRNA环化，即需将mRNA2的5'和3'连接形成磷酸二酯键，过程⑤通常采用反向PCR技术，需先用限制酶处理circRNA使其线性化后，再自连环化形成模板；过程⑥在circRNA外面包裹一层脂质外膜后，才能作为疫苗注射到志愿者体内，并使用抗原-抗体杂交技术检测志愿者体内是否产生相应抗体。 （4）构建基因表达载体时要保证目的基因和质粒的正向链接，需要使用双酶切，且两种酶黏性末端不同，可选择Xbal、XhoI（找到原卷的答案是这样的，但质粒上面没有相关酶切位点）。将基因表达载体导入大肠杆菌时，需要提前用Ca2+处理菌株。使其处于能够吸收环境中DNA分子的状态。已知β-半乳糖苷酶基因的表达产物能催化白色底物形成蓝色化合物。若实验中含目的基因的大肠杆菌菌落呈白色，说明β-半乳糖苷酶基因被破坏，即目的基因在重组质粒中的插入位点是在β-半乳糖苷酶基因中。 8．（2026·江苏·一模）CBF基因是一类转录调节因子，其与植物的生长发育密切相关。科学家将马铃薯CBF基因导入烟草中获得转基因烟草。回答下列问题： (1)获取和扩增目的基因：对马铃薯幼苗进行取样，每株幼苗取6~8片叶，从叶片中提取总RNA，再经____________过程合成cDNA，将合成的cDNA作为模板，利用PCR技术进行扩增。扩增完成后，利用____________检测产物，其结果如图1所示，若CBF基因片段的长度为775bp，则在图1中CBF基因片段位于第____________泳道。 (2)构建基因表达载体：CBF基因片段和Ti质粒的酶切位点如图2、3所示，为使PCR扩增出的CBF基因片段能插入T-DNA中，需在两个引物的____________（填“5'”或“3'”）端分别添加限制酶____________的识别序列。构建重组Ti质粒时，需要利用____________将CBF基因与Ti质粒连接起来。 (3)用____________处理农杆菌，使其处于____________，再将重组质Ti粒与处理后的农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌，完成转化。 (4)使用农杆菌转化法将重组Ti质粒中的CBF基因片段导入烟草细胞中，之后可通过向培养基中加入____________来初步筛选出含有目的基因的烟草细胞；对导入目的基因的烟草细胞进行组织培养时，烟草细胞先经脱分化形成____________，该过程____________（填“需要”或“不需要”）光照。 【答案】(1) 逆转录/反转录 琼脂糖凝胶电泳 4 (2) 5' SacⅠ和NotⅠ DNA连接酶 (3) Ca2+ 感受态 (4) 潮霉素 愈伤组织 不需要 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用RNA合成DNA的过程叫作逆转录（或反转录）；可以利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR技术的扩增产物；CBF基因片段的长度为775bp，其电泳后的片段应位于标准样品750bp与1000bp之间，且更接近标准样品750bp，据图可知CBF基因片段应位于图1中的第4泳道。 （2）在构建重组质粒时，为确保CBF基因片段不被破坏，应选用限制酶SacⅠ和NotⅠ切割质粒和目的基因所在片段，所以CBF基因片段两端添加的序列所对应的限制酶是SacⅠ和NotⅠ；为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端；CBF基因片段与Ti质粒还需要使用DNA连接酶进行连接，形成重组Ti质粒。 （3）农杆菌是微生物，需要用Ca2+处理使其成为感受态细胞，易于吸收环境中DNA分子。 （4）由图2可知，潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T-DNA中，随T-DNA整合到烟草细胞的染色体DNA上，故在培养基中需加入潮霉素来初步筛选出含有目的基因的烟草细胞。植物组织培养技术中细胞或组织需经脱分化而形成愈伤组织，光照会影响愈伤组织的形成，故该过程不需要光照。 9．（2026·江苏·一模）羊口疮是由羊口疮病毒（Orfvirus，OrfV）引起的一种人兽共患传染病。为研制羊口疮疫苗，将OrfV基因组中的B2L和FlL基因融合，并运用重组DNA技术构建重组质粒，如图1所示。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，具有LacZ基因的细菌能利用培养基中的物质X-gal进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。请回答下列问题： (1)为将B2L基因和FIL基因成功连接，引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生________。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后，________（填“能”或“不能”）延伸获得B2L-FIL融合基因，请从DNA聚合酶的作用特点考虑其原因是________。 (2)为了检测PCR扩增产物与预期是否相符，将三个PCR体系的扩增产物进行回收并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，条带________最可能表示B2L-FIL融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________。 (3)若B2L-F1L融合基因转录的模板链是a链，则在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶________识别序列，以便构建重组质粒。转录时，与启动子结合的酶是________。 (4)转化时常用________处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的DNA分子；用含有________的培养基筛选大肠杆菌，挑选________色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 【答案】(1) 碱基互补配对 不能 DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端） (2) 3/三 电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列（及是否产生突变） (3) EcoR I RNA聚合酶 (4) Ca2+（CaCl2溶液） 氨苄青霉素和X-gal 白 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因便于目的基因的鉴定和筛选；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生碱基互补配对。这是因为为了将B2L基因和F1L基因成功连接，需要通过引物设计使得两个基因的末端能够互补配对，从而在PCR扩增过程中形成融合基因。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后，不能延伸获得B2L-FIL融合基因。原因是DNA聚合酶只能从3'端向5'端延伸，DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端），而链①与链⑧杂交后，链⑧的3'端无法提供合适的引物结合位点，因此无法进行延伸。 （2）条带3最可能表示B2L-F1L融合基因。在琼脂糖凝胶电泳中，条带3的大小与预期的B2L-F1L融合基因大小相符，因此最可能是融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是电泳只能检测DNA片段的大小，不能确定碱基序列（及是否产生突变），进而无法确定其序列的准确性，基因测序可以精确地确定DNA序列，确保融合基因的正确性。 （3）在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶EcoRI识别序列。这是因为B2L-F1L融合基因转录的模板链是a其链，。其3'端应与启动子一侧接近。转录时，与启动子结合的酶是RNA聚合酶。RNA聚合酶能够识别启动子序列，并在启动子的指导下开始转录过程。 （4）转化时常用CaCl₂处理大肠杆菌。CaCl₂处理可以使大肠杆菌细胞壁的通透性增加，从而更容易吸收周围环境中的DNA分子。用含有氨苄青霉素和X-gal的培养基筛选大肠杆菌。氨苄青霉素抗性基因（Ampr）是质粒上的一个标记基因，只有含有重组质粒的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。同时，X-gal可以用于鉴定LacZ基因的存在与否，含有LacZ基因的菌落呈蓝色，而LacZ基因被破坏或缺失的菌落呈白色。挑选白色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。这是因为含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色，而含有空质粒的大肠杆菌菌落呈蓝色。 10．（2026·江苏·一模）别藻蓝蛋白（APC）是蓝细菌及藻类中的一种色素蛋白，其生物合成过程如图1。通过构建双质粒表达系统，实现重组别藻蓝蛋白（rAPC）合成通路在大肠杆菌中的完整表达，如图2，请回答下列问题： (1)根据图1中PCB的合成过程可判断，基因表达产物与性状之间的关系是________。APC的合成受到多种基因的控制，说明基因和性状之间并非_______关系。 (2)据图2可知，构建双质粒表达系统时，引物_______的5′端分别引入相同的限制酶识别序列，并且构建过程_______（选填“可以”或“不可以”）在同一反应体系中进行。为使不同目的基因的表达量达到适宜比例，启动子1的强度应_______（选填“大于”或“等于”或“小于”）启动子2。将APC合成通路中的关键基因分别导入两个不同质粒的优点是_______。 (3)一般用_______处理大肠杆菌以提高转化的效率。比较图2中过程④和⑤使用的培养基，前者比后者多出的成分有_______。 (4)科研人员为探究rAPC对小鼠肝癌的影响，进行了相关实验。下表为部分实验结果： 组别 抑癌率% 细胞灰度值 COX-2 VEGF PCNA 对照组 0 148.3 151.1 155.7 rAPC 低剂量组 25.2 156.2 159.2 157.5 中剂量组 36.7 161.2 159.9 162.3 高剂量组 43.1 165.1 163.5 164.9 化疗药物（CY）组 51.0 165.2 166.2 206.8 注：COX-2、VEGF和PCNA基因与肿瘤生长有关；细胞灰度值越大，相对应的基因表达量越小。 下列关于实验结果的分析，合理的有_________。 a.rAPC组与CY组对比，能说明rAPC具有抑癌作用 b.rAPC能抑制肿瘤的生长，但抑制作用不具有剂量效应 c.rAPC和CY均能抑制肿瘤细胞中COX-2、VEGF和PCNA基因的表达 d.COX-2、VEGF和PCNA在肝癌的发生和发展过程中可能具有协同作用 【答案】(1) 基因通过控制酶的合成控制代谢过程，进而控制生物的性状 （简单的）一一对应 (2) 2和3 不可以 大于 分别调控不同基因的表达（降低载体构建的难度、避免单个载体容量有限、减轻受体细胞在代谢上的负担） (3) Ca2+ 壮观霉素和卡那霉素和琼脂 (4)cd 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）从图1中PCB的合成过程可知，血红素转化为PCB需要血红素氧化酶（HO1）和胆绿素还原酶（pcyA）的催化，这体现了基因表达产物与性状之间的关系是基因通过控制相关酶的合成间接控制生物的性状。APC的合成受到APC-α基因、APC-β基因等多种基因的控制，说明基因和性状之间并非一一对应关系。 （2）由图1可知，APC-α基因表达的APC-α肽链和APC-β基因表达的APC-β肽链最终需要连接和组装，再结合图2可知，需要在APC-α基因的下游和APC-β基因的上游添加Sac Ⅰ识别序列，所以在构建双质粒表达系统时，引物2、3的5′端分别引入相同的限制酶识别序列，并且构建过程不可以在同一反应体系中进行，原因是目的基因上含有相同的酶切位点，如果在同一反应体系进行，可能造成目的基因相连。启动子1在目的基因（APC）的上游，启动子2在目的基因（HO1\pcyA\cpcs\cpcu）的上游，要获得的是APC（αβ）3，说明每个这个三聚体需要3个α和β，而合成其的裂合酶可能可以重复使用，所以为使不同目的基因的表达量达到适宜比例，启动子1的强度应大于启动子。将APC合成通路中的关键基因分别导入两个不同质粒的优点是分别调控不同基因的表达（降低载体构建的难度、避免单个载体容量有限）。 （3）一般用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于感受态，以提高转化效率。过程④是筛选含重组质粒的大肠杆菌，过程⑤是克隆化培养，前者比后者多出的成分有壮观霉素、卡那霉素和琼脂，用于筛选成功导入质粒的大肠杆菌。 （4）a、rAPC组与对照组对比，低、中、高剂量组的抑癌率均大于对照组，才能说明rAPC具有抑癌作用，a错误； b、由表中数据可知，随着rAPC剂量增加，抑癌率逐渐升高，说明rAPC能抑制肿瘤的生长，且抑制作用具有剂量效应，b错误； c、根据注“细胞灰度值越大，相对应的基因表达量越小”，rAPC组和CY组中COX-2、VEGF和PCNA的细胞灰度值均大于对照组，所以rAPC和CY均能抑制肿瘤细胞中COX-2、VEGF和PCNA基因的表达，c正确； d、因为COX-2、VEGF和PCNA基因与肿瘤生长有关，它们在肝癌的发生和发展过程中可能具有协同作用，d正确。 故选cd 基因工程相关技术 考点2 一、非选择题 1．（2026·江苏南通·一模）限制性核酸内切酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmBⅠ实现多DNA片段无缝连接的技术称为Golden Gate克隆，其过程如图2.请回答下列问题。 (1)由图1可知，BsmBⅠ酶切DNA中的________键，产生________（类型）末端。BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端________（填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。 (2)PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，其原因有________、________。过程②需要的酶有________。 (3)片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为________（接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列________（接头序列用小写字母表示）。 (4)据图1、2分析，GoldenGate克隆技术的优点有________。 a.不受天然酶切位点的限制 b.实现多片段一次性有序连接 c.有利于大片段DNA的高效连接 d.片段1~n之间不会引入外源序列实现无缝连接 【答案】(1) 磷酸二酯 黏性 可能相同 (2) 不同PCR反应的退火温度有差异 不同引物间会互补配对 BsmBⅠ酶、DNA连接酶 (3) 5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3' 5'CGTCTCNgtgcTGTA……3' (4)abd 【分析】基因工程中无缝克隆技术的相关知识，涉及到质粒的线性化、目的基因的扩增、酶的作用原理、重组质粒的导入和培养等内容。在基因工程中，质粒是常用的载体，通常为环状双链DNA分子。线性化质粒意味着将环状的质粒打开，形成线性结构。 【详解】（1）限制性核酸内切酶切割的是DNA中的磷酸二酯键。由图1可知，BsmBⅠ切割后产生的是黏性末端。因为其识别序列及切割位点位于接头序列两侧，如果接头序列相同切割后产生的两个末端是相同的，如果接头序列不相同切割后产生的两个末端是不相同的，所以BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端可能相同。 （2）PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，一方面是因为不同片段长度不同，PCR反应条件（如退火温度等）可能不同，在同一体系中难以同时满足；另一方面，不同片段的引物都含有BsmBⅠ识别序列，不同引物之间可能会互补配对，影响PCR的进行。过程②是将片段与质粒连接形成重组质粒，需要的酶是限制酶（BsmBⅠ酶）和DNA连接酶。 （3）据图可知片段1和片段2经PCR后需要连接在一起，即R1被切割后形成的黏性末端需和F2被切割后形成的黏性末端互补，据图1可知，限制性核酸内切酶BsmBⅠ切割后的黏性末端为接头序列，由于R1序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列由识别序列和接头序列以及片段2部分序列组成，即5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3'。由R1序列可知本方案接头序列属于片段1的一部分，所以另一套方案中F2中的接头序列可以用片段二的一部分（前4个碱基）即5'CGTCTCNgtgcTGTA……3'，而R1则为5’CGTCTCNgcacCGACCAAAT…3’ （4）a、通过设计接头序列，可以在任意位置引入酶切位点，所以不受天然酶切位点的限制，a符合题意； b、从图2可以看出，多个片段可以一次性有序连接，b符合题意； c、该技术可以实现多片段的连接，有利于小片段DNA的高效连接，c不符合题意； d、片段1~n之间通过接头序列碱基互补原则连接，不会引入外源序列实现无缝连接，d符合题意。 故选abd。 2．（2026·江苏·一模）环介导恒温扩增技术（LAMP），因操作简便，能快速、精确地进行基因扩增而得到广泛的应用。LAMP使用的酶是有链置换效应的Bst DNA聚合酶，其原理如下图1所示，请回答下列问题： (1)LAMP技术温度控制在63℃左右，与常规PCR相比，其简化之处是不需要_______；另一个简化之处是通过肉眼观察有无白色沉淀焦磷酸镁即可判断靶基因是否复制，推测其中的焦磷酸来自_______水解。 (2)如上图1，针对靶基因上的6个区域设计了4条引物，其中决定主要产物长度的是___，由引物F3延伸出子链的作用是_______。部分单链DNA两端成环状，环状结构中局部双链的形成依赖_______原则。 (3)将LAMP技术用于猕猴桃褪绿环斑相关病毒（AcCRaV）的核酸检测，为找到最适宜的靶序列扩增温度，研究者设定56-63℃温度梯度，并进行染色、电泳等操作后，得到下图2实验结果。据图可知，此靶序列最佳扩增的温度为_______℃，电泳后出现梯形条带，该结果说明_______。 (4)将LAMP技术用于新冠病毒（SARS-CoV-2）的核酸检测，先要进行如下操作： 实验步骤 简要操作过程 _______ 用医用棉签从上呼吸道采集咽拭子或鼻拭子，然后低温封存并送检测机构进行检测 _______ 向样本中加入Trizol裂解蛋白质成分，再加入氯仿并离心，吸取上层水相置于新的EP离心管中，加入等体积的异丙醇，离心弃上清液，加入乙醇洗涤，离心弃上清液，晾干后加入DEPC水解液破坏RNA水解酶。 合成cDNA 向样本中加入缓冲液、______和dNTP，在PCR仪中获得cDNA产物。 【答案】(1) 变性、复性、延伸过程的循环/温度循环 dNTP (2) 2条内部引物/FIP、BIP 促进链置换，增加模板数量 碱基互补配对 (3) 62 LAMP技术扩增得到的DNA不等长 (4) 采集样本 提取RNA 逆转录酶#引物 【分析】环介导恒温扩增技术（LAMP）是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件下保温一定时长，即可完成核酸扩增反应。常规PCR反应过程包括变性（当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链）、复性（当温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）、延伸（当温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）。 【详解】（1）由图1可知，与常规PCR相比，LAMP技术温度控制在63℃左右，其简化之处是不需要变性、复性、延伸过程的循环（或温度循环）。利用LAMP技术扩增基因时所用原料为dNTP，dNTP脱去两个磷酸基团后余下的部分为脱氧核苷酸，据此可推测用于形成焦磷酸镁的焦磷酸来自dNTP水解。 （2）由图1可知，内部引物FIP、BIP分别与目标DNA模板中的F2c、B2c通过互补配对结合在一起，并从相应内部引物的3′端开始延伸子链，进而获得主要产物，说明决定主要产物长度的是2条内部引物（或FIP、BIP）。外部引物F3与目标DNA中的F3c互补配对并启动链置换DNA合成，释放FIP连接的互补链，由此可推知：由引物F3延伸出子链的作用是促进链置换，增加模板数量。部分单链DNA两端成环状，环状结构中局部双链的形成依赖碱基互补配对原则。 （3）图2显示，62℃时呈现的大小不一的梯形条带最明显，而且与M（DNA分子标准）的相似度最高，说明此靶序列最佳扩增的温度为62℃。电泳后出现梯形条带，该结果说明LAMP技术扩增得到的DNA不等长。 （4）由题意可知：①用医用棉签从上呼吸道采集咽拭子或鼻拭子，然后低温封存并送检测机构进行检测，属于检测操作步骤中的采集样本。②向样本中加入Trizol裂解蛋白质成分，再加入氯仿并离心，吸取上层水相置于新的EP离心管中，加入等体积的异丙醇，离心弃上清液，加入乙醇洗涤，离心弃上清液，晾干后加入DEPC水解液破坏RNA水解酶。该操作的目的是提取新冠病毒的RNA。③以新冠病毒的RNA为模板合成cDNA是在逆转录酶的催化下完成的。在PCR仪中获得cDNA产物，需要能够与模板链结合的引物，以便延伸子链。 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $