第十单元 专题突破10 综合PCR的基因工程问题（教师用书word）-【步步高】2025年高考生物大一轮复习讲义（人教版 鲁湘）

专题突破10　综合PCR的基因工程问题 课标要求 阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不同的PCR技术有着不同的应用。 考情分析 几种不同PCR的应用 2023·江苏·T22　2023·山东·T25　2022·江苏·T24　2022·山东·T25 2021·全国甲·T38　2021·山东·T25　2020·北京·T12　2020·江苏·T33 类型一　利用PCR技术获取目的基因 基本模型 获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。 典例突破 1．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(　　) A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个 B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个 C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因 D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子 答案　C 解析　据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各一个，A正确；第二轮复制得到22＝4(个)DNA分子，即①复制得①和③、②复制得②和④，即得到①②③④各一个，B正确；第四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)，C错误；经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各一个，③④各四个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D正确。 类型二　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 基本模型 检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 典例突破 2．(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是____________________。 答案　乙、丙　目的基因反向连接 解析　分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。 类型三　利用PCR技术引导基因定点突变 基本模型 重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。 典例突破 3．水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。 注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。 (1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________来完成。 (2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链DNA)。 (3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为___________________________________ ______________________________________________________________________________。 (4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是_________________________________________________。 答案　(1)改造基因(或基因定点突变)　(2)T－A或C－G　A或G　(3)3　引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用 (4)M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段 解析　(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A或C－G，对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖氨酸。(3)若两个反应系统均进行一次复制， 则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，设计引物时需要注意的是，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。 类型四　利用PCR技术扩增未知基因序列 基本模型 利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。 典例突破 4．(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)： 请据图回答问题： (1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种________________酶，它通过识别特定的________________切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化 ________________________________________________________________________。 (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′ 答案　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列 (2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④ 解析　(3)PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合，向右侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合，向左侧方向延伸形成子链，该引物是②。 类型五　利用PCR技术快速检测病原体 基本模型 病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。 典例突破 5．猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。 (1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。 (2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。 ①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则而特异性结合。 ②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈__________(填“正相关”或“反相关”)关系。 (3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。 ①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有_______________ _______________________________________________________________________________。 ②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就____________。 ③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。 (4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有____________。 a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值 b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 c．病毒发生变异 答案　(1)逆转录　(2)①碱基互补配对　②正相关　(3)①Taq DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降　②越小　③阳性　(4)abc 解析　(1)由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。(2)①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过碱基互补配对形成氢键而特异性结合。②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。根据题干信息“荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步”可知，检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈正相关关系。(3)①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，有可能是底物浓度降低导致的，也有可能是酶的活性缓慢下降导致的。②样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越少，Ct值就越小。③Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2中荧光阈值大概是36，猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有取样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光PCR检测阈值；样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，从而导致样本中病毒量少；病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性。 课时精练 一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。 1．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(　　) A．用PCR方法扩增目的基因时不需知道基因的全部序列 B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连 C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物 D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16 答案　D 解析　复性的目的是使引物与模板DNA结合，故复性温度过高可能导致引物与模板DNA不能结合，因而使得PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；第四轮循环共形成16个DNA分子，产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。 2.PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是(　　) A．PCR第5个循环，消耗了16对引物 B．脱氧核苷酸作为扩增的原料，会依次连接到引物的5′端 C．PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2＋等 D．用图中引物扩增至少4个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的产物 答案　A 解析　进行PCR时，扩增是从引物的3′端延伸，因此脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到引物的3′端，B错误；PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液(含Mg2＋)等物质，不需要加Ca2＋，C错误；用图中引物扩增至少3个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的产物，D错误。 3．(2024·威海高三模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是(　　) A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率 B．过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物 C．过程②的产物都可以完成延伸过程 D．若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通用引物RP2 答案　D 解析　两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错误；若过程④得到16个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15(个)，D正确。 4．反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述不正确的是(　　) A．过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割 B．过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键 C．过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶和解旋酶 D．该技术可检测T－DNA整合到植物染色体DNA的位置 答案　C 解析　过程③即PCR扩增，PCR技术中DNA解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C错误。 5．(2024·泰州高三联考)IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，如图所示。下列说法错误的是(　　) A．PCR1中使用的引物有引物A、引物C B．PCR2中使用的引物有引物B、大引物b链 C．PCR1过程需要扩增3轮才能获得目标产物 D．PCR2过程中，为减少错误DNA片段的产生可适当升高复性温度 答案　C 解析　在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，在基因的左侧需要用限制酶Hind Ⅲ来切割，在基因的右侧用限制酶Sac Ⅰ切割，因此在PCR1中结合到基因右端的引物选择引物C，从题图中看，另一个引物应含有突变碱基C，所以选择引物A，A正确；在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，应含有限制酶Hind Ⅲ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′端到3′端的序列中开始部位应含有Sac Ⅰ识别的序列，从图中看，它是大引物的b链，B正确；PCR1过程主要是为了获得大引物，则扩增2轮即可获得目标产物，C错误；由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目的基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高温度，便于引物与模板链的结合，D正确。 6.(2024·苏州高三调研)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是(　　) A．PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段 B．耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键 C．最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关 D．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高 答案　D 解析　Ct值越小，说明所需循环的次数越少，被检测样本中病毒数目越多，D错误。 二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。 7．(2024·衡阳高三质检)研究人员用图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点)，将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。下列叙述正确的是(　　) A．构建重组质粒的过程应选用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶 B．使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组 C．能在添加四环素的培养基上生存一定是含有重组质粒的大肠杆菌 D．利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙 答案　BD 解析　用限制酶BamH Ⅰ切割会使质粒中的两种标记基因都被破坏，宜选Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，A错误；能在添加四环素的培养基上生存的也可能是含有普通质粒的大肠杆菌，C错误。 8．(2024·南通高三调研)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T－DNA插入的具体位置。下列有关说法正确的是(　　) A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物，T－DNA存在于其Ti质粒上 B．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 C．若扩增循环n次，需要2n＋1－2个引物 D．将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置 答案　CD 解析　农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力，A错误；耐高温的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子链，因此利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，B错误；扩增循环n次，得到2n个DNA分子，总单链数为2×2n即2n＋1条，只有最初的2条母链不需要引物，因此共需要2n＋1－2个引物，C正确；不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置，D正确。 9．实时荧光定量RT－PCR技术需要在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，荧光染料能特异性掺入DNA双链中，从而发出荧光信号。在流感流行季节，对怀疑流感病毒感染的患者，可以通过实时荧光定量RT－PCR技术进行核酸检测。下列相关叙述不正确的是(　　) A．图中的探针可能是利用荧光分子标记的流感病毒独特的基因序列 B．核酸检测是通过检测荧光信号来确定样本中是否有病毒核酸的 C．PCR技术利用了DNA双链复制的原理，需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶的催化 D．用荧光RT－PCR技术测定病毒的核酸具有特异性 答案　C 解析　PCR技术利用了DNA双链复制的原理，不需要解旋酶，可通过高温使DNA双链解开，但需要耐高温的DNA聚合酶的催化，C错误。 三、非选择题 10．(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______________，扩增程序中最主要的不同是________________。 (2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有___________________。 (3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 (5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)模板、引物　引物的设计　(2)限制酶、(T4)DNA连接酶　(3)ABC　(4)P3、P4　 (5)电泳只能检测DNA分子的大小(长度)，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 解析　(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最主要因素。(2)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒，使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)。(3)用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误；培养基冷却后才接种，故抗性平板上未长出菌落不是因为培养基温度太高，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法接种后在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。(4)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720＋390＝1 100(bp)，用引物F1－F和F2－R进行PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(5)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 11．基因工程在农业方面的应用发展迅速，我国转基因作物的种植面积在世界有较高排名。请回答下列相关问题： (1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的______________________的基因中进行筛选。 (2)目的基因可以人工合成、从基因文库中获取，还可以利用PCR技术获取和扩增。如图1展示了PCR技术获取和扩增目的基因的原理，请分析回答下列问题： ①PCR技术利用了DNA半保留复制原理和______________原理。PCR的一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，复性的作用是____________________________。 ②将一个DNA分子进行扩增，理论上目的基因最早在第______次循环后获得；第5次循环后，可扩增得到______个目的基因。 (3)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如图所示。图中链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。请回答相关问题： ①EcoR Ⅰ酶切后得到的—AATT称为黏性末端，“黏性”的含义是_____________________，EcoR Ⅰ切割得到黏性末端的原因是________________________________________________。 ②不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是______________________。 ③图4中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是______(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物______(填“含有”或“不含”)EcoR Ⅰ的酶切位点。 答案　(1)已知结构和功能清晰　(2)①碱基互补配对　使引物通过碱基互补配对与两条单链结合　②3　22　(3)①两个末端互补的碱基之间可以自发形成氢键　切割位点在识别序列中心轴线两侧　②DNA两端序列未知，无法设计引物　③逆时针　含有 12．乙烯受体是乙烯感受和转导信号的初始元件，广泛存在于各种植物中，并决定植物各种组织对乙烯反应的敏感性。通过对多种植物研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体Ers1基因，通过基因工程将Ers1基因反向连接在启动子后，筛选转入反义Ers1基因的草莓，达到延长储藏期的效果。回答下列问题： (1)草莓DNA的提取：取草莓植株叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉碎后，加入400 μL SDS DNA提取液继续研磨，提取液中含有__________________可防止DNA被水解。待充分研磨后收集至离心管中，离心后取①于另一干净离心管中，加入200 μL异丙醇，离心10 min之后弃去管中的②，加入80 μL体积分数为70%的乙醇，离心5 min之后取③保存。过程中的①②③分别是______________________(填“上清液”或“沉淀”)。 (2)通过上述方法获得DNA后，需要通过PCR技术进行扩增Ers1基因(如图1)。为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增Ers1基因时需添加限制酶XhoⅠ的识别序列(5′－CTCGAG－3′)。已知Ers1基因左端①处的碱基序列为－TTCCAATTTTAA－，则其中一种引物设计的序列是5′__________________________3′。在PCR体系中，加入的dNTP可提供______________。PCR产物通过电泳进行分离后，可割下________________回收扩增的Ers1基因。 (3)经XhoⅠ酶切后的载体和Ers1基因进行连接(如图)，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、Ers1基因与载体正向连接、Ers1基因与载体反向连接。为鉴定这3种连接方式，选择Hpa Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，请在图2中画出电泳结果，需标明电泳片段DNA大致长度。 (4)用________处理农杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，将筛选得到的反向连接质粒与处理后农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌，完成________实验。将农杆菌涂布接种于添加有卡那霉素的LB固体培养基上，目的是_____________________ _______________________________________________________________________________。 (5)用阳性农杆菌感染植物细胞，目的基因就会随____________整合到植物染色体DNA中，最后通过______________技术培育出完整的转基因植株。为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、______________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻，其原因是________________________ ______________________________________________________________________________。 答案　(1)DNA酶抑制剂　上清液、上清液、沉淀　(2)CTCGAGTTCCAATTTTAA　原料和能量　凝胶　(3)如图 (4)Ca2＋(或CaCl2)　转化　筛选含有重组质粒的农杆菌　(5)T－DNA　植物组织培养　再生能力强　反义Ers1基因的转录产物与Ers1基因的转录产物碱基互补配对结合，使翻译过程受阻 解析　(1)为防止DNA被水解，提取液中应加入DNA酶抑制剂。DNA在2 mol/L的氯化钠溶液中溶解度高，不溶于乙醇和异丙醇，待充分研磨后收集至离心管中，离心后沉淀为残渣，DNA溶解于提取液中，故取上清液(①)于另一干净离心管中，加入200 μL异丙醇，离心10 min之后弃去管中的上清液(②)，加入80 μL体积分数为70%的乙醇，离心5 min之后取沉淀(③)保存。(2)图中磷酸基团连接处为5′端，“－OH”连接处为3′端，由题意可知，Ers1基因左端①处的碱基序列为5′－TTCCAATTTTAA－3′，在设计PCR引物扩增Ers1基因时需添加限制酶Xho Ⅰ的识别序列(5′－CTCGAG－3′)，故其中一种引物设计的序列是5′－CTCGAGTTCCAATTTTAA－3′。在PCR体系中，加入的dNTP可提供原料和能量。PCR产物通过电泳进行分离后，可割下凝胶回收扩增的Ers1基因。(3)经Xho Ⅰ酶切的载体和Ers1基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连6 000 bp、Ers1基因与载体正向连接6 700 bp、Ers1基因与载体反向连接6 700 bp。根据图中酶切位点可知，单个载体自连经酶切后长度为6 000 bp；Ersl基因与载体正向连接后经酶切的长度为800 bp、 5 900 bp；Ers1基因与载体反向连接后经酶切的长度为300 bp、6 400 bp。电泳结果见答案。 (4)用Ca2＋(或CaCl2溶液)处理农杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，将目的基因导入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。将农杆菌涂布接种于添加有卡那霉素的LB固体培养基上，是利用了重组质粒上的卡那霉素抗性基因作为标记基因，从而可以筛选出含有重组质粒的农杆菌。(5)目的基因会随T－DNA整合到植物染色体DNA中，最后通过植物组织培养技术培育出完整的转基因植株。为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、再生能力强及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。由题意可知，通过基因工程将Ers1基因反向连接在启动子后，反义Ers1基因的转录产物与Ers1基因的转录产物碱基互补配对结合，使Ers1基因的翻译过程受阻，达到延长储藏期的效果。 谢谢 学科网（北京）股份有限公司 $