1.2微生物的培养技术及应用课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

食用自制酸奶导致肠胃不适屡见不鲜 葡萄酒、酸菜等变质 Q1、失败的原因是什么？ 主要原因是在制作过程中有杂菌混入，大量繁殖 微生物 ？ 微生物 难以用肉眼观察的微小生物的统称。 无细胞结构 原核细胞 真核细胞 微生物的类群 病毒：SARS病毒、 新冠病毒等RAN病毒； 噬菌体等DNA病毒 细菌:蓝细菌、 大肠杆菌、乳酸菌等； 放线菌:链霉菌等 真菌：酵母菌、毛霉等； 原生生物：草履虫、 变形虫等 SARS冠状病毒 新冠病毒 大肠杆菌 乳酸杆菌 毛霉 草履虫 本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。 制作工具和原料灭菌 控制发酵条件避免杂菌进入 接种纯的菌种 微生物的无菌培养技术 食用自制酸奶导致肠胃不适屡见不鲜 葡萄酒、酸菜等变质 Q2、怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？ 实验室培养微生物的要求： 防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。 ①提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件 ②确保其他微生物无法混入 ③并将需要的微生物分离出来 培养基 无菌技术 纯化培养 人教版 选择性必修3 第1章 第2节 6 一、培养基 人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其__________的营养基质。 1.概念 营养物质 生长繁殖 2.作用 培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物 3.类型： 有无琼脂 固体培养基 液体培养基 分离、计数、鉴定等 扩大培养、工业生产 琼脂易溶于沸水，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。 固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。 知识拓展——菌落 菌落是鉴定菌种的重要依据 菌落:是指由单个微生物细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞群体。 念珠菌 霉菌 酵母菌 放线菌 不同菌落的菌落特征，如形状、大小、颜色等不同。 问：一个菌落是一个种群还是一个群落？ 3.分类 按物理性质分 类别 特点 用途 液体培养基 不加琼脂 工业生产（连续培养） 固体培养基 加琼脂 （多1.5%-2.5%） 微生物分离、鉴定活菌计数、保藏菌种 半固体培养基 加琼脂 （少0.2%-0.7%） 观察微生物运动、分类鉴定、保藏菌种 液体培养基 半固体培养基 3.分类 选择培养基： 鉴别培养基： 加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂。用于鉴别不同类型的微生物。 根据某种微生物的特殊营养要求配置。允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 按功能分 具体处理 原理 目的 选择培养基 加入青霉素的培养基 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用 不加氮源不加氮源的无氮培养基 固氮微生物能利用空气中的氮气 不加含碳有机物的无碳培养基 自养型微生物能利用 无机碳源 分离酵母菌、霉菌等真菌 分离固氮菌 分离自养微生物 3.分类 按功能分 一、培养基 具体处理 原理 目的 鉴别培养基 加入酚红指示剂的培养基 尿素被分解产生氨，培养基呈碱性，酚红指示剂变红。 加入刚果红的培养基 刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。 鉴别分解尿素的细菌 鉴别纤维素分解菌 加入刚果红的培养基 加入酚红指示剂的培养基 3.分类 按功能分 3.分类 按化学成分分 一、培养基 合成培养基： 用已知的化学物质配制 天然培养基： 含有化学成分还不清楚或化学成分不明确的天然物质。 配制实验室常用培养基和工业生产 用于实验室中进行的营养、代谢、遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究 4.成分 （1）基本成分：碳源、氮源、水、无机盐 ①碳源： 无机碳源： CO2、CO32-、HCO3- 有机碳源： 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等 自养微生物 异养微生物 功能：构成细胞物质和一些代谢产物；有机碳既是碳源又是能源。 ②氮源： 无机氮源： NH4＋、NO3-、NH3等 有机氮源： 蛋白胨、牛肉膏、尿素、氨基酸等 固氮微生物 功能：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等。 来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。 ③无机盐： Ca、K 、Mg为大量元素 Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素 注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源 功能：提供无机营养、调剂PH、 维持渗透压 ④水： 功能：①良好的溶剂；②维持生物大分子结构的稳定等 3.含有C、H、O、N的有机物可作为 微生物的碳源、氮源、能源； 微生物 碳源 氮源 能源 蓝细菌 硝化细菌 根瘤菌 大肠杆菌 CO2 NH4＋、NO3-等 光能 CO2 NH3 NH3氧化的化学能 糖类等有机物 N2 有机物中的化学能 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质、NH4＋、 NO3-等 有机物中的化学能 1.自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于 ； 2.无机氮源不但能给有些自养型微生物提供 ，也能作为 ， 碳源 氮源 能源物质 异养型 NH3：既是硝化细菌的氮源，又是它的能源物质 光能自养 化能自养 异养、固氮菌 异养 4.同一种物质不能既做碳源又做氮源（ ） 牛肉膏或蛋白胨，可为异养微生物提供碳源和氮源 × （1）基本成分 4.成分 （2）特殊需求： pH、特殊营养物质（如维生素,氨基酸和碱基)，O2等 微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物 特殊需求 维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 添加维生素 pH调至酸性 pH调至中性或弱碱性 无氧 ① 含有C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。 ② 自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。 因此可以根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。 ③无机氮源不但能给自养型微生物提供氮源，也能作为能源物质， 如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。 ④微生物常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；常用的无机氮源是铵盐、 硝酸盐 特别提醒 ⑤病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活，目前不能利用 人工培养基来培养 1．微生物的培养需要配制培养基，以下叙述合理的是( ) A.培养基中都含有碳源、氮源、水、无机盐 B.因成分不同，培养基可分为固体培养基和液体培养基 C.培养基中的氮源能提供氮元素，但不能作为能源物质 D.筛选自养型微生物时，培养基中不需要加碳源 D 随堂演练 2.下表是某种微生物培养基的成分。以下说法错误的是（    ） A．此培养基可用来培养自养型微生物 B．此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源 C．若除去①，此培养基可培养固氮菌 D．培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源 C 随堂演练 3.分析基础培养基实例——牛肉膏蛋白胨培养基，回答问题： （1）分析该培养基的营养构成，上述实例属于固体/液体培养基？为什么？ 液体培养基 未加琼脂 （2）为什么培养基需要氮源？（P10旁栏思考） 培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。 （3）所有微生物是否都可以用培养基进行培养？ 否。病毒是没有细胞结构微生物,必须在活细胞内寄生。 随堂演练 二、无菌技术 消毒 使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 灭菌 指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。 芽孢是某些细菌（芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、芽孢乳酸菌属等）在营养条件缺乏时，在菌体内形成的一个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体； 孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞，它是 有丝分裂或减数分裂的产物。 芽孢和孢子具有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射。 获得纯净微生物培养物的关键是： 防止杂菌污染 1、常用的消毒方法 煮沸消毒法 100℃煮5～6min。 可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。 巴氏消毒法 62～65℃煮30min或80～90℃下处理0.5～1min。可杀死绝大部分微生物，不破坏食物的营养成分。 化学药物消毒法 用75%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。 紫外线消毒 对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。 2、常用的灭菌方法 湿热灭菌 利用 沸水 流通蒸汽 高压蒸汽 进行灭菌的方法 效果最好：高压蒸汽灭菌 100 kPa 121℃ 15-30 min 培养基、无菌水等（需要保持一定的水分） 适用对象： 优点： 操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不破坏。 高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性 ①使用前必须先将锅内冷空气排尽，才能达到预设的压力和温度。 ②灭菌完成时，待锅内压力自然降到０时，再打开气阀。 2、常用的灭菌方法 干热灭菌 灭菌物品 放入 密闭容器 160~170℃ 1~2h 耐高温和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具。 适用对象： 原理： 使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等 接种环 涂布器 2、常用的灭菌方法 灼烧灭菌 接种工具 涂布器 接种环 接种针 其他金属工具 接种过程 试管口 瓶口 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 二、无菌技术 实验前： 对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行 。 对将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行 。 操作时： 避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触。 实验操作在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。 实验后： 培养基需灭菌之后再丢弃，避免污染环境或感染操作者。 清洁和消毒 灭菌 超净工作台 二、无菌技术 无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？ 无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。 注意： ①实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。 ②使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 1.下列有关无菌技术的说法，正确的是( ) A.无菌技术的关键是杀灭实验室中的所有的微生物 B.培养微生物的试剂和器具都要进行湿热灭菌 C.经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，不能在常温下长期保存 D.无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌 C 随堂演练 2.关于消毒、灭菌的方法，下列描述错误的是( ) A.接种用的无菌操作台要进行灭菌处理 B.用巴氏消毒法处理牛奶是因为高温易破坏牛奶的营养成分 C.煮沸半小时后的凉开水中可能仍含有部分芽孢和孢子 D.先喷洒消毒液，再用紫外线照射可增强消毒效果 B 随堂演练 3.在微生物培养过程中，关于灭菌和消毒的理解错误的是（     ） A．消毒是指杀死物体表面或内部部分微生物 B．灭菌是杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 C．实验中使用后的培养基丢弃前一定要进行消毒处理，以免污染环境 D．吸管和培养皿可以采用干热灭菌法 C 随堂演练 不耐高温的液体（牛奶）： 接种室、超净工作台： 培养皿、吸管等玻璃器皿： 培养基： 家庭餐具等生活用品消毒： 4.以下器具、物品或对象与所采用的消毒或灭菌方法分别是什么？ 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂消毒 紫外线消毒 灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌 接种环等金属工具： 实验操作者的双手： 随堂演练 三、微生物的纯培养 （一）培养物、纯培养物、纯培养概念辨析： 培养物 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体。 纯培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 纯培养 获得纯培养物的过程。 配制培养基 灭菌 接种 分离 培养 （二）酵母菌的纯培养 1.实验原理 (1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落 分散或稀释 繁殖 单个细胞 微生物群 单个菌落 酵母菌菌落 大肠杆菌菌落 金黄色葡萄球菌菌落 青霉菌菌落 菌落的大小、形状、颜色、透明度、光泽度等是鉴定菌种的重要依据。 （二）酵母菌的纯培养 1.实验原理 分散或稀释 繁殖 单个细胞 微生物群 单个菌落 (2)单菌落：将单个微生物分散在固体培养基上，得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 平板划线法 稀释涂布平板法 （二）酵母菌的纯培养 2.实验目的 ① 学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板 ② 学会进行无菌操作 ③ 尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落 3.材料用具 酵母菌培养液 提供接种用的酵母菌 配制酵母菌固体培养基 马铃薯 葡萄糖（或蔗糖） 蒸馏水 琼脂 （二）酵母菌的纯培养 3.材料用具 天平，小刀，纱布，烧杯，锥形瓶，棉塞、牛皮纸（或报纸）； 皮筋，培养皿，接种环，酒精灯，超净工作台； 高压蒸汽灭菌锅，干热灭菌箱和恒温培养箱等； 高压蒸汽灭菌锅 干热灭菌箱 超净工作台 4.方法步骤 (1)制备培养基 配制培养基 → 灭菌 → 倒平板 ①配制培养基 称取去皮的马铃薯200 g 切成小块 加水1000 mL，加热煮沸至马铃薯软烂 用纱布过滤 得到滤液 滤液中加入20 g葡萄糖(蔗糖)，15-20 g琼脂 用蒸馏水定容至1000mL 4.方法步骤 (1)制备培养基 配制培养基 → 灭菌 → 倒平板 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞 包上牛皮纸，并用皮筋勒紧 再放入高压蒸汽灭菌锅中，压力100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min 牛皮纸：在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞； 在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用。 思考：如果要调节培养基的pH，应该在灭菌前还是灭菌后？ 灭菌前调pH 4.方法步骤 (1)制备培养基 配制培养基 → 灭菌 → 倒平板 放入干热灭菌箱内，160 -170℃灭菌2h 取5-8套培养皿包成一包用几层牛皮纸包紧 4.方法步骤 (1)制备培养基 配制培养基 → 灭菌 → 倒平板 待培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。 避免周围环境中微生物的污染 4.方法步骤 (1)制备培养基 配制培养基 → 灭菌 → 倒平板 待培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。 目的：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基 不能完全打开皿盖，避免杂菌污染培养基 目的：避免培养基表面的水分过快地挥发；防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 （1）培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 用手触摸，刚刚不烫手即可。 将所倒空白平板放入恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落。 （3）怎么确定所倒平板未被杂菌污染？ （2）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 （4）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 不能。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 问题讨论1 ——平板划线法 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经过数次划线后培养，可以分离到单菌落。 连续划线法 分区划线法 4.方法步骤 (2)接种和分离酵母菌 1 2 3 5 4 ——平板划线法 4.方法步骤 (2)接种和分离酵母菌 ——平板划线法 4.方法步骤 (2)接种和分离酵母菌 →灼烧灭菌 1 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。 →避免接种环温度过高而杀死菌种。 →灼烧灭菌 →注： 仅蘸取一次 2 在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。 将试管口通过火焰。 3 4 在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。 ——平板划线法 4.方法步骤 (2)接种和分离酵母菌 5 将试管口通过火焰，并塞上棉塞。 在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。 6 灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。 7 →灼烧灭菌 →注：不要划破培养基 →注：不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。 ——平板划线法 4.方法步骤 (2)接种和分离酵母菌 平板划线法注意事项 接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次； 划线首尾不能相接； 每次划线前后灼烧接种环进行灭菌； 划线操作结束后，仍需灼烧接种环。 1 2 3 4 划线后，培养皿倒置培养。 5 思考：完成图示操作，共做了五次划线，接种环灼烧灭菌了几次？ 1 2 3 5 4 6次 问题讨论2 (1)在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 (2)平板划线时最后一次划线为何不能与第一次划线相连？ 最后一次划线已经将酵母菌稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连，则增加了酵母菌数目，得不到纯化的效果。 (3)用平板划线法接种酵母菌的过程中，牵涉到好几次灼烧接种环，每次灼烧的目的分别是什么？ 灼烧时期 目的 第一次操作 (取菌种前) 每次划 线之前 划线结束 杀死接种环上原有的微生物，避免污染培养物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者 问题讨论2 问题讨论2 (5)平板划线时不能划破培养基的原因？ ①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； ②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 (4)在观察时发现第一区有菌落生长，而第二区域无菌落生长，可能是哪个操作失误造成的？ ①接种环灼烧后未冷却直接进行划线； ②划线未从第一区域的划线末端开始。 4.方法步骤 (3)培养酵母菌 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板 (一般做三组，重复实验)和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。 3个划线平板 （重复实验） 1个不划线平板 （空白对照） 作空白对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染。 5.结果分析与评价 （1）在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？ 在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染了。 （2）在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？ 可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。 5.结果分析与评价 （3）你是如何记录实验结果的? 请与其他同学交流、互评。 可以在培养12h和24h后，分别观察菌落的大小、形状、颜色。 培养24h后，观察菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等 （一般培养时间越长，菌落越大、颜色越深） 随堂演练 1．(2024·湖南高考)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是（　　） A．①②⑤⑥ B．③④⑥⑦ C．①②⑦⑧ D．①③④⑤ D 随堂演练 2、(2023·安徽卷)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。 (1)从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于____________。 (2)若根据用途划分，该培养基属于________(填“选择”或“鉴别”)培养基。若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必需怎样更改？________________________________。 (3)在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，需要对培养基进行_________________________。 分解者 鉴别 将蛋白胨改为尿素 高压蒸汽灭菌 (4)图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是：_________________和____________________。 (5)以下过程中所利用的主要微生物的细胞结构与大肠杆菌较相似的有_______。 A．制作果酒　　 B．由果酒制作果醋 C．制作泡菜 D．制作腐乳 稀释涂布平板法 平板划线法 BC 随堂演练 无菌技术 微生物的基本培养技术 微生物的纯培养 紫外线消毒 化学药物消毒 巴氏消毒 煮沸消毒 培养基的配制 培养基的种类 培养基的营养成分 消毒 灭菌 湿热灭菌 干热灭菌 灼烧灭菌 制备培养基 接种分离 培养 基本成分：碳源、氮源、水、无机盐 特殊需求：维生素（如乳酸杆菌）等 平板划线法 配制培养基➡灭菌➡倒平板 课堂小结 如何从自然界中分离出需要的特定微生物？ 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法很难实现。该怎么办？ 纯培养 配制培养基 灭菌 倒平板 接种和分离 恒温培养 纯培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 科学史 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。如果请你来找这种耐高温的酶，你会去哪里找？ 美国黄石国家公园的热泉中有一种水生栖热菌，能在70～80℃的高温条件下生存。 从热泉中筛选出的水生栖热菌中提取出来。 思路： 耐高温的酶←耐高温生物体←高温环境； 寻找目的菌种时要根据它对___________的要求，到相应的环境中去寻找。 生存环境 耐寒微生物 耐热微生物 石油分解菌 热泉 冰川冻土层 被石油污染的土壤 实验室中微生物筛选原理: 人为提供有利于__________的条件（包括_____、_____和_____等），同时____________其他微生物的生长。 目的菌生长 营养 温度 pH 抑制或阻止 人教版 选择性必修3 第1章 第2节 ——微生物的选择培养和计数 61 一、选择培养基 1.概念 在微生物学中，将允许 生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 特定种类的微生物 抑制 阻止 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？ 【思考·讨论】选择培养基配方的设计 【资料】尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3－、NH4＋等才能被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 【思考·讨论】选择培养基配方的设计 1、如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 【思考·讨论】选择培养基配方的设计 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 【思考·讨论】选择培养基配方的设计 3.通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗？ 分离： 计数： 获得分解尿素的细菌的纯培养物 测定分解尿素的细菌的数量 可否直接制备土壤溶液，利用平板划线法接种到选择培养基上，进行培养计数？为什么？ ①平板划线法最开始的划线细菌可能会长成一片，导致无法计数。 ②灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌，导致计数偏小。 二、微生物的选择培养 1.方法 释涂布平板法 将菌液进行一系列________，然后将不同稀释度的菌液分别_______到固体培养基的表面，进行培养。 梯度稀释 涂布 (1)梯度稀释 (2)涂布平板 2.主要过程 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 3.稀释涂布平板法具体操作过程 二、微生物的选择培养 (1)梯度稀释 铲取土样，将样品装入纸袋中。 1 1 mL 1×102 1 mL 1×103 1 mL 1×104 1 mL 1×105 1 mL 1×106 1 mL 1×107 1×10 90mL无菌水 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。 2 3 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 3.稀释涂布平板法具体操作过程 (2)涂布平板 3.稀释涂布平板法具体操作过程 (2)涂布平板 ①取菌液：取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ②涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ④涂布平板：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 ③涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 滴 浸 涂 灼 3.稀释涂布平板法具体操作过程 (3)培养与观察 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。 三、微生物的数量测定 1.稀释涂布平板法 ——间接计数法 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 (1)原理: 1.稀释涂布平板法 ——间接计数法 选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 (2)计数原则: 1×102 1×103 1×104 1×105 1.稀释涂布平板法 ——间接计数法 【思考】：通过此方法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗 ？ 统计的菌落数往往比活菌的实际数目______。 少 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 1.稀释涂布平板法 ——间接计数法 (3)计算公式: 每g样品中的菌落数 = ( C ÷ V ) × M M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 【例1】某研究小组测定某地1克土壤中有多少能分解尿素的细菌。甲同学用稀释倍数105的菌液涂布了3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 【例2】如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是(　　) A.3号试管中的菌液稀释倍数为103倍 B.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数理论上是5号试管的10倍 C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×107个 D.该实验方法统计得到的结果往往会比活菌的实际数目要高 B 1.稀释涂布平板法 ——间接计数法 三、微生物的数量测定 2.显微镜直接计数法 ——直接计数法 利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 细菌计数板和血细胞计数板有什么区别 血细胞计数板 细菌计数板 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 优点 快速、直观、设备简单； 能观察微生物的形态特征。 缺点 三、微生物的数量测定 2.显微镜直接计数法 ——直接计数法 ①不能区分死菌和活菌，统计结果会_______； ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 偏大 台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 三、微生物的数量测定 2.显微镜直接计数法 ——直接计数法 = 80 ×400×104×稀释倍数 A1+A2+A3+A4+A5 1mL样品中酵母菌数= A1+A2+A3+A4+A5 80 ×400÷0.1mm3×稀释倍数 A1、A2、A3、A4、A5分别为五个中方格中的酵母菌数。 25×16型 A1 A2 A3 A4 A5 1mm3=10-3mL 三、微生物的数量测定 2.显微镜直接计数法 ——直接计数法 = 100 ×400×104×稀释倍数 A1+A2+A3+A4 16×25型 A1 A2 A4 A3 1mL样品中酵母菌数= A1、A2、A3、A4分别为四个中方格中的酵母菌数。 A1+A2+A3+A4 100 ×400÷0.1mm3×稀释倍数 1mm3=10-3mL 比较 平板划线法 稀释涂布平板法 关键 操作 菌体 获取 特点 平板 示图 共同点 接种环在固体培养基 表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 ①都能分离纯化菌种，获得单菌落； ②都是在固体培养基上进行的。 方法简单，但不能计数 可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板 小结 测定方法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法 主要用具 计数数据 优点 缺点 计算结果 计算公式 菌体本身 培养基上的菌落数 计算方便、操作简单 计数的是活菌 不能区分死菌与活菌 不适于对运动细菌的计数 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 比实际值偏小 比实际值偏大 每克样品中的菌株数 ＝(C÷V )×M 每mL含菌量＝每小格平均菌体数×400×104×稀释倍数 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 小结 1.(2025·黑吉辽卷)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C23H23CIN208。)能力强的菌株,旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是:( ) A.以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基 B.逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株 C.配制选择培养基时,需确保 pH 满足实验要求 D.用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面 D 随堂演练 2．(2023·山东等级考)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　) A．不含氮源的平板不能用于微生物培养 B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒 C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃 D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物 D 随堂演练 3．如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是(　　) A．图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同 B．图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数 C．图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器 D．图乙每次划线应从同一起点开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落 随堂演练 B 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.提出问题 （1）如何分离土壤中能分解尿素的细菌？ （2）如何计算每克土壤样品中有多少分解尿素的细菌？ 2.实验原理： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3、实验步骤 土壤 取样 样品稀释 涂布平板 微生物的观察培养 细菌的计数 酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。 铲去表层土（一般3cm左右）。绝大部分细菌分布在距地表3～8cm的土壤层。 ①取样地点要求： ②取样过程： ③注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3、实验步骤 土壤 取样 样品稀释 涂布平板 微生物的观察培养 细菌的计数 分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板 测细菌数：一般用104、105、106 稀释液 测放线菌：一般用103、104、105 稀释液 测真菌数：一般用102、103、104 稀释液 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3、实验步骤 土壤 取样 样品稀释 涂布平板 微生物的观察培养 细菌的计数 【思考】在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 第一次做这个实验可以将稀释的范围放宽一点，如将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤 取样 样品稀释 涂布平板 微生物的观察培养 细菌的计数 3、实验步骤 ①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基 选择培养基（平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤 取样 样品稀释 涂布平板 微生物的观察培养 细菌的计数 3、实验步骤 选择培养基（平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基 注：整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的_____________培养基和______培养基以判断培养基中是否含有杂菌。 2 牛肉膏蛋白胨 选择 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤 取样 样品稀释 涂布平板 微生物的观察培养 细菌的计数 放线菌：25-28℃,5-7d 霉菌：25-28℃,3-4d 细菌：30-37℃,1-2d 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 3、实验步骤 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 4、实验结果分析与评价 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 内容 现象 结论 有无杂菌污 染的判断 选择培养基 的筛选作用 样品的稀 释操作 重复组的结果 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染 选择培养基中菌落数偏高 被杂菌污染 菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他氮源 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功 若选取同一种土样，统计结果应接近 5.进一步探究 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 【思考】在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？ 例如： ①固氮微生物利用N2也能生长； ②有些微生物可以利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖。 如何鉴定分离的细菌就是尿素分解菌？ 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 【资料】这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。NH3呈碱性。 5.进一步探究 脲酶催化尿素分解成氨 → 培养基碱性增强 → 酚红变红 → 脲酶阳性 方法： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应，从而达到鉴定的作用。 伊红—亚甲蓝琼脂培养基 （鉴别大肠杆菌——菌落 呈深紫色，有金属光泽） 刚果红培养基 （鉴别纤维素分解菌 ——出现透明圈） 1.(2025·湖南·高考真题)采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是（ ） A.稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数 B.完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照 C.土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分离成乙酸 D.用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质 B 随堂演练 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无 法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下 图所示)。请回答下列问题。 随堂演练 (1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 (2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 随堂演练 高效降解菌株的筛选： 挑选透明圈直径与菌落直径比值大的菌落。 【进一步思考】根据培养结果，怎样选择出分解纤维素能力更强的纤维素分解菌？ 随堂演练 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 (3)有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数法 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 小结 Lavf57.56.101 稀释涂布平板法 - 梯度稀释 1. 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。 👉 请按住左侧的土样袋，将其拖动到锥形瓶上方松开，以加入土样。 重置实验 稀释倍数 待制备 90mL 无菌水 梯度稀释组 稀释倍数 10² 9mL 水 1 10g 土样 1000 μL 移液枪 ⚠️ 提示信息 $