专题9 专题强化训练38 PCR及其应用-【备考最优解】2026版高考二轮专题复习·生物学（教用课件）

专题强化训练38　PCR及其应用 1 1．(2025·江苏苏锡高三一模)血浆外泌体是由活细胞分泌到血液中的囊泡。研究发现，阿尔茨海默病(AD)患者血浆外泌体上蛋白质Aβ1-42含量显著升高，为快速诊断AD，科研人员开发了免疫磁珠外泌体聚合酶链式反应(iMEP)技术。回答下列问题： 4 5 6 1 2 3 专题强化训练 (1)外泌体可参与细胞间的通讯，其上蛋白质的成熟常发生在________________(填细胞器)。图1为外泌体与抗体—磁珠偶联物及DNA—抗体偶联物的结合示意图，外泌体与DNA—抗体偶联物特异性结合的原理是___________________________。选择CD63蛋白制备抗体—磁珠偶联物的原因是____________________________________________________。 高尔基体 抗原、抗体的特异性结合 外泌体上存在CD63蛋白，能与抗CD63抗体特异性结合 4 5 6 1 2 3 专题强化训练 解析：由“血浆外泌体是由活细胞分泌到血液中的囊泡”可知，外泌体上蛋白质的成熟常发生在高尔基体中。图1为外泌体与抗体—磁珠偶联物及DNA—抗体偶联物的结合示意图，由图1可知，外泌体与DNA—抗体偶联物特异性结合依赖于外泌体上的Aβ1-42与DNA—抗体偶联物上的抗Aβ1-42抗体的特异性结合。由于外泌体上存在CD63蛋白，CD63蛋白可与抗CD63抗体特异性结合，故选择CD63蛋白制备抗体—磁珠偶联物。 4 5 6 1 2 3 专题强化训练 (2)图2为实时荧光定量PCR的过程示意图，除所示组分外，实时荧光定量PCR的反应体系中还需加入______________________。设计Taq Man探针序列的依据是模板DNA的中部序列，不选择两端序列的原因是________________________________。若PCR循环中过程①温度设置过高，会导致相同循环次数下总荧光强度_______________。 dNTP、缓冲液和Mg2+ 避免影响引物和模板链的结合 降低 4 5 6 1 2 3 专题强化训练 解析：图2为实时荧光定量PCR的过程示意图，图中显示已经加入引物、Taq Man探针和Taq DNA聚合酶，除此之外，还需加入dNTP(原料)、缓冲液和Mg2+。由于引物要结合在模板链的两端，故设计Taq Man探针序列的依据是模板DNA的中部序列，以避免影响引物和模板链的结合。图2中过程①为复性，若①温度设置过高，会导致引物和探针不能与待测目标有效结合，故相同循环次数下总荧光强度会降低。 4 5 6 1 2 3 专题强化训练 (3)图3为PCR循环次数与实时荧光定量PCR反应体系中荧光强度的关系图，其中Ct值为达到阈荧光强度时的循环次数。PCR的循环达到一定次数后，再进行PCR，总荧光强度基本不增加，出现平台期，原因是受____________________________________________(至少答2点)等的限制。若利用iMEP技术检测时，甲和乙两位待测者达到Ct值的循环次数分别为10和30，其中______更可能为AD患者，甲、乙体内血浆外泌体中Aβ1-42含量比约为___________。利用iMEP技术可快速诊断AD的机制是__________________________________________________________________________________________________________________________________。 探针数、引物数、dNTP数及Taq DNA聚合酶活性　 甲 220∶1 利用DNA—抗体偶联物可将蛋白质信号转变为核酸信号，并通过实时荧光定量PCR实现定量检测 4 5 6 1 2 3 专题强化训练 解析：由于探针数、引物数和dNTP的数目有限，以及Taq DNA聚合酶活性的影响，PCR的循环达到一定次数后，再进行PCR，总荧光强度基本不增加，会出现平台期。荧光信号强度达到设定的阈值时所经历的循环数越少，说明待测样本中含有的Aβ1-42的密度越大，故甲更可能为AD患者。由于甲循环10次就可达到乙循环30次的荧光强度，故甲、乙体内的Aβ1-42含量比约为230∶210＝220∶1。结合图2和图3可知，利用DNA—抗体偶联物可将蛋白质信号转变为核酸信号，并通过实时荧光定量PCR实现定量检测，故利用iMEP技术可快速诊断AD。 4 5 6 1 2 3 专题强化训练 2．(2025·辽宁高三开学考)牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的传染病，是全球最重要的牛传染病之一。BVDV中结构蛋白E0和E2是主要抗原，据此研究者利用基因工程技术研制有关疫苗防控该病。图1表示由E2和E0基因经处理后拼接而成的融合基因，图2表示人工改造的基因表达载体pcDNA3.1质粒的结构，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，回答以下问题： EcoRⅠ XhoⅠ MboⅠ 　　↓ 5′－GAATTC－3′ 　 　↓ 5′－CTCGAG－3′ 　　 　↓ 5′－GATC－3′ HindⅢ NotⅠ   　　↓ 5′－AAGCTT－3′ 　　↓ 5′－GCGGCCGC－3′   4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (1)BVDV是一种单链RNA病毒，在构建融合基因前，需先提取病毒RNA再通过______________和PCR获取并扩增E0和E2基因。PCR扩增融合基因的每次循环一般可以分为____________________三个步骤。 解析：BVDV的遗传物质为RNA，需要先逆转录为DNA后再进行PCR扩增。PCR的每次循环一般可以分为变性、复性、延伸这三个步骤。 逆转录 变性、复性、延伸 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (2)为保证疫苗防护效果，研究人员将E2基因和E0基因拼接以期表达出E2—E0融合蛋白，此融合基因转录的模板链是________(填“A链”“B链”或“A链或B链”)。已知E2基因A链的起始序列为5′－CACTTGGA－3′，在保证融合基因准确扩增的同时使目的基因与pcDNA3.1质粒正确拼接，F1引物的序列应为_____________________________________。 B链 5′－AAGCTTCACTTGGA－3′ 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 解析：由图1可知，融合基因的转录方向为从左到右，在转录时RNA聚合酶沿模板链的3′→5′方向移动，磷酸端为5′端，由此判定B链为融合基因转录的模板链。根据融合基因及质粒上的酶切位点可知，限制酶EcoRⅠ会破坏目的基因，限制酶MboⅠ在质粒中有两个酶切位点，会切去质粒的终止子，因而不可选用。为保证目的基因与pcDNA3.1质粒正确拼接，应选用限制酶HindⅢ和XhoⅠ同时切割质粒和目的基因。由于目的基因上游没有HindⅢ识别序列，应在引物F1的5′端增加序列5′－AAGCTT－3′。引物F1序列与B链3′端互补，即与A链5′端序列相同，因此引物F1的完整序列是5′－AAGCTTCACTTGGA－3′。 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (3)在构建E2—E0融合基因之前，E2基因大小约1 358 bp，E0基因大小约516 bp，但融合基因片段大小仅1 777 bp，这是为了保证两个基因表达为一条肽链，在拼接基因时必须除去________。 A．E2基因中编码起始密码子的序列 B．E2基因中编码终止密码子的序列 C．E0基因中编码起始密码子的序列 D．E0基因中编码终止密码子的序列 解析：为保证两个融合基因表达为一条肽链，必须除去E2基因中编码终止密码子的序列，否则会合成两条肽链，即B符合题意。 B 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (4)为保证融合基因表达产物具有正确结构，可制备牛乳腺生物反应发生器，使牛在分泌乳汁的同时生产融合蛋白，为此常将重组质粒通过________________法导入牛的受精卵中。启动子存在物种特异性和组织特异性，易被本物种特定组织转录系统识别并启动转录，为使融合基因只在牛乳腺细胞中表达且便于重组DNA分子的筛选，应将pcDNA3.1质粒中的_______________________更换为___________________________________。 显微注射 启动子1和启动子2 牛乳腺中特异表达的基因的启动子 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 解析：将目的基因导入动物受精卵最常用的方法是显微注射法。由题意可知，启动子存在物种特异性和组织特异性，为使融合基因只在牛乳腺细胞中表达且便于重组DNA分子的筛选，启动子1和启动子2均应更换为牛乳腺中特异表达的基因的启动子。 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 3．(2025·广东顺德高三质检)抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如下图所示。回答下列问题： 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基序列中第________位的碱基替换，碱基具体变化为_____________。基因模板链对应的碱基改变为_____________。 解析：脯氨酸密码子为CCA，苏氨酸密码子为ACA，若想将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，可将mRNA上第154位的碱基替换，碱基具体变化为C变为A。模板链与mRNA上的碱基互补配对，则基因模板链对应的碱基改变为G变为T。 154 C变为A G变为T 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (2)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低则会导致反应效率降低，原因是_____________________________________________________ ____________________________________。 解析：变性的目的是使双链DNA解聚为单链，变性时温度偏低会导致DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少，使反应效率降低。 温度偏低时DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (3)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计 “诱变引物”应选择________。 A．5′…CCTGTTAT…3′ B．5′…CCTGGTAT…3′ C．5′…ATACCAGG…3′ D．5′…ATAACAGG…3′ 解析：由题图可知，诱变引物与转录时的非模板链碱基互补配对，则诱变引物序列与模板链相同，且需将模板链上第154位碱基G变为T，则诱变引物序列为5′…CCTGTTAT…3′，故选A。 A 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (4)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因需要进行两次PCR(PCR1和PCR2)，产物1最早出现在PCR1的第________轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有______________________；通过PCR3快速扩增时应选用的引物是__________________。 解析：结合引物的位置和PCR的循环过程可知，产物1最早出现在PCR1的第3轮循环；DNA的复制方式为半保留复制，因此PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有诱变前的抗菌肽基因。由题图可知，通过PCR3扩增时应选用的引物是引物1和引物2。 3 诱变前的抗菌肽基因 引物1和引物2 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (5)In-Fusion酶能够识别任何具有15 bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。科研人员将载体(320 bp)两端连接上与改良的抗菌肽基因(180 bp)两端相同的序列(15 bp)并利用In-Fusion酶实现两者的连接，如下图所示。最终获得的重组DNA分子长度为________。与传统方法相比，这种技术的优点是_____________________________________________________________________________________________________________(至少写两点)。 500 插入位点不受限制酶识别序列限制；能够实现目的基因在载体任意位点上的插入；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 解析：已知In-Fusion酶能够识别任何具有15 bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。因此最终获得的重组DNA分子长度为载体长度(320 bp)＋改良的抗菌肽基因长度(180 bp)＝500 bp。与传统方法相比，这种技术的优点是插入位点不受限制酶识别序列限制，能够实现目的基因在载体任意位点上的插入，避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等。 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 4．(2025·河北衡水中学高三质检)科学研究表明t-PA蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性不高，若将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸(密码子是UCU)，可获得改良的t-PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1和图2为改造t-PA蛋白基因及构建表达载体的过程。回答下列问题： 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (1)在PCR中高温变性的目的是____________________________，图1中重叠延伸时__________(填“需要”或“不需要”)引物。 解析：在PCR中高温变性的目的是使双链DNA解聚为单链；PCR开始时需要引物引导DNA聚合酶结合，图1中重叠延伸时不再需要引物。 使双链DNA解聚为单链 不需要 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (2)t-PA蛋白第84位的半胱氨酸对应的基因模板链碱基序列是ACA，图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是________。 解析：已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链上的碱基序列是ACA，而丝氨酸的密码子是UCU，则相应的基因模板链上的碱基序列为AGA，由此可知，若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则模板链相应位点发生的碱基替换为C→G，图1中显示引物b与t-PA蛋白基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链(模板链)相同，即该位点的碱基是G。 G 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (3)若图1得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5′—TGAACGCTA…(中间序列)…GTCGACTCG—3′。为了便于将扩增后的基因和质粒pCLY11成功构建成重组质粒，请写出用于PCR扩增的一对引物的碱基序列：_____________________________________________(至少写出10个碱基，并标注5′端)，PCR的产物一般通过______________________来鉴定。 5′－CCCGGGTGAA…，5′－GCTAGCCGAG… 琼脂糖凝胶电泳 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 解析：由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸，引物需要与模板的3′端结合，据图1可知，为扩增完整的序列，需要引物a和引物d；结合题图2可知，应用XmaⅠ和NheⅠ两种限制酶切割，以便于把目的基因连接到质粒pCLY11上。图1得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5′—TGAACGCTA…(中间序列)…GTCGACTCG—3′，结合碱基互补原则可知，用于PCR扩增的一对引物的碱基序列为5′—CCCGGGTGAA…，5′—GCTAGCCGAG…； PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (4)运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图3。   过程②运用的具体方法为___________；④过程前需取__________________细胞进行性别鉴定。若改用膀胱生物反应器在尿液中获得t-PA改良蛋白，在构建基因表达载体时，需要添加_______________________________的启动子。 显微注射 (囊胚期的)滋养层 仅在膀胱细胞中特异性表达的基因 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 解析：过程②是将目的基因导入受精卵中，常用显微注射法，一般取囊胚期的滋养层细胞进行性别鉴定；若改用膀胱生物反应器在尿液中获得t-PA改良蛋白，在构建基因表达载体时，需要添加仅在膀胱细胞中特异性表达的基因的启动子。 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 5．(2025·辽宁名校联盟高三一模)科研团队通过转基因获得的大肠杆菌工程菌，成为监测残留在生物组织或环境中四环素水平的“报警器”，其监测原理如图1所示。天然大肠杆菌不具备图1中所示基因和四环素抗性基因。有关限制酶的识别序列及切割位点如图2所示。回答下列问题： 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (1)根据图1、图2的信息，至少需要使用______种酶才能将DNA片段1、DNA片段2正确拼接成一段完整的DNA分子，其中在拼接位点处的碱基序列为________(填写编号)。 编号 ① ② 拼接位点 处的碱基序列 5′—TCTAGA—3′ 3′—AGATCT—5′ 5′—TCTAGT—3′ 3′—AGATCA—5′ 编号 ③ ④ 拼接位点 处的碱基序列 5′—ACTAGA—3′ 3′—TGATCT—5′ 5′—ACTAGT—3′ 3′—TGATCA—5′ 3 ②或③ 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 解析：为保证两DNA片段能正确连接，选择的两种限制酶切割后应能形成相同的黏性末端，据图可知，可选择XbaⅠ和SpeⅠ，此后还要用DNA连接酶进行连接，故至少需要3种酶才能将DNA片段1、DNA片段2正确拼接成一段完整的DNA。两种限制酶切割形成的黏性末端序列都是CTAG，故在拼接位点处的碱基序列为5′—TCTAGT—3′或5′—ACTAGA—3′。 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (2)图3是构建基因表达载体时所选用的质粒，请在图4中绘制出构建成功的重组质粒示意图，并标明基因。图4的重组质粒分别表达TetR蛋白、GFP蛋白时，所使用的模板链位于____________(填“同一条”或“不同”)DNA单链，判断依据是____________________________________________。 答案： 不同　 重组质粒中TetR基因和GFP基因转录方向不同 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (3)筛选充当“报警器”的大肠杆菌工程菌时，应将大肠杆菌培养在含有适宜浓度的四环素培养基上，当菌落出现__________________现象时，表明重组质粒成功导入大肠杆菌。能在该培养基上形成菌落的大肠杆菌________(填“一定”或“不一定”)含有重组质粒。 发绿色荧光 不一定 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 解析：分析题图，重组质粒中含有GFP基因和四环素抗性基因，筛选充当“报警器”的大肠杆菌工程菌时，应将大肠杆菌培养在含有适宜浓度的四环素培养基上，当菌落出现发绿色荧光现象时，表明重组质粒成功导入大肠杆菌；由于含四环素抗性基因的未重组质粒也可导入大肠杆菌，使其在培养基上形成菌落，故能在该培养基上形成菌落的大肠杆菌不一定含有重组质粒。 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (4)为提高对环境中四环素水平监测的有效性，研究人员将GFP蛋白的第65位丝氨酸突变成苏氨酸后，增加了绿色荧光稳定性和强度。该项技术属于____________(填“基因工程”或“蛋白质工程”)。 解析：该项技术最终改变的是GFP蛋白的结构，属于蛋白质工程。 蛋白质工程 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 6．(2025·湖南高三二模)重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通过定点诱变在体外改造DNA分子(图中黑色正方形代表替换的碱基)，并将改造后的目的基因导入质粒构建目的基因表达载体。回答下列问题： 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (1)上图所示的重叠延伸PCR技术中，PCR1的引物是________________。PCR4可获得大量定点诱变目的基因，此时的引物为________________。PCR3时模板DNA不能选择DNA分子③的原因是_____________________________________________________________。 引物A、引物C 引物C、引物D 子链的延伸方向是5′端→3′端，以DNA分子③作模板时子链不能延伸 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 解析：由于DNA合成的方向是从子链的5′端到3′端，根据PCR1的产物，可知PCR1的引物是引物A、引物C，根据PCR2的产物，可知PCR2的引物为引物B、引物D，将DNA分子②④混合后复性可得到DNA分子③⑤，分析题图中引物的结合位点可知，PCR4的引物为引物C、引物D；PCR3为了获得重叠链，模板DNA不能选择DNA分子③的原因是子链的延伸方向是5′端→3′端，以DNA分子③作模板时子链不能延伸。 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 (2)为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)能与载体正确连接，PCR4时，最好分别在基因转录的非模板链和模板链的________(填“5′”或“3′”)端和________(填“5′”或“3′”)端的引物上添加限制酶________和________酶切位点。 解析：为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶，均对应DNA两条链的3′端。目的基因应插入启动子和终止子之间，所以应在引物的5′端分别添加限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ的酶切位点。 3′ 3′ EcoRⅠ KpnⅠ 4 5 6 2 3 1 专题强化训练 解析：重组质粒含有目的基因、标记基因、限制酶切割位点、启动子、终止子、复制原点，结合图示可知，启动子有启动子1和启动子2，目的基因包括TetR基因和GFP基因，将目的基因导入质粒两种酶切位点之间，故可绘制图形如下：。分析题图，重组质粒中TetR基因和GFP基因转录方向不同，故图4的重组质粒分别表达TetR蛋白、GFP蛋白时，所使用的模板链位于不同DNA单链。 $