2026届高三生物一轮复习课件：基因工程的基本工具以及基本程序

第十单元 生物技术与工程 基因工程 2026届高中生物一轮复习 单击此处编辑母版标题样式 基因工程是指按照人们的愿望，通过___________等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫____________。 转基因 重组DNA技术 基因（DNA）; DNA分子水平; 基因重组（广义上）; 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品; 定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍； 操作对象 结 果 操作水平 原 理 意 义 水母的绿色荧光蛋白基因 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 （核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 苏云金杆菌 培育抗虫棉的关键步骤： DNA 目的基因切割 受体细胞内DNA拼接 害虫死亡 DNA导入 项目 理论基础 外源基因 在受体细 胞内表达 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界共用一套遗传密码 基因拼接 的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸 分子的复制都遵循碱基互补配对原则 ③双链 分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 核苷酸 核糖核苷酸 脱氧核苷酸 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U） 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） DNA的结构： DNA的结构： T A G C A T C G A T G C T A C G 磷酸二酯键 “分子手术刀”—— 限制性内切核酸酶 限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来。限制酶是细胞的一种防御性工具。当原核细胞遭到外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效。 为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 能识别 的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 作用特点： 专一性 双链DNA分子 “分子手术刀”—— 限制性内切核酸酶 EcoR I G C A A T T T A T A C G 5' 3' 3' 5' 识别序列为 GAATTC 切割部位为 GA之间 G C T T A A A A T T C G 注：限制酶特异性识别和切割的部位基本都具有回文序列： 即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。 限制酶 Bam H Ⅰ Hind Ⅲ EcoRⅠ TaqⅠ 识别序列及切割位点 GGATCC CCTAGG AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG TCGA AGCT “分子手术刀”—— 限制性内切核酸酶 切割结果 产生黏性末端、平末端 黏性末端 平末端 【思考】同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？ 不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？ ①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。 ②不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。比如BamHⅠ、BglⅡ 1.[2024·辽宁沈阳二模] 同尾酶是一类识别不同核苷酸序列但切割后产 生相同黏性末端的限制酶，依靠同尾酶的这种特性，可以根据需要将 不同的 片段进行灵活重组。下列叙述正确的是（ ） A.产生限制酶的生物大多没有核膜包被的细胞核 B.限制酶能识别和 中特定的核苷酸序列 C.限制酶可为磷酸二酯键水解提供所需活化能 D.同尾酶是一类限制酶，每种限制酶都存在其同尾酶 √ 11.切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制酶称为同尾酶。 例1.下列黏性末端属于由同种限制酶切割而成的是( ) ① ② ② A.①② B.①③ C.①④ D.②③ “分子手术刀”—— 限制性内切核酸酶 ③ 　 ④ B 倒转180°，完全相同则为同一种限制酶切割 例2.下侧黏性末端是由______种限制酶作用产生的。 3 如果要将两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？ G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 用同种限制酶切割(EcoRⅠ) 产生相同的黏性末端 “分子缝合针”—— DNA连接酶 A A T T C G G C T T A A DNA连接酶的作用是： 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两核苷酸之间的磷酸二酯键。 黏性末端之间会自发形成氢键 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 缝合__________和_______ 缝合__________和__________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________ 黏性末端 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 平末端 但E.coli DNA连接酶连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶 大肠杆菌 T4噬菌体 “分子缝合针”—— DNA连接酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 两个游离的DNA片段之间 将游离的脱氧核苷酸连接到已有DNA片段 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 要想获得人胰岛素基因（即目的基因）须用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性末端？断裂几个磷酸二酯键？消耗多少水分子？ G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G 人胰岛素基因 A A T T C G G C T T A A 人胰岛素基因 G C T T A A 2个切口、4个黏性末端、4个磷酸二酯键、4个水分子 A A T T C G ★线性DNA和环状DNA分子被限制酶切割一次后分别得到的几个DNA片段？切割两次？ GAATTC CTTAAG EcoRⅠ 2个DNA片段 1个DNA片段 “分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体 为什么需要载体？直接将目的基因导入受体细胞可以吗？ 不行，①外源基因不能自己进入细胞，需要载体帮忙。 ②即便能直接把外源基因导入受体细胞，外源基因在细胞内不能进行复制、转录和稳定存在，需要载体帮忙。 ③载体带有标记基因（如抗生素抗性基因），可以帮助科学家找到成功接收外源基因的细胞。 最常用的载体——质粒 是一种 的、结构简单、 独立于 或 之外，并具有 能力的 。 真核细胞细胞核 环状双链DNA分子 原核细胞拟核DNA 裸露 自我复制 “分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体 1.作为载体所具备的条件及原因： a.具有一个至多个 切割位点， 供外源DNA片段(基因)插入其中。 b.能在受体细胞中进行 ，或整合到受体DNA上，随受体DNA ,使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量。 c.具有特殊的 ，便于重组DNA分子的筛选。 d.对受体细胞无 作用，避免受体细胞受到损伤。 限制酶 自我复制 标记基因 同步复制 毒害 常见的标记基因： ①抗性基因 ②发光基因 ③产物具有颜色反应的基因 2．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有 、 等。 它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。 噬菌体 动植物病毒 3.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具,除具备普通“质粒载体” 的条件外,还应具有的条件是____________________________________ ___________________________________________（答出两点即可）。 对靶细胞具有较高的转化效率,不能增殖, 对细胞无害，在宿主细胞中引起的免疫反应较弱 “分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体 ★构建重组质粒（重组DNA） 人胰岛素基因 Sma I EcoR I EcoR I Hind Ⅲ BamH I 质粒1 Sma I 氨苄青霉素抗性基因 EcoR I 质粒2 Sma I 氨苄青霉素抗性基因 EcoR I Hind Ⅲ BamH I 2.用图中人胰岛素基因（目的基因）和质粒构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割，原因是？ Sma Ⅰ会破坏外源DNA中的目的基因和抗性基因 1、选择图中 （“质粒1”或“质粒2”）和人胰岛素基因（目的基因）构建重组质粒，其原因是？ 质粒2 质粒2有多个限制酶切割位点，供外源DNA(目的基因)插入其中 “分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体 人胰岛素基因 Sma I EcoR I EcoR I Hind Ⅲ BamH I 质粒1 Sma I 氨苄青霉素抗性基因 EcoR I ★构建重组质粒（重组DNA） 3.使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，而不用EcoR Ⅰ一种限制酶切割，原因是？ a.所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因 b.选目的基因两端和载体都有的酶切位点，最好双酶切 选择酶切位点的原则： 防止目的基因和质粒自身环化及质粒与目的基因会发生反向连接 2.［2023· 新课标全国卷］ 某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶 4）、 连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序 列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制 酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ） A.质粒和目的基因都用酶3切割，用 连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用 连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用 连接酶连接 √ A．获取该目的基因可采用EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ 进行酶切 B．图2所示的三种限制酶使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 C．可以用Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ酶切该DNA分子，产生不同的黏性末端 D．能被Sau3A Ⅰ切割的序列不一定能被BamH Ⅰ切割 【变式训练1·变载体】图1表示某种DNA分子上的多种限制酶切割位点，图2表示EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Sau3A Ⅰ三种限制酶识别序列和切割位点，下列相关叙述错误的是(　　) C 【变式训练2·变考法】已知某种限制性内切核酸酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如下图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是(　　) A．3　　　　B．4　　　　C．9　　　　D．12 C D最多能产生a、b、c、d、ab、cd、abc、bc、bcd共9种长度不同的DNA片段 例．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　) A．被用作载体的质粒都是未经人工改造的天然质粒 B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C．质粒是一种独立于细菌拟核外的链状DNA分子 D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 D 在基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的 作为基因工程的载体，必须具备一定的条件，而自然界中的质粒不一定具备相应的条件，因此不是所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状双链DNA分子 质粒(载体)一定能成功导入受体细胞吗？ ，因为质粒(载体)携带目的基因导入受体细胞的成功率 。 因此还需要进一步 出成功导入质粒(载体)的受体细胞。 不一定 不高 筛选 如何筛选出含质粒(载体)的受体细胞？ 质粒(载体)上的标记基因一般是 ， 而受体细胞本身 抵抗该抗生素的能力。 用含有 的培养基培养受体细胞，能够生存的是 。 某种抗生素的抗性基因 没有 该抗生素 被导入了载体的受体细胞 根据标记基因的作用，在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞一定是导入目的基因的受体细胞吗？为什么？ 将此质粒载体用BanH I酶切后，与用BanHI酶切获得的目的基因混合，加人DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。 未被转化的大肠杆菌 (普通大肠杆菌) 含有环状目的基因的大肠杆菌 含有质粒载体的大肠杆菌 含有插入了目的基因的重组质粒 的大肠杆菌 含有氨苄青霉素的培养基进行筛选： 未被转化的大肠杆菌 (普通大肠杆菌) 含有环状目的基因的大肠杆菌 含有质粒载体的大肠杆菌 含有插入了目的基因的重组质粒 的大肠杆菌 未被转化的和仅含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是______________________________________________________________；并且____________________和____________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是_______________________________________________________________ 二者均不含氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不能生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________________的固体培养基。 四环素 如何提高筛选的准确性? 根据标记基因的作用，在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞一定是导入目的基因的受体细胞吗？为什么？ 原因：导入 的和导入 的受体细胞均能在该培养基中存活。 空载体 含目的基因载体 不一定 当质粒(载体)上有两个标记基因时， 可将目的基因插入其中一个标记基因中， 也就是重组质粒上含有 标记基因， 普通质粒上含有 标记基因。 则 的受体细胞不具有标记基因控制的性状， 的受体细胞具有两个标记基因控制的性状， 的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。 这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒 的受体细胞。 一个 两个 没有导入质粒 导入普通质粒 导入重组质粒 例．某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　) 插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的 培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A．①是c； ②是b； ③是a B．①是a和b； ②是a； ③是b C．①是a和b； ②是b； ③是a D．①是c； ②是a； ③是b A 【变式训练2·变载体】在基因工程中，筛选含有目的基因的受体细胞过程特别重要。下图中pUC18是一种常用质粒，其中ori为复制原点，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，LacZ基因能合成某种酶，该酶能将无色染料X-gal变成蓝色。已知目的基因插入的位置如图所示，为快速筛选出获得目的基因的大肠杆菌，平板培养基内除了大肠杆菌生长所必需的营养物质和琼脂外，还必须加入(　　) C 插入的目的基因破坏了LacZ基因，不能合成将无色染料X-gal变成蓝色的酶，但没有破坏氨苄青霉素抗性基因，能在含氨苄青霉素和无色染料X-gal的培养基中生存且不会将无色染料X-gal变成蓝色的菌落即为含有目的基因的大肠杆菌。 A．氨苄青霉素 B．无色染料X-gal C．氨苄青霉素和无色染料X-gal D．氨苄青霉素或无色染料X-gal 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 （核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 苏云金杆菌 培育抗虫棉的关键步骤： 一、目的基因的筛选与获取 目的基因： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 主要指的是编码蛋白质的基因，也可是一些具有调控作用的因子。 基因结构 基因结构 ①原核细胞的基因结构 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 本质： 位置： 作用： 是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因上游； 终止子 也是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因下游； 终止转录 本质： 位置： 作用： RNA聚合酶识别并结合的位点， 驱动基因转录出mRNA 基因结构 ②真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶 识别结合位点 内含子 外显子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 编码区 非编码区 真核细胞的基因结构 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 ：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子 非编码序列：包括非编码区和内含子 基因结构 ②真核细胞的基因结构 一、目的基因的筛选与获取 目的基因： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 主要指的是编码蛋白质的基因，也可是一些具有调控作用的因子。 目的基因的筛选 目的基因的获取 一、目的基因的筛选与获取 1.目的基因的筛选 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 实例：苏云金杆菌——Bt基因（培育转基因抗虫棉） 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的_____________结合，导致___________，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的______性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈_____性，肠道细胞也没有______________。因此，Bt 抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 细胞膜穿孔 特异性受体 碱 酸 特异性受体 ②利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因。 一、目的基因的筛选与获取 1.目的基因的筛选 ③从基因文库中获取 ★目的基因的序列和位置未知 基因组文库 含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体 cDNA文库 含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体 基因组文库 cDNA文库 一、目的基因的筛选与获取 基因组文库 提取某种生物的全部DNA 一定大小的DNA片段 导入受体菌（细菌）中储存 用适当的 限制酶酶切 将DNA片段 与载体连接 所有基因 ★缺点：工作量大、盲目性 1.目的基因的筛选 ③从基因文库中获取 【思考】将人的胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中会产生人胰岛素吗？ ①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子； ②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（如：内质网、高尔基体等）。 一、目的基因的筛选与获取 1.目的基因的筛选 ③从基因文库中获取 提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA 单链DNA（cDNA） 双链DNA片段（cDNA） 导入受体菌中储存 cDNA文库 逆转录酶 DNA聚合酶 与载体连接 部分基因 ★缺点：mRNA不稳定、技术要求高 使用cDNA文库获得目的基因更加高效，去除了不能编码蛋白质的序列。 （如非编码区、内含子） 一、目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取 ①人工合成法 前提：基因比较小、核苷酸序列已知 方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因 DNA合成仪 一、目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取 ②利用PCR获取和扩增目的基因 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 模板： 原料： 能量： 酶： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 解旋酶、DNA聚合酶等 引物： 细胞代谢提供的ATP DNA聚合酶不能从头合成子链，使DNA聚合酶从引物的3 ’端开始连接脱氧核苷酸 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 参与的组分 在DNA复制中的作用 含目的基因的DNA 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 引物（2种） 缓冲液 Mg2+ 高温 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 维持反应体系的pH 激活DNA聚合酶的活性 （PCR所用原料实为dNTP） （体外用高温代替解旋酶） (Taq DNA聚合酶) dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP） 功能：①提供原料；②提供能量 CH O H H H H H OH HC N N N C C C NH2 C H H O P O－ O O P O－ O ～ O P O－ O ～ O－ CH O H H H OH H OH HC N N N C C C NH2 C H H O P O－ O O P O－ O ～ O P O－ O ～ O－ 核糖 腺嘌呤 脱氧核糖 腺嘌呤 腺苷 腺苷一磷酸(AMP) 腺嘌呤核糖核苷酸 腺苷二磷酸(ADP) 腺苷三磷酸(ATP) 腺嘌呤脱氧核糖核苷酸 dADP dATP 引物 是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。 在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 引物结合在模板链的3’端 子链的5’端向 3’端延伸 引物的作用：为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从引物的3′端延伸子链。（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能） 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 第一步：变性 5’- -3’ 3’- -5’ 3’- -5’ 5’- -3’ 待扩增的DNA片段 变性（不需要解旋酶）： 当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 氢键 单链DNA 90℃ 因为变性的温度与氢键的数量有关。 当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 第二步：复性 3’- -5’ 5’- -3’ 5’- -3’ -5’ 3’- -5’ 5’- 引物1 引物2 3’- -3’ 复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 _________________与两条单链DNA结合。 碱基互补配对 引物结合在DNA模板链 3’端位置，引导子链从 5’端→3’端方向复制 由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需要2种引物 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 第三步：延伸 5’- -3’ -5’ 3’- -5’ 5’- 5’- -3’ -5’ 3’- 3’- -5’ 5’- -3’ 延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 由dNTP水解供能 一、目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 PCR过程可以在 中自动完成 PCR扩增仪 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 （核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 苏云金杆菌 培育抗虫棉的关键步骤： 二、基因表达载体的构建（核心） 目的：让基因在受体细胞中_______________________________________。 稳定存在、遗传、表达和发挥作用 插入目的基因 启动子 启动子： 本质： 有特殊序列结构 片段 位置：基因的 。 功能： 识别和结合的部位，驱动基因转录出 。 DNA 上游 RNA聚合酶 mRNA 终止子 终止子： 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能：终止 。 DNA 下游 转录 复制原点 标记基因 一般具有多种限制酶切位点 ① 组成型启动子 ② 组织特异性启动子 ③ 诱导型启动子 人为根据需要增加 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 DNA片段 DNA片段 mRNA上 三个相邻的碱基 mRNA上 三个相邻的碱基 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止转录 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 二、基因表达载体的构建（核心） 目的：让基因在受体细胞中_______________________________________。 稳定存在、遗传、表达和发挥作用 插入目的基因 启动子 终止子 复制原点 复制原点： DNA复制的起始位点 标记基因 标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 二、基因表达载体的构建（核心） 构建过程： 重组 DNA分子 DNA连接酶 获取目的基因 限制酶 目的基因 限制酶切割位点 基因表达载体构建模式图 限制酶 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 质粒 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶 构建程序：先用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶(同尾酶)切割载体和含有目的基因的片段，再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子 三、将目的基因导入受体细胞 基因表达载体 导入 动物 植物 微生物 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 受体细胞 转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 三、将目的基因导入受体细胞 1、花粉管通道法 方式1：子房注射法 用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中 含目的基因的DNA 溶液 方式2： 柱头处理法 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 三、将目的基因导入受体细胞 2、农杆菌转化法 (1)农杆菌： ①土壤微生物（细菌） ②自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ③ 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后（吸附但不进入植物细胞），能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 实质：基因重组 三、将目的基因导入受体细胞 2、农杆菌转化法 受体细胞为体细胞或受精卵 三、将目的基因导入受体细胞 2、农杆菌转化法 把目的基因插入到农杆菌的__________的___________上，构建重组质粒。将重组质粒转入农杆菌，然后用农杆菌侵染植物细胞。侵染过程中，目的基因随着__________转移到植物细胞，并插入到植物细胞的______________________上。转基因的植物细胞还需要通过_________________技术才能发育成转基因植株。 Ti质粒 T-DNA T-DNA 染色体DNA 植物组织培养 ［注意］农杆菌转化法的两次拼接和两次导入 第一次拼接: ___________________________________; 第二次拼接（非人工操作）:________________________________________________________； 第一次导入：___________________________________________________________________; 第二次导入（非人工操作）：_____________________________________________________。 目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上(人工构建） 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上 （自然构建） 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌(人工处理） 含目的基因的T-DNA导入受体细胞（农杆菌的转化作用） 三、将目的基因导入受体细胞 3、显微注射法（动物） 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 受体细胞为受精卵 三、将目的基因导入受体细胞 4、Ca2+处理法（微生物） 目的：增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞） 大肠 杆菌 Ca2+ 表达 载体 Ca2+ 处理法示意图 早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。转化大肠杆菌细胞最常用的方法是：首先用______处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为___________。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于______中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 Ca²+ 感受态细胞 缓冲液 3.[2024·福建福州联考] 科研人员将寒 带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果 细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下 图为培育过程中使用的 质粒示意图， 其中区的基因活化能促进 的加工和转移，下列叙述正确的是（ ） A.构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒 B.利用 扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列 C. 区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体 上 D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞 √ 四、目的基因的检测与鉴定 检测与鉴定的目的： 检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否__________________________. 稳定维持和表达其遗传特性 Bt抗虫蛋白 多肽链 转录 翻译 mRNA Bt 抗虫蛋白基因 （Bt 基因） 加工 抗虫 ★检测与鉴定内容 ： 检测棉花细胞的染色体DNA上是否插入了Bt基因 检测Bt基因是否转录出mRNA 检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白质 分子水平的检测： 个体生物学水平的鉴定： Bt基因是否赋予棉花抗虫特性以及抗性的程度 四、目的基因的检测与鉴定 ①检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上 方法1：PCR扩增技术 DNA半保留复制 原理： 非转基因棉花 转基因抗虫棉 阴性对照 Marker 转基因生物 提取DNA 根据目的基因的序列设计PCR引物 PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 四、目的基因的检测与鉴定 方法2：DNA分子杂交技术 原理： DNA-DNA碱基互补配对 DNA分子杂交（Southern-blot)流程图 带放射性同位素标记的基因探针（单链DNA片段），在一定条件下与目的基因互补配对，结合成双链，从而出现杂交带 基因探针: 32P 目的基因： 杂交 变性 ①检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上 四、目的基因的检测与鉴定 检测与鉴定的目的： 检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否__________________________. 稳定维持和表达其遗传特性 Bt抗虫蛋白 多肽链 转录 翻译 mRNA Bt 抗虫蛋白基因 （Bt 基因） 加工 抗虫 ★检测与鉴定内容 ： 检测棉花细胞的染色体DNA上是否插入了Bt基因 检测Bt基因是否转录出mRNA 检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白质 分子水平的检测： 个体生物学水平的鉴定： Bt基因是否赋予棉花抗虫特性以及抗性的程度 四、目的基因的检测与鉴定 ②检测目的基因是否转录出mRNA 如：检测Bt基因是否转录出mRNA 方法1：PCR扩增技术 提取棉花细胞mRNA 逆转录 产生cDNA 对扩增产物进行检测 用与Bt基因相关的 引物进行PCR扩增 10个PCR阳性棉花植株中，有4株Bt基因发生转录 四、目的基因的检测与鉴定 方法2：分子杂交技术 原理： DNA-RNA碱基互补配对 基因探针: 32P 转基因生物mRNA： 杂交 检测：带标记的基因探针，与目的基因转录出的mRNA在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带 分子杂交(Northern Blot)流程图 ②检测目的基因是否转录出mRNA 四、目的基因的检测与鉴定 检测与鉴定的目的： 检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否__________________________. 稳定维持和表达其遗传特性 Bt抗虫蛋白 多肽链 转录 翻译 mRNA Bt 抗虫蛋白基因 （Bt 基因） 加工 抗虫 ★检测与鉴定内容 ： 检测棉花细胞的染色体DNA上是否插入了Bt基因 检测Bt基因是否转录出mRNA 检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白质 分子水平的检测： 个体生物学水平的鉴定： Bt基因是否赋予棉花抗虫特性以及抗性的程度 四、目的基因的检测与鉴定 ③检测目的基因是否翻译出蛋白质 如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白 方法：抗原— 抗体杂交技术 原理： 抗原——抗体特异性结合 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 放射性检测 （杂交带） 四、目的基因的检测与鉴定 检测与鉴定的目的： 检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否__________________________. 稳定维持和表达其遗传特性 Bt抗虫蛋白 多肽链 转录 翻译 mRNA Bt 抗虫蛋白基因 （Bt 基因） 加工 抗虫 ★检测与鉴定内容 ： 检测棉花细胞的染色体DNA上是否插入了Bt基因 检测Bt基因是否转录出mRNA 检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白质 分子水平的检测： 个体生物学水平的鉴定： Bt基因是否赋予棉花抗虫特性以及抗性的程度 四、目的基因的检测与鉴定 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 Bt基因是否赋予棉花抗虫特性以及抗性的程度 个体生物学水平的鉴定： 4.[2024·湖北黄石一模] 如图所示，研究 人员将雪花莲凝集素基因 和尾穗苋 凝集素基因（）与载体 结 合，然后导入棉花细胞。下列操作不符 合实验目的的是（ ） A.用技术可检测和 基因是否导入棉花细胞中 B.将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞 C.用限制酶Ⅰ和连接酶处理两种基因可获得 融合 基因 D.与只用 Ⅰ 相比， Ⅰ 和 Ⅰ 联合处理融合基因和载体可保 证基因转录方向正确 √ $