第十单元 第60课时 基因工程的基本工具和基本操作程序（课件PPT）-【步步高】2025年高考生物大一轮复习讲义（苏教版 江苏专用）

第60课时 基因工程的基本工具和基本操作程序 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 3.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。 课标要求 考情分析 1.基因工程的基本工具 2023·新课标·T6　2021·全国乙·T38　2021·湖北·T7 2.基因工程的基本操作程序 2023·全国乙·T38　2023·全国甲·T38　2023·湖北·T4　2023·广东·T20 2021·广东·T22 3.DNA片段的扩增与电泳鉴定 2023·江苏·T22　2023·山东·T25　2023·浙江6月选考·T19　2022·辽宁·T12 2022·江苏·T24　2021·山东·T25　2021·全国甲·T38 内容索引 考点一　　基因工程的基本工具 考点二　　基因工程的基本操作程序 考点三　　PCR技术扩增及电泳鉴定DNA片段 课时精练 考点一 基因工程的基本工具 1.基本工程的概念 (1)供体：提供 。 (2)操作环境： 。 (3)操作水平： 水平。 (4)原理： 。 (5)受体：表达目的基因。 (6)本质：性状在 体内的表达。 外源目的基因 体外 分子 基因重组 受体 必备知识 整合 拓展　基因工程的理论基础 必备知识 整合 2.DNA重组技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 磷酸二酯键 黏性末端 特定的脱氧核苷酸 序列 必备知识 整合 (2)DNA连接酶 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端 必备知识 整合 (3)载体 λ噬菌体的衍 生物 复制原点 必备知识 整合 (1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的(　　) 提示　基因工程是人工操作导致的基因重组，变异是定向的。 × (2)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA(　　) 提示　DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 × 必备知识 整合 判断正误 (3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　　) 提示　限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。 × (4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(　　) 提示　质粒上的抗生素抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 × 必备知识 整合 判断正误 将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图 表示常用的限制酶识别序列和切 割位点以及质粒上的限制酶切割 位点。请思考以下问题： 关键能力 提升 提示　限制酶EcoRⅠ： (1)请用图示法写出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的过程。 限制酶NheⅠ： 关键能力 提升 (2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。 提示　用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目 的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割 后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ 和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。 关键能力 提升 限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 关键能力 提升 归纳总结 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 关键能力 提升 归纳总结 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 关键能力 提升 归纳总结 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 关键能力 提升 归纳总结 考向一　辨析基因工程的基本工具 1.限制性内切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的识别序列及切割位点分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，下列相关叙述正确的是 A.两种限制酶是在同一种生物中分离出来的 B.两种限制酶切割DNA形成的黏性末端相同 C.用Hind Ⅲ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割质粒后，目 的基因和质粒能连接成重组质粒 D.实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果 1 2 √ 迁移应用 评价 限制酶命名是用生物属名的头一个字母与种名的头两个字母组成的，由此可知HindⅢ和XhoⅠ是从不同的生物中分离得到的，A错误； 两种限制酶识别和切割的序列分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，则两者切割后形成的黏性末端分别是AGCT－、TCGA－，B错误； 两种限制酶切割形成的黏性末端不同，无法连接成重组质粒，C错误。 1 2 迁移应用 评价 2.(2024·连云港高三调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是 1 2 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 迁移应用 评价 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 1 2 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 √ 迁移应用 评价 质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误； ①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。 1 2 迁移应用 评价 返回 与DNA有关的几种酶的比较 迁移应用 评价 归纳提升 考点二 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的获取 (1)化学合成法直接人工合成目的基因：一般为比较小的目的基因。 (2)基因文库获取目的基因：来源可分为 文库和 文库。 ①基因组文库：指含有某种生物体 基因片段的 的克隆群体。从基因组文库中筛选某种目的基因，一般采用 。 ②cDNA文库：从组织细胞中提取 ，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主，包含着细胞全部 克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 基因组 cDNA 全部 重组DNA 核酸探针杂交法 mRNA mRNA信息的cDNA 必备知识 整合 2.基因表达载体的构建 (1)目的：使目的基因进入 ________________________ ________________________。 (2)基因表达载体的组成及作用 受体细胞并有效表达，而且 要能稳定存在且遗传给后代 启动子 RNA聚合酶 标记基因 必备知识 整合 (3)构建过程 必备知识 整合 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停 下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 必备知识 整合 易错提醒 3.将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 哺乳动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法 显微注射法 处理法 受体细胞 __________________ ________ 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 取卵→将含有目的基因的表达载体注入→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种容易接受外来DNA的生理状态→基因表达载体导入 体细胞或受精卵 受精卵 Ca2＋ 必备知识 整合 辨析　(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 必备知识 整合 (2)农杆菌特点 ①能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 必备知识 整合 4.目的基因及其表达产物的检测鉴定 必备知识 整合 (1)目的基因一定是编码蛋白质的基因(　　) 提示　目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 × (2)基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束(　　) 提示　启动子和终止子决定着转录的开始与结束。 × 必备知识 整合 判断正误 (3)Ti质粒上的T－DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起(　　) (4)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(　　) √ 提示　为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时能以受精卵为受体，也能以体细胞为受体。 × 必备知识 整合 判断正误 (5)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(　　) 提示　检测目的基因是否导入受体细胞的方法是DNA分子杂交等技术。 × 必备知识 整合 判断正误 据图分析抗虫棉的培育过程。 提示　为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。 (1)该过程中的目的基因是 ，载体 是 。 (2)基因工程中，往往使用两种限制酶切 割目的基因，这样做的原因是什么？ Bt基因 Ti质粒 关键能力 提升 (3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？ 提示　目的基因应插入启动子与终止子之间。 关键能力 提升 (4)该实例中，导入目的基因的方法是 。为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？ 提示　由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的 农杆菌转化法 染色体DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。 关键能力 提升 (5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？ 提示　一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。 关键能力 提升 (6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？ 提示　抗原—抗体杂交、用棉叶饲喂棉铃虫。 关键能力 提升 考向二　辨析基因工程的基本操作程序 3.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落， 不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能 形成菌 3 4 √ 迁移应用 评价 若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确； 若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； 3 4 迁移应用 评价 DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 3 4 迁移应用 评价 4.(多选)(2024·江苏扬州中学高三模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述不正确的是 A.目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA B.用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞 C.Ti质粒是一种环状DNA分子，没有双螺旋结构 D.可以用DNA分子杂交技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上 3 4 √ √ √ 迁移应用 评价 在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，A错误； 农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2＋处理，B错误； Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，具有双螺旋结构，C错误。 3 4 返回 迁移应用 评价 考点三 PCR技术扩增及电泳鉴定DNA片段 1.PCR的过程 变性：94 ℃条件下受热 后解链为单链 ↓ 退火：55 ℃条件下， 与单链相应互补序列结合 ↓ 延伸：72 ℃条件下在 作用下合成子链 变性 引物 Taq酶 必备知识 整合 (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 归纳提升 必备知识 整合 2.PCR技术和DNA复制的比较 必备知识 整合 必备知识 整合 3.DNA的电泳鉴定 微量取液器 必备知识 整合 (1)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物(　　) (2)PCR技术是模拟体内DNA复制的过程，同样也需要多种酶的催化反应 (　　) 提示　PCR反应仅需一种酶。 × √ 必备知识 整合 判断正误 (3)为了节约资源，微量取液器上的枪头在实验过程中不必更换(　　) 提示　为避免外源DNA等因素的污染，在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，微量取液器上的枪头都必须更换。 × (4)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　) × 提示　PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA链高温变性、低温退火及中温延伸。 必备知识 整合 判断正误 (5)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关(　　) 提示　在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 × 必备知识 整合 判断正误 Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。回答下列问题： (1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？ 提示　引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。 关键能力 提升 (2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗？ 提示　不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。 (3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？ 提示　引物是依据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。 关键能力 提升 (4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引物的DNA分子多少个？含其中一种引物的DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？ 关键能力 提升 提示　经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子 (2n－2n)个。 关键能力 提升 (5)PCR扩增Bt基因的过程中需要解旋酶吗？并说明理由。所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？ 提示　不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。 关键能力 提升 考向三　PCR技术及电泳鉴定 5.(多选)(2023·南京高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是 A.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相 应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 B.单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组 C.第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链 D.利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程 5 6 √ √ 迁移应用 评价 单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误； 除了第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误。 5 6 迁移应用 评价 6.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定”实验的叙述，错误的是 A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 B.PCR利用了DNA的热变性原理 C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，微量取液器 上的枪头都必须更换 5 6 √ 迁移应用 评价 PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误。 5 6 迁移应用 评价 1.(选择性必修3 P87)基因工程又称为 ，指____________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 2.(选择性必修3 P87)限制酶的特异性很强，能识别____________________ ，并使_____________________________________________ 。 DNA重组技术 工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术 在体外通过人 DNA分子上特定的脱氧 核苷酸序列 每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二 酯键断开 五分钟 查落实 3.(选择性必修3 P89)E.coli DNA连接酶，可以用于连接具有 的DNA分子；T4 DNA连接酶，可以用于连接具有 的DNA分子。 4.(选择性必修3 P90)PCR反应需要在一定的 中才能进行，需提供 、 、 和热稳定的 。 5.(选择性必修3 P94)基因工程的基本操作程序包括 、 、 ，以及__________ 等步骤。 黏性末端 缓冲液 黏性末端或平末端 模板DNA 引物对 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) DNA聚合酶 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因及 其表达产物的检测鉴定 五分钟 查落实 6.(选择性必修3 P97)基因表达载体除目的基因外，还应该包括__________ 等。 7.(选择性必修3 P98)农杆菌转化法是________________________________ _______________________________________________________________________________________________。 复制原点、 启动子、终止子和标记基因 将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－ DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入受体细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达 五分钟 查落实 8.如图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点为：Hind Ⅲ(A↓AGCTT)、Pvit Ⅱ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶 的识别序列。将经过这两种酶酶切的phb2基因和 载体进行连接时，可选用 (填 “E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 返回 Pvit Ⅱ EcoRⅠ T4 DNA连接酶 五分钟 查落实 课时精练 一、单项选择题 1.(2024·淮安高三调研)基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 A.限制酶SmaⅠ和EcoR V切割形成的 末端，可以通过E.coli DNA连接酶相互连接 B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C.限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的 5′末端 D.若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶 相互连接 √ 限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割形成 的是平末端，可以通过T4 DNA连 接酶相互连接，E.coli DNA连接酶只能连接互补的黏性末端，A错误； 一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有2个磷酸二酯键断裂，形成2个游离的5′末端，C错误； 若两种限制酶的识别序列相同，但由于切割位点不同，切割形成的末端不同，不一定能通过DNA连接酶相互连接，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 2.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ 酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意； 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 3.(2024·泰州高三质检)RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是 A.设计扩增目的基因的引物时需考虑 目的基因两端的碱基序列 B.G/C含量高的引物在与模板链结合 时，退火的温度较高 C.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 D.过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、Taq酶和引物A等 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ 过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 4.(2024·镇江高三二模)转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分离剔除法和重组剔除法。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一个LoxP位点，具体原理如图。下列说法不正确的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 A.利用分离剔除法时，目的基因和标 记基因都应插到Ti质粒的T－DNA 序列内部 B.分离剔除时目的基因和标记基因插 到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上均可成功 C.上述重组载体中启动子1在农杆菌中可发挥作用，而在植物细胞中不能 发挥作用 D.经重组剔除后的标记基因，因没有启动子而无法启动基因的转录 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ Ti质粒的T－DNA可转移至受 体细胞，并且整合到受体细胞 染色体DNA上，所以利用分离 剔除法时，目的基因和标记基 因都应插到Ti质粒的T－DNA序列内部，进而成功整合到受体细胞染色体DNA上，A正确； 分离剔除时目的基因和标记基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上最终均可获得不含标记基因的转基因个体，即均可成功，B正确； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 重组剔除时，Cre酶基因应该在 植物细胞中表达，故上述重组 载体中启动子1在农杆菌中不能 发挥作用，而在植物细胞中能发 挥作用，C错误； 由图可知，经重组剔除后的标记基因没有启动子，无法启动基因的转录，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 5.(2024·苏州高三联考)如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 A.过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，导致T－DNA片段失活 B.过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化 C.过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，使其处于能吸收周 围环境中DNA分子的生理状态 D.过程③应在培养基中加入除草剂和物质K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ 过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，不会导致T－DNA片段失活，A错误； 过程①使用两种限制酶，且这两种限制酶切割产生的黏性末端不同，才可以防止酶切产物自身环化，B错误； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 过程③应在培养基中加入除草剂和物质K，除草剂是用来检测目的基因是否正确表达，物质K是用来检测目的基因有没有导入植物细胞中，加入除草剂可保留转化的愈伤组织和附着农杆菌但未转化的愈伤组织，其中变蓝的为转化的愈伤组织，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 6.(2024·扬州高三一模)我国科学家利用XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图表示相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因内部均无XbaⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ的识别位点)，下列说法不正确的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 A.一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次，共产生8个等长DNA分子 B.农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法 C.植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株 D.使用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后能得到1 500 bp左右的片段 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ 一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次共产生等长的DNA分子数24－2×4＝8(个)，A正确； 因为插入植物细胞染色体上的是质粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，导入成功的植物细胞对卡那霉素无抗性，C错误； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 根据切割目的基因的限制酶在质粒上的切割位点，可知由于重组质粒上移除1 900 bp而补充了含678 bp的目的基因，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1 500(bp)左右的新片段，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 7.(2024·常州高三三模)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 下列相关叙述错误的是 A.上述获得蓝色玫瑰的方案中不需要转入能 调控液泡pH的基因 B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是 PmeⅠ和BamHⅠ C.同时使用SpeⅠ和SacⅠ能提高idgS基因和Ti质粒的重组效率 D.sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的 13 √ 靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中不需要转入能调控液泡pH的基因，A正确； 将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，则会将终止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 二、多项选择题 8.(2024·淮安高三质检)限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列说法正确的是 A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C.只有用相同限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组 质粒 D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不能剪切自身的DNA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ √ DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误； 用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，也可能形成相同的黏性末端，进而形成重组质粒，C错误； 限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 9.(2024·南京高三联考)某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如图所示。下列有关叙述正确的是 A.也可用PCR技术直接扩增RNA来获取目的基因 B.酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键 C.本过程中，可以采用一种、两种甚至四种酶2 D.通过PCR技术可检测fps基因是否表达出蛋白质 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ √ PCR技术不能直接扩增RNA来获取目的基因，A错误； 据图可知，酶1表示逆转录酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA连接酶，酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键，B正确； 不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，因此为了成功构建表达载体，可以采用一种、两种甚至四种酶2切割含fps基因的DNA片段和质粒a，C正确； 进行抗原—抗体杂交可检测fps基因是否表达出蛋白质，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 10.(2024·徐州高三质检)图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是 A.若通过PCR技术提取该目的基因， 应该选用引物a和引物c B.构建表达载体时应选用BamHⅠ和 Hind Ⅲ这两种限制酶 C.若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌 D.只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体 细胞 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 √ √ 由于选择BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌，D错误。 根据图甲可知，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，所以不宜选用BamHⅠ，为防止目的基因自身环化，可选用BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，B错误； 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 三、非选择题 11.(2021·全国乙，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，上图中_________ ________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接，上图中________ ______________________切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 EcoRⅠ、 PstⅠ EcoRⅠ、 PstⅠ、SmaⅠ和EcoR Ⅴ 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。 磷酸二酯键 DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中_________；质粒DNA分子上有_______________________，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_________________________________________________ ___________________________。 自我复制 一至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即 为含有质粒载体的宿主细胞 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因便于重组DNA分子的筛选，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (4)表达载体含有启动子，启动子是指_______________________________ _____________________________________________________________。 位于基因上游的一段有特殊序列结 构的DNA片段，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程 启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 13 12.(2024·南通高三调研)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列问题： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 注：XhoⅠ、Kpn Ⅰ、PstⅠ为不同限制酶的识别位点；LacZ基因编码产生的β－半乳糖苷酶可以催化无色物质X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；AmpR基因为氨苄青霉素抗性基因。 (1)获取目的基因：提取枣树细胞的__________，经逆转录获得cDNA。为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT基因时应选择的引物组合是_______________，并在其___(填“5′”或“3′ ”)端分别添加限制酶______________的识别序列。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 mRNA 引物Ⅱ和引物Ⅲ KpnⅠ和XhoⅠ 　5′ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PCR过程中，引物与模板链的3′端结合，因此应当选择引物Ⅱ和引物Ⅲ，这样才能使热稳定的DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。由题干可知，B链为模板链，转录是沿着模板链的3′→5′方向进行的，应将MT基因的左端与启动子一侧连接，由于目的基因中含有PstⅠ的识别序列，不宜选用PstⅠ，同时为了保证MT基因正向连接到质粒上，应当在MT基因两侧添加不同的限制酶识别序列，故在引物Ⅱ和引物Ⅲ末端添加的限制酶序列分别是KpnⅠ和XhoⅠ限制酶识别序列。引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，故限制酶的识别序列应加在引物的5′端。 13 (2)构建重组DNA分子：启动子是______________识别并结合的部位。基因工程中构建用于原核生物的表达载体时，常用的启动子不包括以下哪一项？______。 A.噬菌体基因启动子 B.乳酸菌基因启动子 C.大肠杆菌基因启动子 D.枣树MT基因启动子 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 RNA聚合酶 D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。乳酸菌和大肠杆菌都是原核生物，它们的启动子可以用于构建原核生物的表达载体；噬菌体是寄生于细菌中的病毒，噬菌体基因启动子可用于构建原核生物表达载体；枣树MT基因启动子不适合用于构建原核生物表达载体。 13 (3)导入、筛选和鉴定MT工程菌。 ①将得到的混合物导入到用______处理的大肠杆菌完成______实验。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ca2＋ 转化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 大肠杆菌是原核生物，需要Ca2＋处理，使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态，完成将基因表达载体导入受体细胞并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，即转化。 13 ②将菌液稀释并涂布在含X－gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后，随机挑取______的单菌落可获得MT工程菌。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 白色 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 在含有氨苄青霉素的培养基上，导入了空白质粒和重组质粒的大肠杆菌都可以形成菌落，但导入重组质粒的大肠杆菌LacZ基因被破坏，不能催化无色物质X－gal产生蓝色物质，是白色菌落，故应挑取白色单菌落进行培养。 13 ③欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与______________分别接种至含______________的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 普通大肠杆菌 (一定浓度的)镉 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 操作获得的是对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌，因此欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与普通大肠杆菌分别接种到含有(一定浓度的)镉的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13.(2024·苏锡常镇四市高三一模)科研人员通过转基因技术培育出超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，含P基因的DNA片段以及Ti质粒的酶切位点如图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题： 13 限制酶 识别序列 ClaⅠ 5′AT↓CGAT3′ BamHⅠ 5′G↓GATCC3′ Hind Ⅲ 5′A↓AGCTT3′ EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′ KpnⅠ 5′GGTAC↓C3′ SacⅠ 5′GAGCT↓C3′ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (1)以RNA为模板，通过RT—PCR技术可获取P基因。进行RT—PCR时，一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脱氧核苷酸，其原因是______________________________ _____________________________________________，同时需加入的酶有_____________ __________________。为了特异性扩增P基因序列，需根据___ _____ 设计特异性引物。 dNTP 能为子链延伸过程提供能量和原料(或脱氧核苷酸只能作为原料而不能提供能量) 逆转录酶和热 稳定的DNA聚合酶 P基因两端的碱基序列 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (2)在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是__________和__________，这样操作不仅使P基因在玉米植株中超量表达，还可利用T－DNA的_______特性，最终使P基因____________________________。 BamHⅠ SacⅠ 可转移 整合到玉米细胞染色体DNA上 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 在构建基因表达载体时，要想使P基因在玉米植株中超量表达，切割目的基因时需要把强启动子和P基因连在一起切割下来，因此需要用到BamHⅠ切割，另一种酶可以用KpnⅠ或者SacⅠ，在质粒中，KpnⅠ识别序列在BamHⅠ识别序列的左侧，终止子在右侧，如果用KpnⅠ切割，目的基 因和质粒连接后，目的基因不在启动子和终止子之间，将来无法转录，因此在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是BamHⅠ和SacⅠ。 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (3)将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入__________，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。 潮霉素 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 据图可知，利用Ti质粒的T－DNA可将目的基因(P基因)转移到玉米细胞的染色体DNA上，T－DNA中含有标记基因潮霉素抗性基因，因此培养基中需加入潮霉素以便筛选转基因愈伤组织。 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (4)对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有__________________ __________________________________________________________________________________________。 基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 基因能控制蛋白质的合成，该过程包括转录和翻译。有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有：基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达等。 返回 13 $