热点题型6 基因表达载体构建中限制酶和引物的选取-【学霸黑白题】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（浙科版）

热点 热点题型6基因表达载体构建中限制酶和引物的选取 1.通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变。如图为基因工程中获取突变基 因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模 板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切核酸酶a和限 制性内切核酸酶b的识别位点。下列有关叙述不正确的是 A.两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的 酶aT 引物1上 定向插入 G 引物2 B.一个DNA分子在第2轮PCR后，得到的四个DNA分子 酶aT 第1轮PCR 酶b 各不相同 引物1上山 G C.第2轮PCR,引物1与图中②结合并且形成两条链等长 r引物2 的突变基因 酶a 第2轮PCR 酶h ,② D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的 引物1 引物2 DNA占1/4 酶h 2.(2023·河北保定期中)如图是培养转基因大肠杆菌的部分示意图，图中标注了相关限制酶的 切割位点。下列叙述中正确的是 四环素 抗性基因 BamH I Bel I BamH I引物甲 Hind -BamH I 质粒 Hindl 启动子 氨苄青霉素 BclI目的基因 引 引 Sau3A I 抗性基因 物 乙 图1 图2 A.若通过PCR技术扩增该目的基因，应该选用引物甲和引物乙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体时，应选用BclI和HindⅢ切断氢键 C.检测目的基因在受体细胞中是否转录出mRNA,可以通过PCR等技术 D.质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达 3.(2023·河北张家口开学考试)糖化酶 BamH I Pst I Xba I 相关结构： Pox:甲醇诱导型启动子 是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分 Tov:终止子 启动子 HS4:组氨酸脱氢酶基因，其表 野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能 达产物催化组氨酸合成 Oi:复制原点 直接利用淀粉。研究人员将经诱变处 amp amp:氨苄青霉素抗性基因 pPIC9K 理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因终止子 HIS4 导人毕赤酵母GS115(对氨苄青霉素 Ori Pst I 不敏感)中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图所示。质 粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因amp'转录的模板链属于b链的片段。请回答下列 问题。 10黑白题生物|选择性必修三ZK (1)经诱变获得高产菌株后，获取高产糖化酶基因并对其进行PCR扩增，为了方便切割且能够 准确和载体结合，需要在两种引物的 （填“5”或“3”)端连接限制酶 识 别的序列。扩增过程中需要 催化。 (2)将高产糖化酶基因表达载体导入毕赤酵母，并且在其细胞内维持稳定和表达的过程称为 。高产糖化酶基因表达时， 酶识别启动子并与启动子结合开启转 录，其转录时的模板链属于 (填“a”或“b”)链的片段。 (3)毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，因 此可利用 的基础培养基（不含淀粉）初步筛选导入高产糖化酶基因表达 载体的毕赤酵母GS115,再将筛选出的细胞转接至含 的培养液（含淀粉） 中进行发酵产酶性能测定。 4.(2023·湖南邵阳期中)人的血清白蛋白(HSA)在临床上需求量很大，通常从人血中提取。 但由于艾滋病病毒(HV)等人类感染性病原体造成的威胁与日俱增，使人们对血液制品顾虑 重重，图一是以基因工程技术获取HSA的两条途径，其中报告基因表达的产物能催化无色物 质K呈现蓝色；图二为HSA基因两侧的核苷酸序列；图三为相关限制酶的识别序列和切割位 点。据图回答下列问题： 报告基因 酶C位点 酶A位，点、 植 然 物 T-DNA- Ti质粒 酶B位，点 组①受②基 T 抗生素 体 抗性基因 物 5'-AATGGATCCTTC HSA基因CATTCAATTCTC-3 77/77 胞 HSA基因 图一 图二 酶A识别序列酶B识别序列酶C识别序列 -GAATTC- -GGATCC- -AATT- 图三 (1)基因工程的核心步骤是 (2)采用PCR技术扩增HSA基因，根据图二分析，需选择的一对引物序列是 A.引物I是5'-AATGGATCCTTC-3',引物Ⅱ是5'-GAGAATTGAATG-3' B.引物I是5'-AATGGATCCTTC-3',引物Ⅱ是5'-CATTCAATTCTC-3' C.引物I是5'-GAAGGATCCATT-3',引物Ⅱ是5'-GTAAGTTAAGAG-3' D.引物I是5'-GAAGGATCCATT-3',引物Ⅱ是5'-GAGAATTGAATG-3' (3)依据图一、图二和图三分析，切割含HSA基因的DNA片段选用的限制酶是 切割质粒应选用的限制酶是 0 (4)图一过程①中需将植物细胞与 混合后共同培养，旨在让 整合到植 物细胞染色体DNA上，除尽农杆菌后，还须转接到含 的培养基上筛选出转化 的植物细胞。 进阶突破·专项练11点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误：由题图可知 载体P是中间质粒，不含有表达该目的基因的启动子和终止子，C正 确：受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒 也可能只导人了空质粒（不含目的基因的质粒），D错误。故选C。 2.A解析：可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表 达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高， A正确；由题图可知，在同一个T-DNA中OsCLO1启动子启动转录 的方向与其他三个基因的不同，四个基因转录时不都以DNA的同一 条单链为模板，B错误：卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素 抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化 的水稻细胞，C错误：由题意可知，利用农杆菌转化法转化水稻，可通 过Ti质粒中T-DNA的作用使目的基因插入水稻细胞的染色体DNA 上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因在水稻细胞核内进行 转录，在核糖体中进行翻译，D错误。故选A。 3.(1)逆转录酶防止RNA被降解(2)GCGGCCGC a链为转录模 板链，根据mRNA的合成方向，引物2的5'端靠近启动子，应有NotI 的酶切位点(3)转化氨苄青霉素(4)模板4种脱氧核苷三磷 酸退火 解析：(1)由mRNA得到cDNA的过程是逆转录过程，所需的酶是逆 转录酶：酶具有专一性，RNA酶能水解RNA,而DEPC物质可与RNA 酶结合使酶发生变性，故提取过程加入DEPC物质的作用是防止 RNA被降解。(2)引物需要与模板的3'端结合，引物1的5'端酶切 位点的碱基序列为GAATTC,即选择的酶是EcoR I,由于a链为转录 模板链，根据mRNA的合成方向，引物2的5'端靠近启动子，应有 NtI的酶切位点，引物2的5'端酶切位点的碱基序列为 GCGGCCGC。(3)plgR基因表达载体进入菌体内，此过程称为转化； 据题图可知，重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因.可作为标记基因 筛选重组质粒，故将菌液涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上 培养，加入诱导剂诱导gR基因在大肠杆菌中表达，提取、纯化蛋白 质。(4)PCR是一项体外扩增DNA分子的技术，利用PCR技术扩增 lgR基因时，需要在反应体系中加入模板（目的基因的两条链）、4种 脱氧核糖核苷三磷酸、引物、耐高温的Tag DNA聚合酶、缓冲液等物 质：PCR反应过程是变性+退火+延伸，其中变性温度为90~95℃ 退火时温度为50~60℃，延伸时温度为72℃左右，故在三个步骤中 温度最低的是退火。 4.(1)逆转录酶与目的基因两端的部分核苷酸序列碱基互补配对 琼脂糖凝胶电泳(2)避免日的基因和质粒的自身环化：避免日的基 因和质粒的反向连接(3)潮霉素(4)细胞增殖 解析：(1)①过程代表逆转录，该过程需要逆转录酶的催化。步骤② 中利用PCR技术扩增目的基因时，设计引物序列的主要依据是与目 的基因两端的部分核苷酸序列碱基互补配对。PCR反应完成后，常 采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR的产物。(2)在构建基因表达 载体时，通常用双酶切的好处是避免目的基因和质粒的自身环化；避 免目的基因和质粒的反向连接。(3)用农杆菌侵染植物细胞时，T 质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细 胞的染色体DNA上，若烟草细胞中成功导人了目的基因，则烟草细 胞中应具有潮霉素抗性基因，因此可在添加潮霉素的培养基中筛选 导入目的基因的烟草愈伤组织细胞。(4)题图1过程涉及的生物工 程包括植物基因工程和植物细胞工程，后者利用了细胞增殖的原理。 热点题型6基因表达载体构建中 限制酶和引物的选取 1.C解析：引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶 识别位点，帮助目的基因定向定点插入载体，避免发生自身环化， A正确：第1、2轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点 可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，一个 DNA分子在第2轮PCR后，得到的四个DNA分子各不相同，B正确； 在第3轮PCR中，物质②是引物2以引物1拓展得到的DNA链为模 板进行复制得到的，故引物1能与题图中②结合并且形成两条链等 长的突变基因，C错误：在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条 专项练参考答案 链等长的DNA分子有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，D 正确。故选C 2.C解析：PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合， 沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为题图2中引物甲和引 物丙，A错误：根据质粒上限制酶识别序列的分布位点可知，构建表 达载体时，不能选用限制酶BamH I,否则会导致两种抗性基因都被 破坏，因此应该选择BlI和HindⅢ这两种限制酶以及DNA连接 酶，限制酶切断的是磷酸二酯键，B错误：检测目的基因在受体细胞 中是否转录出mRNA,先逆转录得到cDNA,再运用PCR等技术，C正 确：质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞，D错误。故 选C。 3.(1)5'BamH I和XbaI耐高温的Tag DNA聚合酶(2)转化 RNA聚合a(3)不含组氨酸甲醇 解析：(1)据题图可知，将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶 基因导入毕赤酵母GS115(对氨苄青霉素不敏感)中，PAo是甲醇诱 导型启动子，TAOx是终止子，限制酶PstI会破坏复制原点，不能使用 限制酶PsI,所以获取高产糖化酶基因并对其进行PCR扩增，为了 方便切割且能够准确和载体结合，需要在两种引物的5'端连接限制 酶BamH I和XbaI识别的序列。扩增过程中需要耐高温的Tag DNA 聚合酶催化。(2)将高产糖化酶基因表达载体导入毕赤酵母，并且在 其细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。高产糖化酶基因表达 时，RNA聚合酶识别启动子并与启动子结合开启转录，由于限制酶 BamH I和XbaI位于质粒的外侧链为a链，故其转录时的模板链属 于a链的片段。(3)由于毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型 微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，因此可利用不含组氨酸的 基础培养基（不含淀粉）初步筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕 赤酵母GS115,由于质粒上含有甲醇诱导型启动子，所以再将筛选出 的细胞转接至含甲醇的培养液（含淀粉）中进行发酵产酶性能测定。 4.(1)基因表达载体的构建(2)A(3)酶B和酶C酶B和酶A (4)农杆菌T-DNA物质K 解析：(1)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。(2)PCR中 需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因碱基互补配对，子链延 伸时是从引物的5'端向3'端延伸，根据题图二中目的基因HSA处于 中间位置，所以符合条件的引物I是5'-AATGGATCCTTC-3',引物 Ⅱ是5'-GAGAATTGAATG-3',故选A。(3)题图二目的基因所在 DNA中只有酶B和酶C的识别序列，可以用限制酶B和C进行切 割，质粒的T-DNA在酶A和酶B之间，所以切割质粒时用酶A和酶 B切割。(4)题图一过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培 养，旨在让T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上：除尽农杆菌后， 为筛选出转化的植物细胞，利用重组质粒上的报告基因表达产物能 催化无色物质K呈蓝色的特性。 热点题型7融合新概念 1.C解析：驯化培养基A中加入的敌敌畏对微生物进行选择，从土壤 微生物原有的各种变异类型中筛选出能在敌敌畏的环境中生存的微 生物，即高耐受或能分解敌敌畏的微生物，A错误：在培养基B上进 行5次划线，第一次挑取菌液划线前需灼烧接种环，每一次划线结束 都需灼烧接种环，故接种过程中需对接种环进行6次灼烧，B错误： 单位时间内剩余的敌敌畏越少，说明筛选出的微生物分解敌敌畏的 能力越强，故通过测定培养瓶中敌敌畏的剩余量，可筛选出分解敌敌 畏能力较强的微生物，C正确：用稀释涂布平板法来统计样品中的活 菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，一个 菌落一般来源于一个活菌，但也有可能是两个或多个连在一起的活 菌，D错误。故选C。 2.D解析：若线状重组黏粒两端的黏性末端能碱基互补配对，则线状 重组黏粒进入受体菌后可能会发生自身环化，A错误：oi是复制原 点，不能进行筛选，amp'序列能筛选出含目的基因的受体菌，B错误； 步骤①和②应使用两种酶，防止目的基因与黏粒反向连接，C错误； 含目的基因的重组黏粒与入噬菌体包装蛋白混合后用于构建入噬菌 体，然后用于侵染细菌，将目的基因导人受体菌，D正确。故选D。 黑白题39