2026届高三生物一轮复习课件：PCR技术

第十单元 生物技术与工程 PCR技术 2026届高中生物一轮复习 单击此处编辑母版标题样式 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 模板： 原料： 能量： 酶： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 解旋酶、DNA聚合酶等 引物： 细胞代谢提供的ATP DNA聚合酶不能从头合成子链，使DNA聚合酶从引物的3 ’端开始连接脱氧核苷酸 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 参与的组分 在DNA复制中的作用 含目的基因的DNA 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 引物（2种） 缓冲液 Mg2+ 高温 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 维持反应体系的pH 激活DNA聚合酶的活性 （PCR所用原料实为dNTP） （体外用高温代替解旋酶） (Taq DNA聚合酶) dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP） 功能：①提供原料；②提供能量 CH O H H H H H OH HC N N N C C C NH2 C H H O P O－ O O P O－ O ～ O P O－ O ～ O－ CH O H H H OH H OH HC N N N C C C NH2 C H H O P O－ O O P O－ O ～ O P O－ O ～ O－ 核糖 腺嘌呤 脱氧核糖 腺嘌呤 腺苷 腺苷一磷酸(AMP) 腺嘌呤核糖核苷酸 腺苷二磷酸(ADP) 腺苷三磷酸(ATP) 腺嘌呤脱氧核糖核苷酸 dADP dATP 引物 是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。 在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 引物结合在模板链的3’端 子链的5’端向 3’端延伸 引物的作用：为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从引物的3′端延伸子链。（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能） 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 第一步：变性 5’- -3’ 3’- -5’ 3’- -5’ 5’- -3’ 待扩增的DNA片段 变性（不需要解旋酶）： 当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 氢键 单链DNA 90℃ 因为变性的温度与氢键的数量有关。 当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 第二步：复性 3’- -5’ 5’- -3’ 5’- -3’ -5’ 3’- -5’ 5’- 引物1 引物2 3’- -3’ 复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 _________________与两条单链DNA结合。 碱基互补配对 引物结合在DNA模板链 3’端位置，引导子链从 5’端→3’端方向复制 由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需要2种引物 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 第三步：延伸 5’- -3’ -5’ 3’- -5’ 5’- 5’- -3’ -5’ 3’- 3’- -5’ 5’- -3’ 延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 由dNTP水解供能 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 PCR过程可以在 中自动完成 PCR扩增仪 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 (一）选择合适的引物 （1）若用技术扩增基因,需要在 扩增仪中加入___种引物, 其作用是____________________________________________________ ___________________________________________________。 2 引物与模板链通过碱基互补配对结合，使聚合酶能够从引物的端开始连接脱氧核苷酸，从而延伸子链 （2）在利用 技术扩增某基因过程中,利用______可寻找该基因的位置。 引物 （3）研制疫苗时,获取 蛋白基因（如图所示）选择的引物是__________。 Ⅱ 、 Ⅲ 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 PCR技术引物设计的原则： ①引物长度：一般在20-30个脱氧核苷酸之间，防止随机结合 a.引物过短，会降低扩增特异性（只扩增出目标DNA片段） b.引物过长，会影响扩增特异性，降低扩增效率（单位时间内扩增产物的量） 采取措施：提高复性温度，使引物与模板链充分结合 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 PCR技术引物设计的原则： ②引物GC含量：一般在40%~60%之间，GC含量过高或过低都会降低扩增特异性和扩增效率 a.GC含量过低，复性（退火）温度低，特异性差 b.GC含量过高，容易形成发夹结构，不利于引物与模板DNA结合；还会导致变性解链温度增大，因模板解链不充分导致特异性降低 ③引物自身及引物之间不应存在互补配对的序列 引物自身互补形成发夹状结构 引物间互补形成引物二聚体 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 ④引物的5’端可以修饰，而3’端不可以修饰 PCR技术引物设计的原则： ①引物长度：一般在20-30个脱氧核苷酸之间，防止随机结合 ②引物GC含量：一般在40%~60%之间，GC含量过高或过低都会降低扩增特异性和扩增效率 ③引物自身及引物之间不应存在互补配对的序列 1.[2025·广东揭阳月考] 利用 获得目的基 因后，用限制酶 Ⅰ 同时处理目的基因与 质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其 部分 片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是( ) A.通过 获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3 B.检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1 和引 物4进行 C.若设计的引物与模板不完全配对，为了引物能与模板链结合可适当 提高 复性的温度 D.聚合酶能与引物结合，并从引物的 端连接脱氧核苷酸 √ 2.[2024·湖南衡阳三模] 真核生物转录起始过程十分复杂， 聚合酶 往往需要与一类特定的蛋白质结合，并在其引导下与启动子结合起始 转录，我们将这类蛋白称作转录因子。某科研团队在对山葡萄的研究 过程中发现其 基因具有编码转录因子的作用，并对此展开研究。 （1）研究人员欲利用技术从山葡萄基因组中提取并扩增 基 因，除基因组和引物外还需向 仪中加入___________________ _______________________________________________。 四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、（含的）缓冲液 （2）研究人员设计并合成如图所示4种可与 基因结合的引物，结果 无论是哪对引物，除扩增出基因外，还扩增出了其他 片段，原 因可能是____________________________________。在利用现有引物 的前提下，为尽可能减少非目的 片段的产生，可先加入引物____ ______进行初次扩增，再以初次扩增产物为模板，并加入引物______ ____进行第二次扩增。 引物特异性较低或混入了其他模板 1和引物4 2和引物3 利用技术对除草剂抗性基因 进行复制的过程中，需要在缓冲液中 添加 ，其作用是__________________________________________ ______。设计引物是该技术关键步骤之一，某同学设计的两组引物 （只标注了部分碱基序列）都不合理（如图），请分别说明理由。 激活耐高温的聚合酶（或激活聚合酶） ①第1组：____________________________________________；②第2 组：______________________________________________。 引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 局部发生碱基互补配对而失效 引物 Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 3.进行前，根据已知的模板 序列，可设计合成内外引物对， 引物设计的要求有____________________________________________ _________________________________________________（答出两点 即可）；同时，为方便扩增产物后续的操作，可在引物的_____ （填“端”或“ 端”）添加限制性内切核酸酶切割位点。 能与母链碱基互补配对；两种引物之间不能构成碱基互补配对；引物的端应具有限制酶酶切位点 端 4.[2024·四川遂宁一模] 如图所示的引物中，利用获得 基因时应选择的两种引物是______________。引物核苷酸序列不宜过 短，其原因是________________________________________________ _____________________。 引物2和引物3 引物过短，则会导致引物特异性太弱，出现非特异性扩增，非目标产物增多 一、目的基因的筛选与获取 PCR技术相关循环计算： 【思考】利用PCR技术扩增目的基因时，至少要经过几次循环产生两条单链等长的目的基因？ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 第三次循环 【思考】PCR扩增的是整个模板DNA分子吗？ 不是，PCR扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段 PCR技术相关循环计算： 第1次扩增 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 共消耗引物对数：_____对 1 PCR技术相关循环计算： 第2次扩增 长链-中长链DNA____个 2 2 3 3 中长链-短链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 共消耗引物对数：_____对 3 PCR技术相关循环计算： 第3次扩增 短链-短链DNA______个 中长链-短链DNA____个 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 4 2 7 7 共消耗引物对数：_____对 7 PCR技术相关循环计算： 2 2 2 2 2 0 2 4 6 2(n-1) 0 0 2 8 2n-2n 1 3 7 15 2n-1 PCR技术相关循环计算： 2n 2 4 8 2 4 8 2n 1 3 7 2n-1 0 2 6 2n-2 1 3 7 2n-1 ①DNA分子有_____个 ②总链数_____条 ③不含引物的链数：___ ④含引物的链数_____ ⑤含引物1或2的链数：______ ⑥仅含引物1的DNA数：______ ⑦仅含引物2的DNA数：______ ⑧引物1、2均含有的DNA数：_____ ⑨不含引物的DNA数：______ ⑩需要引物的总数：______ 2n 2n+1 2 2n+1-2 循环n次： 2n-1 1 1 2n-2 0 2n+1-2 （12）等长链DNA分子数为______个 （13）不等长链DNA分子数为____个 （14）含模板链DNA分子数为____个 2n-2n 2n 2 A．第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各1个 B．第二轮循环得到4个DNA分子，即①②③④各1个 C．第三轮循环得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个X基因 D．第四轮循环得到16个DNA分子，其中有4个X基因 【变式训练1·变载体】用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，两种引物及其与模板链的结合位置如下图所示。经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是(　　) D 玉米是重要的粮食作物,其叶片细胞中的蛋白是一种水通道蛋白,由 基 因编码;科研人员成功培育出超量表达 蛋白的转基因玉米,回答下列问题。 （1）利用技术以图中的 片 段为模板扩增 基因,需要的引物有 ______（从A、B、C、D中选择）。 B、 3 30 上述过程中,至少经过___次循环后会产生双链等长的 基因片段,循环4 次共需要的引物数为____。 （2）从理论上推测,第四轮循环产物中同时含有两种引物的 片段 所占的比例为_____。经4轮循环后产物中有___种不同种类的 分 子,其中只含等长目的基因的 分子有___个。 5 8 6.[2024·湖南郴州模拟] 利用技术扩增 基因时，相应的引物结合 部位及扩增片段~如图所示。已知 基因单链片段为 ，引物1为 ，则引物2为______________________ （写出10个碱基）。使用这两种引物对一个 基因进行扩增，经5轮 循环后，如⑤所示的 分子有____个。 $