1.2 微生物的培养技术及应用（第2课时）课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA是主要遗传物质 第一章 发酵工程 第2节 微生物的选择培养与计数 选必三 REN JIAO BAN GAO ZHONG SHENG WU XUAN BI SAN 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。 稀释涂布平板法 呈现的杂菌群 选择培养基应运而生。 从社会中来 PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 1973年，科学家布鲁克在美国黄石国家公园的热泉中筛选出耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR） 1. 科学实例： 耐高温的酶 耐高温生物体 耐高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 (1)筛选思路： (2)筛选原因： 因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而水生栖热菌能在70-800C高温条件下生存。 选择培养基 01. 启示：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 耐寒微生物 耐热微生物 石油分解菌 同理： 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和PH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。 选择培养基 适用实验室微生物的筛选。 1.概念: 2.类型: 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 选择培养基 01. 拓展： 1、选择培养基配制的三种方法 （1）利用营养缺陷进行选择培养 *营养缺陷的微生物不能正常生长 （2）利用添加某种化学物质进行选择培养 *添加杀伤性物质，有抗性的可以生长，无抗性的死亡 （3）利用改变培养条件进行选择培养 *调节温度、pH等生长条件，只有适应的可以生长 拓展 2.实例 （1）目的：分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长 原理：青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用 配制：使用______________的培养基 （2）目的：分离固氮菌 原理：固氮微生物能利用空气中的氮气 配制：使用________________________的培养基 加入青霉素 不加氮源（以N2为氮源） 拓展 2.实例 （3）目的：分离自养型微生物 原理：自养型微生物能利用无机碳源 配制：使用____________________________的培养基 （4）目的：分离耐酸菌 原理：耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长 配制：使用_______________的培养基 不加有机碳源（以CO2为碳源） 将pH调至酸性 选择培养基配方的设计 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。 讨论1： 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。可以将分解尿素的细菌分离出来。 思考讨论 讨论2： 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 该培养基与普通培养基相比较，共同点是都以有机碳作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 培养基二 培养基一的碳源为_______，氮源为_______；培养基二的碳源为_______，氮源为_____ 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 固体培养基 选择培养基 异养微生物 选择培养基配方的设计 思考讨论 比较选择培养基与鉴别培养基 项目 选择培养基 鉴别培养基 原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应 用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物 举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽) 图示 尿素分解菌 大肠杆菌 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 操作步骤: 稀释涂布平板法 制备培养基 土壤取样 样品梯度稀释 取样涂布平板 培养与观察 微生物的选择培养 02. 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g 微量 移液器 ①铲取土样，将样品装入纸袋中 注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 （1）梯度稀释 稀释涂布平板法 微生物的选择培养 02. ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 （2）涂布平板 注意：各浓度分别涂布3个平板（重复实验） 稀释涂布平板法 微生物的选择培养 02. 恒温培养箱 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 （3）菌落培养 培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，为什么？ 未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长，说明了什么？ 培养未接种的培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。 稀释涂布平板法 微生物的选择培养 02. 1、用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 不能。平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 思考讨论 2、与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？ 稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。 思考讨论 比较稀释涂布平板法和平板划线法 主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法 主要步骤 接种工具 菌体获取 能否用于计数 共同点 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种环在固体培养基表面连续划线 涂布器 接种环 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 不能计数 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征。 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 1.稀释涂布平板法 1.稀释涂布平板法 2.显微镜直接计数法 ——间接计数法 ——直接计数法 计数原则: 为了保证结果准确，选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 微生物的数量测定 03. 统计的菌落往往比活菌的实际数目低； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示； 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 结果分析: 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 1.稀释涂布平板法 微生物的数量测定 03. 计算公式: 每g样品中的菌落数＝ (C÷V)×M M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 （234÷0.1）×106=2.34×109 答 B 例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 1.稀释涂布平板法 微生物的数量测定 03. 2.显微镜直接计数法 血细胞计数板： 细菌计数板： 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 缺点： ①不能区分死菌和活菌→偏大 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 优点：快速、直观 微生物的数量测定 03. 微生物的计数方法比较 内容 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 计数依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差 计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝ 平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 1.提出问题 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ 利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。 2.做出假设 3.实验设计 实验步骤 土壤 取样 制备 培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 ①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 1.培养基的制备 ②配方： 常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml 制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组， 用以尿素为唯一氮源的培养基做实验组， 用来判断选择培养基是否具有选择作用。 ①提供无机盐； ②调节pH。 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 （1）土壤取样 2.实验设计 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3～8cm 的土壤层。因此，取样时一般要铲去表层土。 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。 操作完成后，一定要洗手。 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 测细菌数：一般用104、105、106稀释液 测放线菌：一般用103、104、105稀释液 测真菌数：一般用102、103、104稀释液 （2）样品的稀释 选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 思考 测定土壤中细菌的数量，一般选用 倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放 一点。 1×104、1×105和1×106 宽 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 （2）样品的稀释 1）每个浓度设置了 个平板，1、2、3平板是选择培养基（ 实验）， 4为 培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）； 2）另外，整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的 。 培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。 4 重复 牛肉膏蛋白胨 2 选择培养基和牛肉膏蛋白胨 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 ①实验组： 1、2、3组接种的选择培养基➯用以分离并计数能分解尿素的细菌 第4组接种的牛肉膏蛋白胨培养基➯用以判断选择培养基是否具有选择作用 ②对照组： 第5组不涂布稀释液的选择培养基➯用以验证培养基中是否含有杂菌 第6组牛肉膏蛋白胨培养基➯用以验证培养基中是否含有杂菌 实验结果：前3组实验组分离得到单菌落； 第4组得到多种菌落； 第5,6组正常情况下无菌落。 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 ①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。 ③结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 ②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 （4）微生物的培养与观察 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 (1)无菌操作: (2)做好标记: (3)规划时间: 本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。 ①取土样的用具在使用前都需要 。 ②实验操作均应在 进行。 4.操作提示 灭菌 酒精灯火焰旁 本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的 等。 稀释度 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 5.结果分析与评价 如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。 1. 结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 如果得到了两个或多个菌落数为30-300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 2. 你是否获得了某一稀释度下菌落数 为30～300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？ 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 5.结果分析与评价 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。 3. 你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？ 甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。该同学的统计结果 (填“可靠”或“不可靠”)。若不可靠，应如何改进？ 2.乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理 (填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应 ，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。 为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。 不可靠 不合理 分析实验过程中可能的影响因素 针对训练 3.某同学在三种稀释度下取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到了以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。 平板 稀释度　　　 平板1 平板2 平板3 104 320 360 356 105 212 234 287 106 21 23 18 105的稀释度下取0.1 mL菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300范围内，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108(个)。 针对训练 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3 脲酶 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 6.进一步探究 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料，进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 脲酶阴性 脲酶阳性 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红—美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。 测定饮水中大肠杆菌数量的方法 与生活的联系 选择培养基与鉴别培养基的比较 项目 选择培养基 鉴别培养基 原理 用途 举例 图示 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色) 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实验设计 课堂小结 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。( ) （2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。( ) （3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。( ) 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( ) A.菌落中的细菌数目是固定的 B.平板上的一个菌落就是一个细菌 C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 一、概念检测 √ √ √ D 练习与应用 二、拓展应用 1.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此从中分离能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。 练习与应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40% ~ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 可以参考本节“探究·实践”中的设计思路进行设计。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 练习与应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40% ~ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。 （3）有同学说可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 练习与应用 拓展：设置对照 1、设置对照的主要目的： 2、设置对照的方法： ①空白对照：不给对照组任何处理因素。 ②条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。 ③自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。 ④相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 Lavf58.51.100 $