第九单元 第6课时 基因工程的原理和技术（课件PPT）-【步步高】2025年高考生物大一轮复习讲义（浙科版 浙江、桂（梧州））

第6课时 基因工程的原理和技术 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将目的基因导入受体细胞和检测目的基因及其表达产物等步骤。 4.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质。 5.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。 6.活动：DNA的粗提取和鉴定。 7.活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定。 课标要求 内容索引 考点一　基因工程的工具 考点二　基因工程的基本操作步骤 重温高考　真题演练 课时精练 考点一 基因工程的工具 1.基因工程的建立 基因 新的遗传性状 表达所 需要产物 必备知识 整合 和表达 传递 遗传密码的破译 工具酶 载体 必备知识 整合 2.限制酶、 DNA连接 酶与载体 磷酸二酯键 平末端 黏性 末端 平末端 必备知识 整合 质粒 动、植物病毒 限制酶的识别序列 标记基因 必备知识 整合 3.与DNA有关的四种酶 项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用底物 切断双链DNA分子 催化2个DNA分子片段连接 催化单个脱氧核糖核苷酸连接 催化DNA分子形成单链 作用部位 ___________ ___________ 磷酸二酯键 _______________ 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键 必备知识 整合 项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 模板 不需要 _______ _______ 不需要 作用结果 ______________________ 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子 不需要 需要 形成黏性末 端或平末端 必备知识 整合 4.DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理 核蛋白变性 DNA酶 必备知识 整合 2 mol/L 蛋白质 冷酒精 絮状沉淀物 沸水浴 二苯胺 蓝色 必备知识 整合 (2)方法步骤 研磨液 尼龙纱布 上清液 必备知识 整合 冷 酒精 玻璃棒 二苯胺试剂 必备知识 整合 项目 溶解规律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液 DNA   ______ 析出 蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从 2 mol/L逐渐降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大 部分发生盐析沉淀 溶解 (3)DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 溶解 必备知识 整合 1.研究者欲将目的基因导入大肠杆菌中，现有质粒(图甲)和含目的基因的DNA片段(图乙)。 关键能力 提升 ampr是氨苄青霉素抗性基因；LacZ基因编码产生的β－半乳糖苷酶可以分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；Xma Ⅰ、Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ、Bcl Ⅰ是4种限制酶，它们切割产生的黏性末端均不相同。能筛选出成功导入重组质粒(含目的基因)的大肠杆菌的最佳组合是 组别 限制酶组合 培养基中添加的物质 菌落的颜色 A EcoR Ⅰ、Bcl Ⅰ 氨苄青霉素 蓝色 B EcoR Ⅰ、Bcl Ⅰ X－gal 蓝色 C Xma Ⅰ、Nhe Ⅰ X－gal 白色 D Xma Ⅰ、Nhe Ⅰ 氨苄青霉素和X－gal 白色 √ 关键能力 提升 若用EcoR Ⅰ、Bcl Ⅰ进行切 割，则氨苄青霉素抗性基因 被破坏，含重组质粒的大肠 杆菌无法在含氨苄青霉素的 培养基中生长，A错误； 若用EcoR Ⅰ、Bcl Ⅰ进行切割，在含X－gal的培养基中呈现蓝色的菌落也可能是导入了空质粒的大肠杆菌，B错误； 关键能力 提升 若用Xma Ⅰ、Nhe Ⅰ进行切 割，在含X－gal的培养基中 呈现白色的菌落也可能是未 导入质粒的大肠杆菌，故还 需要加入氨苄青霉素进一步筛选，C错误，D正确。 关键能力 提升 (1)限制酶的选择方法 根据目的基因两端的限制酶切点确 定限制酶的种类。 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶，但要确保质粒(如图乙)上也有这两种酶的切点。 方法规律 关键能力 提升 (2)标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体 细胞对该抗生素产生抗性。在 含有该抗生素的培养基上，能 够生存的是被导入了载体的受 体细胞(如右图所示)。 方法规律 关键能力 提升 2.(2024·金华高三模拟)从目标生物中提取分离DNA，是进行基因工程操作的基础。某兴趣小组尝试利用新鲜香蕉果肉进行DNA的粗提取及分离，下列有关叙述错误的是 A.可用蛋白酶对滤液中的DNA进行纯化 B.菜花可以作为替代香蕉果肉的材料 C.加入冷酒精后快速研磨以析出絮状物 D.设置只加二苯胺试剂的空白对照组，目的是与实验组进行颜色对照 √ 关键能力 提升 DNA不溶解于酒精，在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA钠盐，不需要快速研磨，C错误。 返回 关键能力 提升 考点二 基因工程的基本操作步骤 1.基因的结构 RNA 聚合酶 转录 转录 外显子 连续 必备知识 整合 2.基因工程的基本操作程序 基因文库 PCR 标 记基因 必备知识 整合 显微注射 农杆菌转化 必备知识 整合 PCR和核酸分子杂交 抗原—抗体杂交 特定性状并稳定遗传 必备知识 整合 (1)目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因。 必备知识 整合 方法 从基因组文库中获取 从部分基因文库，如cDNA文库中获取 化学合成法 通过PCR技术体外扩增 过程         (2)获取目的基因的方法 必备知识 整合 (3)cDNA文库和基因组文库的主要区别 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子和终止子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 必备知识 整合 文库类型 cDNA文库 基因组文库 基因获 得过程 mRNA cDNA →与 组合→导入微生物细胞→克隆 因组DNA 适当大小的DNA片段→与 组合→导入微生物细胞→克隆基 逆转录酶 限制酶 载体 载体 必备知识 整合 (1)不同组织细胞和同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库 (填“会”或“不会”)有差异，原因是 。 (2)通过PCR技术体外扩增目的基因 ①原理：模仿体内 。 会 ②条件 模板：待扩增的DNA分子 原料：4种 ，即dNTP 酶：______________ 引物：短的_________ 基因的选择性表达 DNA复制 脱氧核苷三磷酸 TaqDNA聚合酶 单链DNA 必备知识 整合 教材隐形知识 ③过程 氢键 引物 4种dNTP 耐高温的TaqDNA聚合酶 必备知识 整合 教材隐形知识 ④产物鉴定方法： 。 (3)与体内DNA复制相比，PCR技术所用TaqDNA聚合酶特点是 ； PCR扩增DNA片段大小由 决定； 在第3轮循环产物中开始出现目标DNA片段(两条核苷酸链等长的DNA分子)。 凝胶电泳 耐高温 2个引物 必备知识 整合 教材隐形知识 (4)构建重组DNA分子 ①目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代 必备知识 整合 ②重组DNA分子的组成和作用 启动子 标记基因 必备知识 整合 ③构建过程 必备知识 整合 提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 必备知识 整合 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 处理法 受体细胞 ________________ _______ 原核细胞 (5)目的基因导入受体细胞 Ca2＋ 体细胞或受精卵 受精卵 必备知识 整合 生物种类 植物 动物 微生物 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 含有目的基因的重组DNA片段→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 CaCl2溶液制备感受态细胞→基因表达载体导入 必备知识 整合 辨析　(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 必备知识 整合 (6)检测目的基因及其表达产物 必备知识 整合 3.活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 (1)实验原理 ①PCR经过多次循环 、 、 三个步骤，可获得大量的目的基因或DNA片段。 ②PCR技术扩增酵母细胞中编码核糖体RNA的DNA部分片段，长度为841 bp，通过 进行鉴定。 ③使用 对凝胶进行染色，再用 以及 脱色，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。 变性 退火 延伸 琼脂糖凝胶电泳 亚甲基蓝 75%酒精 蒸馏水 必备知识 整合 (2)方法步骤 ①PCR扩增 微量移液器 微量离心管 -20℃ 必备知识 整合 ②琼脂糖凝胶电泳 胶盒 加样孔内 必备知识 整合 亚甲基蓝 蓝色 Marker 必备知识 整合 (1)什么是引物？PCR扩增DNA时，为什么需要引物？ 提示　引物是指在体外根据目的基因的核苷酸序列人工合成的两段短的单链DNA。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。 (2)PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗?并说明理由。 提示　不需要；只需要知道目的基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。 PCR拓展知识 必备知识 整合 (3)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，请据图回答下列问题: 若一个目的基因在PCR中经过n轮循环， 理论上得到多少个DNA分子？含引物 的DNA分子有多少个？同时含两种引 物的DNA分子有多少个？共需要消耗 多少个引物？含有不等长脱氧核苷核 链的DNA分子有多少个？含等长脱氧 核苷酸链的DNA分子有多少个？ PCR拓展知识 必备知识 整合 提示　经过n轮循环，理论上得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子为2n个，同时含两种引物的DNA分子为(2n-2)个，共需要消耗(2n-2)个引物；含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子为2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子为(2n-2n)个。 PCR拓展知识 必备知识 整合 (4)PCR扩增目的基因的过程中需要解旋酶吗?请说明理由。该过程所需要的DNA聚合酶应具有什么特点? 提示　不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。 PCR拓展知识 必备知识 整合 3.(2023·浙江6月选考，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小 鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得 的4只新生小鼠的基因型，设计了引物 1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电 泳结果如图乙所示。 关键能力 提升 下列叙述正确的是 A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因 的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP 蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的 小鼠是Gata3－GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 √ 关键能力 提升 分析图中可知，启动子在左侧，GFP 基因整合到Gata3基因的右侧，启动子 启动转录后，可以使GFP基因转录， Gata3基因的启动子能控制GFP基因的 表达，A错误； 因启动子在左侧，转录的方向向右，合 成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； 关键能力 提升 整合GFP基因后，核酸片段变 长，2号个体只有大片段，所以 是Gata3－GFP基因纯合子，4 号个体只有小片段，是野生型， C错误； 用引物1和引物3进行PCR扩增， 杂合子和Gata3－GFP基因纯合子都能扩增出相应的片段，则不能区分杂合子和纯合子，D错误。 关键能力 提升 4.(2024·丽水高三质检)野生型黑麦草细胞壁中较高的木质素含量会降低其作为青储饲料的品质。D蛋白是催化木质素合成的关键酶，某研究小组通过构建含D基因部分序列正、反向片段的表达干扰载体(如图所示)，在细胞内产生双链RNA分子，诱导D基因的mRNA持续降解，培育得到低木质素含量的黑麦草。 关键能力 提升 回答下列问题： (1)D基因的正、反向目的片段的 克隆：提取野生型黑麦草叶片全 部mRNA，_______成cDNA。根 据cDNA序列选取合适的片段，分别设计正、反向目的片段的上下游______(填“相同”或“不同”)酶切位点和引物，正向片段和反向片段引物的扩增序列______(填“相同”或“不同”)，以使目的片段定向插入载体的特定位置。扩增产物经切下目的条带回收后与载体连接，形成克隆载体以用于正、反向目的片段的扩增。 逆转录 相同 不同 关键能力 提升 (2)构建D基因表达的干扰载体： Ⅰ.对含有正向片段的克隆载体 和反向片段的克隆载体分别进 行双酶切，将回收片段与经相 同酶切的中间载体用____________酶进行连接，获得含有干扰片段的重组中间载体；为使干扰片段能在受体细胞中复制，中间载体需有__________。 DNA连接 复制起点 关键能力 提升 对含有正向片段的克隆载体和 反向片段的克隆载体分别进行 双酶切，将回收片段与经相同 酶切的中间载体用DNA连接酶 进行连接，获得含有干扰片段的重组中间载体；中间载体需有复制起点，这样可以使正、反向目的片段(干扰片段)能在受体细胞中稳定存在。 关键能力 提升 Ⅱ.将干扰片段和超表达启动子插入Ti质粒的__________得到D基因的表达干扰载体，插入超表达启动子的目的是______________________________ ________________________________。 T－DNA 促进正、反向目的片段(干扰片段) 的转录，得到足量的相应RNA分子 关键能力 提升 将干扰片段和超表达启动子 插入Ti质粒的T－DNA中得 到D基因的表达干扰载体， 进而可使目的基因转移到受 体细胞的染色体DNA上，插入的超表达启动子能促进正、反向目的片段(干扰片段)的转录，进而可得到足量的相应RNA分子，用于抑制后续的翻译过程，进而使黑麦草中木质素含量下降。 关键能力 提升 (3)导入和培养：将D基因的表达 干扰载体导入农杆菌。黑麦草愈 伤组织在菌液中浸没5 min，先 置于无菌滤纸上吸去多余的菌 液，再转入无菌水浸润的滤纸上共培养3天，共培养的目的是___________ ________________________________________________________________ _______。筛选得到的愈伤组织经_________过程，培育得到再生植株。 使携带干扰 片段(目的片段)的T－DNA整合到受体细胞(黑麦草愈伤组织细胞)染色体DNA上 再分化 关键能力 提升 (4)鉴定和筛选：对转基因植株与____________________植株进行木质素含量测定与分析，筛选保留木质素含量显著______的植株。 野生型(或非转基因) 降低 返回 关键能力 提升 重温高考　真题演练 1.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可 能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中 的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养 基中能形成菌落 √ 1 2 3 4 若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向 插入，也可能反向插入，转录的产物 可能不同，A正确； 若用Pvu Ⅰ酶切，重组质粒和质粒中 都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； 1 2 3 4 Sph Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用Sph Ⅰ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 1 2 3 4 2.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 1 2 3 4 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 √ 1 2 3 4 酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意； 质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意； 1 2 3 4 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意； 若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。 1 2 3 4 3.(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1 所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片 段F2时，配制的两个反应体系中 不同的有__________，扩增程序 中最主要的不同是___________。 1 2 3 4 模板、引物 引物的设计 PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、 引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。 1 2 3 4 (2)将PCR产物片段与线性质粒载 体混合后，在重组酶作用下可形 成环化质粒，直接用于转化细菌。 这一过程与传统重组质粒构建过 程相比，无需使用的酶主要有 _______________________。 1 2 3 4 限制酶、(T4)DNA连接酶 传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)。 1 2 3 4 (3)转化后的大肠杆菌需采用含 有抗生素的培养基筛选，下列 叙述错误的有______。 A.稀释涂布平板需控制每个平 板30～300个菌落 B.抗性平板上未长出菌落的原 因一般是培养基温度太高 C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 1 2 3 4 ABC 1 2 3 4 用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误； 培养基温度太高将接种的菌落杀死，会导致抗性平板上 未长出菌落，B正确； 1 2 3 4 转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； 稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp＝1 100 (bp)，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 (4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 1 2 3 4 P3、P4 (5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_____________________________________。 1 2 3 4 电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 4.(2021·浙江6月选考，29节选)斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测、基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。 (1)由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体_________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。 1 2 3 4 富营养化 生活污水富含N、P，未经处理就大量排放，会导致水体富营养化，导致藻类大量繁殖，形成水华或赤潮。 (2)为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成______________，导入到大肠杆菌菌株DH5α中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的DH5α阳性细胞克隆，质粒载体应含有______________________________ ________________________(答出2点即可)。提取质粒后，采用________法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。 1 2 3 4 重组DNA分子 限制性内切核酸酶的识别序列、 标记基因(抗生素抗性基因) 显微注射 具有相同黏性末端的目的基因和载体DNA(如质粒)经DNA连接酶处理后，会形成重组DNA分子。与目的基因具有相同的限制性内切核酸酶识别序列，可以确保限制性内切核酸酶处理后与目的基因形成相同的黏性末端，以便与目的基因连接。标记基因(抗生素抗性基因)的存在，便于筛选含有目的基因的受体细胞。动物基因工程通常采用显微注射法将重组DNA分子导入动物受精卵中。 1 2 3 4 返回 课时精练 一、选择题 1.(2024·金华高三联考)粗提取DNA时，向鸡血细胞培养液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后得到滤液甲，在滤液甲中加入适量的物质X和氯化钠后，再次过滤得到滤液乙，在滤液乙中加入物质Y，获得DNA相对含量较高的白色丝状物。下列叙述错误的是 A.加入蒸馏水的目的是使细胞破裂 B.物质X可以是蛋白酶 C.物质Y可以是95%的冷酒精 D.滤液甲和滤液乙的成分基本相同 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 滤液甲和滤液乙的基本成分不同，其中滤液甲中主要含有蛋白质等杂质，而滤液乙中DNA较多，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2.如图是以鸡血为材料进行“DNA的粗提取和鉴定”的相关实验步骤。用高浓度(2 mol/L)的NaCl溶液可溶解DNA，低浓度使DNA析出。下列有关叙述错误的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A.图a中加入蒸馏水使细胞吸水涨破，鸡血可用猪血代替 B.图a和图c操作完成后需过滤，过滤后均取滤液 C.若在图d操作前增加低浓度NaCl溶液处理步骤d1，且重复c和d1，可除去多种杂质 D.图d在滤液中加入冷却的95%酒精后，出现的白色丝状物就是粗提取的DNA √ 猪的成熟的红细胞没有细胞核，不含有DNA，因此不能用猪血代替鸡血，A错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3.(2023·杭州高三模拟)某实验小组利用如图所示质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因 导入大肠杆菌细胞并表达。 下列叙述正确的是 A.图中的质粒用酶A切割后， 会产生2个游离的磷酸基团 B.在构建重组质粒时，可用酶A和酶C切割质粒和目的基因 C.成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长 D.若用酶B和酶C切割，可以避免质粒的自身环化 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 限制酶每一次切割质粒后 会得到两个单核苷酸链的 末端，会有2个游离的磷酸 基团，而图中的质粒含有2 个酶A的切割位点，则会产生4个游离的磷酸基团，A错误； 在构建重组质粒时，可用酶B和酶C切割质粒和目的基因，假如用酶A切割质粒，会破坏两个标记基因，B错误； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 用酶B和酶C切割质粒时 四环素抗性基因被破坏， 成功导入目的基因的大 肠杆菌可在含氨苄青霉 素的培养基中生长，C错误； 用两种限制酶切割可以避免质粒自身环化、反向连接等问题，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4.(2024·杭州高级中学高三期中)T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是 A.T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性 B.T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变 C.ATP在该反应过程中可能打开两个高能磷酸键 D.T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 √ T4 DNA连接酶有专一性，A错误； 酶在催化反应前后性质不变，故T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误； 结合题干“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连”可推测，ATP在该反应过程中可能打开两个高能磷酸键，C正确； T4 DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5.(2024·台州第一中学高三模拟)某校学习小组进行PCR实验，甲、乙、丙三位同学分别以酵母菌为材料，进行PCR扩增，各取20 μL产物进行凝胶电泳，得到的结果如图。下列叙述错误的是 A.凝胶a端靠近电泳槽的负极接线柱 B.甲同学设置的PCR循环次数可能比乙同学 的多 C.丙同学所用的引物可能与甲、乙同学的不 一样 D.丙同学扩增得到的片段比甲、乙同学的要大 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 点样孔在a端，DNA分子带负电荷，在电 场的作用下会向正极移动，故凝胶a端靠 近电泳槽的负极接线柱，A正确； 甲同学的电泳条带比乙同学条带宽，说明 甲同学扩增的DNA产物多于乙同学，故甲 同学设置的PCR循环次数可能比乙同学多，B正确； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 分析题图可知，丙同学扩增出来的产物与甲、乙同学的不同，其DNA不同，其碱基序列可能不同，故丙同学所用的引物可能与甲、乙同学的不一样，C正确； 丙同学扩增产物的电泳条带比甲、乙同 学的条带位置距离点样孔更远，说明丙同学扩增的DNA分子小，迁移速率快，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 6.PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列叙述正确的是 A.双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链 B.温度降低后，单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同 C.以2条DNA单链为模板、4种NTP为原料，经耐高温的DNA连接酶作用 在高温下合成2个新的DNA D.设置PCR仪的温度进行反应可重复循环多次，DNA呈指数式扩增 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 双链DNA在高温下解旋使得DNA双链打开，破坏的是碱基对之间的氢键，磷酸二酯键没有断裂，A错误； 当温度降低时，引物与模板末端结合，遵循碱基互补配对原则，单链DNA和引物结合的部分碱基序列互补，B错误； 以2条DNA单链为模板，以4种dNTP为原料，在耐高温Taq DNA聚合酶作用下合成2个新的DNA，C错误； PCR反应的每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即呈指数形式扩增，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 7.研究人员将雪花莲凝集素(GNA)基因和尾穗苋凝集素(ACA)基因连接成融合基因后，再与pBI121质粒载体结合并导入玉米细胞，最终获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作过程如图所示。 下列叙述正确的是 A.过程①和过程②分别需要使用 DNA聚合酶和DNA连接酶 B.可将含有重组载体的溶液滴加 到玉米授粉后形成的花粉管通 道内，获得抗蚜虫玉米新品种 C.在加入了卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞均成功导入了重组载体 D.若用PCR技术检测出玉米细胞含有融合基因，则该玉米为抗蚜虫玉米 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 过程①为获得融合基因，过程②为构建基因表达载体，两过程均需要使用DNA连接酶，A错误； 将含有重组载体的溶液滴加到 玉米授粉后形成的花粉管通道内，重组载体可通过花粉管通道进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中，可以将目的基因导入植物细胞，B正确； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 在加入了卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞，可能是成功导入重组载体的细胞，也可能是导入含有卡那霉素抗性基因的非重组载体的细胞，C错误； 用PCR技术检测出玉米细胞含有融合基因，不能说明该玉米为抗蚜虫玉米，因为还未确认融合基因是否能正常表达，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 二、非选择题 8.(2023·绍兴高三模拟)报告基因 是指一类易于检测且实验材料本 身不具备的基因。阿尔茨海默病 (AD)是由淀粉样前体蛋白(APP) 过量表达导致的神经系统退变性疾病，用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因，将EGFP基因与APP基因融合，可方便、经济、快速地筛选出促进人APP基因mRNA降解的药物。研究表明，EGFP基因与APP基因融合后，虽能全部转录但仅可合成EGFP。EGFP基因与APP基因融合过程如图所示。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 回答下列问题： (1)APP751、EGFP基因的cDNA是以其mRNA为模板经_______过程形成的。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 以mRNA为模板获得cDNA的过程称为逆转录。 逆转录 (2)据图分析，Klenow酶的作用是_________________________ _____________________。切割 pcDNA3.1质粒获得APP751基因 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 将Xba Ⅰ切割获得的黏性末端催化产生平末端 时，研究人员没有选择直接用 Hind Ⅲ、Xba Ⅰ同时切割，而是历经①→②→③的复杂过程，原因是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 若直接用Hind Ⅲ、Xba Ⅰ同时切割，产物两端都是黏性末端，而经过①→②→③可使目的基因两端分别为平末端和黏性末端，才能与被Sma Ⅰ与Hind Ⅲ酶切的载体连接 由图分析可得，①是用限制酶 Xba Ⅰ来切割，得到两个黏性 末端，而Klenow酶将Xba Ⅰ切 割获得的黏性末端催化产生平 末端，③是用限制酶Hind Ⅲ切割，得到含黏性末端的目的基因，可与④切割后的C1质粒构建成基因表达载体。若直接用Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 同时切割，产物两端都是黏性末端，而经过①→②→③可使目的基因两端分别为平末端和黏性末端，才能与被Sma Ⅰ与Hind Ⅲ酶切的载体连接。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (3)COS－7细胞来源于非洲绿猴肾成纤维细胞，培养这类细胞时，为保证细胞生长，应在合成培养基中添加_____________ _____。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 一定比例的 血清 细胞在体外培养时，培养基中 应含有细胞所需要的各种营养 物质，将细胞所需的营养物质 按种类和所需量严格配制而成 的培养基，称为合成培养基。在使用合成培养基培养题述细胞时，通常要加入一定比例的血清或其他天然成分。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9.(2024·宁波镇海中学高三模拟)乙烯受体是乙烯感受和转导信号的初始元件，广泛存在于各种植物中，并决定植物各种组织对乙烯反应的敏感性。通过对多种植物研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成可以更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体Ers1基因，通过基因工程将Ers1基因反向连接在启动子后，筛选转入反义Ers1基因的草莓，达到延长储藏期的效果。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 回答下列问题： (1)草莓DNA的提取：取草莓植株叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉碎后，加入400 μL SDS DNA提取液继续研磨，提取液中含有____________________，可防止DNA被水解。待充分研磨后收集至离心管中，离心后取①于另一干净离心管中，加入200 μL异丙醇，离心10 min 之后弃去管中的②，加入80 μL体积分数为95%的冷酒精，离心5 min之后取③保存。过程中的①②③分别是_____________________(填“上清液”或“沉淀”)。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 DNA酶抑制剂(EDTA) 上清液、上清液、沉淀 为－TTCCAATTTTAA－，则其中一种引 物设计的序列是5′____________________________3′。在PCR体系中，加入的dNTP可提供______________。PCR产物通过电泳进行分离后，可割下________回收扩增的Ers1基因。 (2)通过上述方法获得DNA后，需要通过PCR技术进行扩增Ers1基因(如图1)。为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增Ers1基因时需添加限制酶XhoⅠ(识别序列为5′－CTCGAG－3′)的识别序列。已知Ers1基因左端①处的碱基序列 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CTCGAGTTCCAATTTTAA 原料和能量 凝胶 图中有磷酸基团连接处为5′端，－OH连接处为3′端，由题意得，Ers1基因左端①处的碱基序列为5′－TTCCAATTTTAA－3′，故可设计引物5′－TTCCAATTTTAA－3′，在设计PCR引物扩增Ers1基因 时需添加限制酶XhoⅠ的识别序列5′－CTCGAG－3′，故其中一种引物设计的序列是5′－CTCGAGTTCCAATTTTAA－3′。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (3)经XhoⅠ酶切割后的载体和Ers1基因进行连接(如图)，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、Ers1基因与载体正向连接、Ers1基因与载体反向连接。为鉴定这3种连接方式，选择Hpa Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，请在图2中画出电泳结果，需标明电泳片段DNA大致长度。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案　如图所示 经Xho Ⅰ酶切后的载体和Ers1基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连(6 000 bp)、Ers1基因与载体正向连接(6 700 bp)、 Ers1基因与 载体反向连接(6 700 bp)。根据图中酶切位点可知，单个载体自连经酶切后长度为6 000 bp；Ers1基因与载体正向连接后经酶切的长度为800 bp、5 900 bp；Ers1基因与载体反向连接后经酶切的长度为300 bp、6 400 bp。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (4)将筛选得到的反向连接质粒与感受态农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌，完成_______实验。将农杆菌涂布接种于添加有卡那霉素的LB固体培养基上，目的是_______________________________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 转化 筛选含有重组质粒(反向连接质粒)的农杆菌 (5)用阳性农杆菌感染植物细胞，目的基因就会随_________整合到植物染色体DNA中，最后通过______________技术培育出完整的转基因植株。为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________________________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻，其原因是___________________________________________________________________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T－DNA 植物组织培养 全能性表达充分(再生能力强) 反义Ers1基因的转录产物与Ers1基因的转录产物碱基互补配对结合，使翻译过程受阻 由题意可知，通过基因工程将Ers1基因反向连接在启动子后，筛选转入反义Ers1基因的草莓，达到延长储藏期的效果，说明得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻，其原因是反义Ers1基因的转录产物与Ers1基因的转录产物碱基互补配对结合，使翻译过程受阻。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10.(2024·金华第一中学高三月考)人成纤维细胞生长因子FGF21是一种能改善血糖和脂质代谢的候选药物，但却存在半衰期短和易被体内代谢等缺点，导致靶组织利用率低，限制了其临床应用。研究小组将点突变FGF21基因和正常的FGF21基因通过基因工程技术分别导入X33酵母菌株和改造后的成纤维细胞CHO细胞系中，并比较两种表达系统生产的产物特点，回答下列问题： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (1)编码基因的特异性定点突变可 通过PCR方法替换个别核苷酸获 得突变基因。在PCR方法中共设 计有4条引物，其中一组引物(引物2和3，个别核苷酸差异不影响引物与模板链的结合)用来引入特定的突变。首先，为防止引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对______、______用于合成PCR产物1和PCR产物2；然后，将PCR产物1和2加入无引物的PCR反应体系得到含有定点突变的目的基因，再用引物1、4扩增目的基因，得到大量的点突变目的基因。为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶切割形成黏性末端，对引物1和引物4的要求是____________________________________________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1、2 3、4 引物1和4均带有该限制酶识别序列(不能写带有限制酶序列) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 据图PCR产物1和PCR产物2的位置分析可知，为了防止引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对1、2和3、4；因为目的基因两侧没有某种限制酶的酶切位点，所以为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶切割形成黏性末端，应该在引物1和4均带上该限制酶的识别序列。 (2)构建重组DNA时，通常选择改造的质粒作为载体，经过酶切处理的生长因子基因与质粒在DNA连接酶作用下形成重组DNA，为了提高获得重组DNA的效率，除了考虑适宜的外界条件、目的基因和质粒的浓度和DNA连接酶活性外，还需考虑____________________________________ ________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 端的种类和长短 质粒的纯度、DNA连接酶浓度、黏性末 为了提高获得重组DNA的效率，还需要考虑质粒的纯度、DNA连接酶浓度、黏性末端的种类和长短等。 (3)X33酵母菌株的诱变和筛选：将酵母菌种进行紫外线诱变后，用稀释涂布平板法进行接种，用_________________取梯度稀释的酵母菌液加到固体培养基上进行涂布，倒置培养24 h后，挑选_____________________ 的菌落，从而获得增殖能力强的酵母菌，再接种至液体培养基进行扩大培养。制备CHO细胞系，需要经过多次______培养后获得，由于这种细胞系仍保留_________特性，依然存在细胞的增殖随细胞密度增加而逐渐停止的现象。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 移液器(或取样器) 菌落直径较大(或最大) 传代 接触抑制 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 稀释涂布平板法时，可使用移液器或取样器取梯度稀释的酵母菌液加到固体培养基上进行涂布；菌落直径越大，说明增殖能力越强；制备CHO细胞系应多次分瓶培养，即进行传代培养；细胞系在传代培养过程仍具有接触抑制的特点。 (4)将重组DNA导入到X33酵母菌株，筛选后进行克隆培养获取目标产物，培养前需制备X33酵母扩大培养基，X33酵母是一种真菌，培养基一般采用在马铃薯汁中添加蔗糖配置，其中蔗糖的作用是________________；培养基灭菌前要注意调节培养基pH至__________，以满足酵母菌的生长需求；将培养基放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，当锅内压力升到_________ ___________时开始计时，灭菌20分钟。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 提供碳源和能源 中性偏酸 1 kg/cm2 (指定压力) (5)两者相比较，CHO表达系统有很多优点：第一，具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子；第二，具有重组基因的高效_______________ 能力，从而能获得目的基因较多的拷贝数和大量目标蛋白产物；第三，CHO细胞属于改造的成纤维细胞，很少产生自身蛋白质，利于_________ _________________________的分离和纯化。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 扩增(复制)和表达 (或人成纤维细胞生长因子) 目标蛋白 能获得目的基因较多的拷贝数和大量目标蛋白产物，说明重组基因具有高效扩增(复制)和表达能力；CHO细胞属于改造的成纤维细胞，很少产生自身蛋白质，从而能减少干扰，利于目标蛋白(或人成纤维细胞生长因子)的分离和纯化。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 返回 $