热点题型5 基因工程的操作程序-【学霸黑白题】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（浙科版）

液0.1mL,使每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的。 (4)因为小鼠形成的抗体对人体来说是抗原，存在着排异反应，故上 述过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体。(5)由于调控细胞 无限增殖的pG基因位于细胞质中，因此若要采用细胞核移植获得 单克隆抗体，只能将浆细胞的细胞核移入到含有pG基因的细胞质 中，获得重组细胞，最终获得单克隆抗体。 3.(1)定期更换培养液加强免疫，刺激小鼠机体产生更多的B淋巴细 胞聚乙二醇(PEG)(2)乙和丙能产生特异性强、灵敏度高的 抗cTI抗体的杂交瘤细胞(3)不同部位酶标抗体与待测抗原结 合，酶催化特定底物反应 解析：(1)在动物细胞培养的过程中，为防止有害代谢物的积累，需要 定期更换培养液：为了提高淋巴细胞的免疫能力，刺激小鼠机体形成 更多能产生抗cTI抗体的B淋巴细胞，一般通过多次注射相同抗原 的方法实现；取脾脏部分组织制成细胞悬液与骨髓瘤细胞诱导融合， 一般采用的化学诱导剂为聚乙二醇(PEG)。(2)据题图1可知，杂交 瘤细胞需要对甲进行筛选，因此乙和丙应该是筛选得到的杂交瘤细 胞；其中①代表用特定的选择培养基进行筛选，②过程表示将乙细胞 接种到多孔培养板上，进行克隆化培养和抗体阳性检测，之后稀释、 培养、再检测，并多次重复上述操作，就能获得足够数量的能分泌 抗cTl抗体的细胞，该类细胞的特点是既能大量增殖又能产生特异 性强、灵敏度高的抗cTl抗体。(3)分析题图2中过程可知，两种抗 体与检测的抗原均能结合，但结合部位是不同的：该检测方法中，酶 标抗体与待测抗原结合，酶催化特定底物反应产生检测产物，可通过 测定产物量来判断待测抗原量。 4.(1)CD47蛋白（或CD47或胰蛋白或胶原蛋白）（答出1个即可） (2)选择既能大量增殖，又能产生专一（或特异性）抗体(3)抗原 与抗体特异性结合筛选出能产生抗CD47抗体（或所需抗体）的杂 交瘤细胞(4)不加单克隆抗体的巨噬细胞与肿瘤细胞共同培养体 系高于 解析：(1)为获得抗CD47的单克隆抗体，实验前应给模型小鼠注射 CD47蛋白，以刺激机体产生相应的B淋巴细胞。题图1中制备B淋 巴细胞悬液时可采用机械方法或用相应蛋白酶处理。(2)题图1中 筛选1是将融合细胞放在选择培养基上培养，将既能大量增殖、又能 产生抗体的杂交瘤细胞筛选出来。(3)题图2表示筛选2过程，取一 定稀释倍数的杂交瘤细胞悬液加入多孔玻璃板中，适宜条件下培养， 然后利用抗原与抗体特异性结合的原理进行抗体检测。检测阳性反 应孔中的细胞还需多次稀释培养并检测，最终将能产生抗CD47抗 体的杂交瘤细胞筛选出来。(4)为研究抗CD47的单克隆抗体的功 能，实验组为单克隆抗体加入巨噬细胞与肿瘤细胞的共同培养体系， 根据单一变量原则，应设置不加单克隆抗体的巨噬细胞和肿瘤细胞 的共培养体系作为对照组。若实验组中被吞噬的肿瘤细胞所占的比 例高于对照组，则可证明上述推测正确。 热点题型4PCR技术 I.B解析：PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲 溶液中一般要添加Mg2+,Mg2+能激活DNA聚合酶，A正确；一般情况 下，引物A和B的长度越长，C和G比例越高，则PCR循环步骤中的 复性温度设定就越高，B错误；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳 来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色，然后可在紫外灯下检 测出来，C正确：实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引 物B自身出现了局部碱基互补配对而失效，导致子链无法延伸， D正确。故选B。 2.D解析：为了排除实验操作等对结果的影响，需要设置空白对照， A正确；TMV-cp基因在NC89烟草细胞内稳定存在，所以能够在转基 因烟草中提取到TMV-cp基因，电泳会出现相应的条带，B正确：8~ 18表示杂草样品，均没有出现TMW-p基因条带，说明烟草中 TMW-cp基因没有漂移至周边杂草，C正确；将TMW-cp基因转入其他 植物时仍需要经过安全性评价，D错误。故选D。 3.(1)引物1和引物4（2)使目的基因经限制酶切割后能产生黏性末 端，以便和质粒相连使枯草杆菌处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态原核生物多为单细胞生物；细胞繁殖速度 选择性必修三·ZK 快：遗传物质相对较少；易培养：代谢速度快 5-CTGCA (3)3-G (4)可防止目的基因和质粒反向连接，防止目的基 因、质粒自身环化 解析：(1)加端PCR所选引物应有一部分序列不与模板链配对，结合 题图可知引物1和引物4是加端PCR所用引物。(2)在目的基因的 两端添加限制酶切割位点后，可使用相应的限制酶分别切割目的基 因和质粒，使二者产生相同的黏性末端，以便连接形成重组质粒。先 用Ca2+处理枯草杆菌，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分 子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导人其中。原核生物 多为单细胞生物，其繁殖速度快，遗传物质相对较少，易培养，代谢速 度快，因此常用原核生物作为基因工程的受体细胞。(3)限制酶 PstI的识别序列及切割位点为5'-CTGCA'G-3',该酶切割后产生的 黏性末端如答案所示。(4)在hIGF-1基因的两端加入不同的限制酶 切割位点后，再利用相应的限制酶切割，一般会产生不同的黏性末 端，在利用DNA连接酶连接时，可防止目的基因和质粒反向连接，防 止目的基因、质粒自身环化。 4.(1)缓冲液耐高温的Tag DNA聚合酶一方面引物能与目的基因 中特定的核苷酸序列发生碱基互补配对，另一方面引物能使DNA聚 合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸使子链充分延伸（或获得 更多的完整目的片段)(2)5'-AAGCTT-3'5'-CATATG-3' (3)限制酶HindⅢ、限制酶NdeI以及DNA连接酶解旋过程，促进 复制过程(4)青霉素四环素5和6菌落是否具有荧光，有荧 光的则含有pX质粒 解析：(I)PCR全称为聚合酶链式反应，是在DNA聚合酶作用下，在 体外进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术，利用的原理是DNA 复制。微量离心管中需加入的物质有：模板、特异性引物、原料、缓冲 液和耐高温的Tag DNA聚合酶。PCR过程需要特异性引物的原因 是一方面引物能与目的基因中特定的核苷酸序列发生碱基互补配 对，另一方面引物能使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷 酸，PCR的最后一个循环结束后通常还需要在72℃维持7min左右， 这样可以使子链充分延伸（或获得更多的完整目的片段）。(2)为 使S-RBD基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S 蛋白，再合成RBD蛋白，则需要让S基因与启动子靠近，则PCR过程 中，应在引物1的5'端添加限制酶HindⅢ的序列5'-AAGCTT-3',在 引物2的5'端添加限制酶NdI的序列5'-CATATG-3'。(3)过程B 为目的基因表达载体的构建，需要的工具酶有限制酶HidⅢ、限制 酶NdeI以及DNA连接酶，基因表达载体中，复制原点中A-T的比例 较高，有利于解旋过程，促进复制过程的实现，这是因为A-T之间有 两个氢键，而G-C之间有三个氢键。(4)为筛选出含有目的基因的 大肠杆菌，通常可先后用两种抗生素进行原位影印培养（使用无菌的 线毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B 上)。培养基A中应添加青霉素，培养基B中应添加四环素，能在前 者中生长的大肠杆菌可能是导人了重组质粒和普通质粒的大肠杆 菌，而在构建基因表达载体时，由于四环素抗性基因被破坏，因而含 有重组质粒的大肠杆菌不具有对四环素的抗性，因此，题图2中含有 重组质粒的菌落是5和6，根据题图中信息，鉴定pX质粒和重组pX 质粒是否导入工程菌，在细菌群体水平上还可以通过观察菌落是否 具有荧光，有荧光的则含有pX质粒，这是因为在构建重组质粒的过 程中荧光蛋白基因受到了破坏。 热点题型5基因工程的操作程序 1.C解析：基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，不是通过PCR 扩增获取目的基因，A错误；由于载体E只有产生黏性未端的酶切位 点，要使中间载体P接入载体E,同时防止载体E自身环化，需要用 两种限制酶分别切割载体E和中间载体P,据题图可知，中间载体P 和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI 酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoR V识别位点 并且其切割后为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然也能 切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoI和PstI酶识别位 黑白题38 点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误；由题图可知， 载体P是中间质粒，不含有表达该目的基因的启动子和终止子，C正 确：受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒， 也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D错误。故选C。 2.A解析：可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表 达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高， A正确；由题图可知，在同一个T-DNA中OsGL01启动子启动转录 的方向与其他三个基因的不同，四个基因转录时不都以DNA的同 条单链为模板，B错误：卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素 抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化 的水稻细胞，C错误：由题意可知，利用农杆菌转化法转化水稻，可通 过Ti质粒中T-DNA的作用使目的基因插入水稻细胞的染色体DNA 上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因在水稻细胞核内进行 转录，在核糖体中进行翻译，D错误。故选A。 3.(1)逆转录酶防止RNA被降解(2)GCGGCCGC a链为转录模 板链，根据mRNA的合成方向，引物2的5'端靠近启动子，应有NotI 的酶切位点(3)转化氨苄青霉素(4)模板4种脱氧核苷三磷 酸退火 解析：(1)由mRNA得到cDNA的过程是逆转录过程，所需的酶是逆 转录酶；酶具有专一性，RNA酶能水解RNA,而DEPC物质可与RNA 酶结合使酶发生变性，故提取过程加入DEPC物质的作用是防止 RNA被降解。(2)引物需要与模板的3'端结合，引物1的5'端酶切 位点的碱基序列为GAATTC,即选择的酶是EcoR I,由于a链为转录 模板链，根据mRNA的合成方向，引物2的5'端靠近启动子，应有 NotI的酶切位点，引物2的5'端酶切位点的碱基序列为 GCGGCCGC。(3)plgR基因表达载体进人菌体内，此过程称为转化； 据题图可知，重组质粒上含有氨卡青霉素抗性基因，可作为标记基因 筛选重组质粒，故将菌液涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上 培养，加人诱导剂诱导gR基因在大肠杆菌中表达，提取、纯化蛋白 质。(4)PCR是一项体外扩增DNA分子的技术，利用PCR技术扩增 pgR基因时，需要在反应体系中加入模板（目的基因的两条链）、4种 脱氧核糖核苷三磷酸、引物、耐高温的Tag DNA聚合酶、缓冲液等物 质：PCR反应过程是变性→退火→延伸，其中变性温度为90~95℃， 退火时温度为50~60℃，延伸时温度为72℃左右，故在三个步骤中 温度最低的是退火。 4.(1)逆转录酶与目的基因两端的部分核苷酸序列碱基互补配对 琼脂糖凝胶电泳(2)避免目的基因和质粒的自身环化：避免目的基 因和质粒的反向连接(3)潮霉素(4)细胞增殖 解析：(1)①过程代表逆转录，该过程需要逆转录酶的催化。步骤② 中利用PCR技术扩增目的基因时，设计引物序列的主要依据是与目 的基因两端的部分核苷酸序列碱基互补配对。PCR反应完成后，常 采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR的产物。(2)在构建基因表达 载体时，通常用双酶切的好处是避免目的基因和质粒的自身环化；避 免目的基因和质粒的反向连接。(3)用农杆菌侵染植物细胞时， 质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细 胞的染色体DNA上，若烟草细胞中成功导人了目的基因，则烟草细 胞中应具有潮霉素抗性基因，因此可在添加潮霉素的培养基中筛选 导入目的基因的烟草愈伤组织细胞。(4)题图1过程涉及的生物工 程包括植物基因工程和植物细胞工程，后者利用了细胞增殖的原理。 热点题型6基因表达载体构建中 限制酶和引物的选取 1.C解析：引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶 识别位点，帮助目的基因定向定点插入载体，避免发生自身环化 A正确；第1、2轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点 可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，一个 DNA分子在第2轮PCR后，得到的四个DNA分子各不相同，B正确； 在第3轮PCR中，物质②是引物2以引物1拓展得到的DNA链为模 板进行复制得到的，故引物1能与题图中②结合并且形成两条链等 长的突变基因，C错误：在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条 专项练参考答案 链等长的DNA分子有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，D 正确。故选C。 2.C解析：PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合， 沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为题图2中引物甲和引 物丙，A错误：根据质粒上限制酶识别序列的分布位点可知，构建表 达载体时，不能选用限制酶BamH I,否则会导致两种抗性基因都被 破坏，因此应该选择BclI和HindⅢ这两种限制酶以及DNA连接 酶，限制酶切断的是磷酸二酯键，B错误：检测目的基因在受体细胞 中是否转录出mRNA,先逆转录得到cDNA,再运用PCR等技术，C正 确：质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞，D错误。故 选C。 3.(1)5'BamH I和XbaI耐高温的Tag DNA聚合酶(2)转化 RNA聚合a(3)不含组氨酸甲醇 解析：(1)据题图可知，将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶 基因导人毕赤酵母GS115(对氨苄青霉素不敏感)中，PAox是甲醇诱 导型启动子，TAox是终止子，限制酶PstI会破坏复制原点，不能使用 限制酶PstI,所以获取高产糖化酶基因并对其进行PCR扩增，为了 方便切割且能够准确和载体结合，需要在两种引物的5'端连接限制 酶BamH I和XbaI识别的序列。扩增过程中需要耐高温的Tag DNA 聚合酶催化。(2)将高产糖化酶基因表达载体导入毕赤酵母，并且在 其细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。高产糖化酶基因表达 时，RNA聚合酶识别启动子并与启动子结合开启转录，由于限制酶 BamH I和XbaI位于质粒的外侧链为a链，故其转录时的模板链属 于a链的片段。(3)由于毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型 微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，因此可利用不含组氨酸的 基础培养基（不含淀粉）初步筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕 赤酵母GS115,由于质粒上含有甲醇诱导型启动子，所以再将筛选出 的细胞转接至含甲醇的培养液（含淀粉）中进行发酵产酶性能测定。 4.(1)基因表达载体的构建(2)A(3)酶B和酶C酶B和酶A (4)农杆菌T-DNA物质K 解析：(1)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。(2)PCR中 需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因碱基互补配对，子链延 伸时是从引物的5'端向3'端延伸，根据题图二中目的基因HSA处于 中间位置，所以符合条件的引物I是5'-AATGGATCCTTC-3',引物 Ⅱ是5'-GAGAATTGAATG-3',故选A。(3)题图二目的基因所在 DNA中只有酶B和酶C的识别序列，可以用限制酶B和C进行切 割，质粒的T-DNA在酶A和酶B之间，所以切割质粒时用酶A和酶 B切割。(4)题图一过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培 养，旨在让T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上；除尽农杆菌后， 为筛选出转化的植物细胞，利用重组质粒上的报告基因表达产物能 催化无色物质K呈蓝色的特性。 热点题型7融合新概念 1.C解析：驯化培养基A中加人的敌敌畏对微生物进行选择，从土壤 微生物原有的各种变异类型中筛选出能在敌敌畏的环境中生存的微 生物，即高耐受或能分解敌敌畏的微生物，A错误；在培养基B上进 行5次划线，第一次挑取菌液划线前需灼烧接种环，每一次划线结束 都需灼烧接种环，故接种过程中需对接种环进行6次灼烧，B错误； 单位时间内剩余的敌敌畏越少，说明筛选出的微生物分解敌敌畏的 能力越强，故通过测定培养瓶中敌敌畏的剩余量，可筛选出分解敌敌 畏能力较强的微生物，C正确；用稀释涂布平板法来统计样品中的活 菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，一个 菌落一般来源于一个活菌，但也有可能是两个或多个连在一起的活 菌，D错误。故选C。 2.D解析：若线状重组黏粒两端的黏性末端能碱基互补配对，则线状 重组黏粒进入受体菌后可能会发生自身环化，A错误；o是复制原 点，不能进行筛选，amp序列能筛选出含目的基因的受体菌，B错误； 步骤①和②应使用两种酶，防止目的基因与黏粒反向连接，C错误； 含目的基因的重组黏粒与入噬菌体包装蛋白混合后用于构建λ噬菌 体，然后用于侵染细菌，将目的基因导入受体菌，D正确。故选D。 黑白题39热点 强化 热点题型5基因工程的操作程序 1.(2023·黑龙江哈尔滨期中)由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性 末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是 启动子 Xho I Xho I 复制原点 EoRV复制原点 Kpn I Pst I -Pst I 载体P Sma I 载体E 终止子 抗性基因 抗性基因 -CTCGAG--GATATC--CTGCAG- -CCCGGG--GGTACC- -GAGCTC- -CTATAG- -GACGTC- -GGGCCC- -CCATGG- Xho I EcoR V Pst I Sma I Kpn I A.通过PCR扩增获取目的基因是基因工程的核心工作 B.为了便于该目的基因接入载体E,可用限制酶EcoR V或SmaI切割载体P C.载体P只能作为中间载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明目的基因表达成功 2.(2023·山东滨州期中)OsGL01、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研 究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多 基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构 建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是 () 潮骞素抗性基因→么CeCATHOSGLA01☑公→☑EcGCL*sR 卡那霉素抗性基因 T-DNA- 注：→启动子，终止子，☑叶绿体转运肽 A.可用分子杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B.四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板 C.可选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D.四个基因都在水稻叶绿体内进行表达 3.(2023·山东淄博期末)黏膜免疫系统 启动子 Xho I 引物2 作为第一道免疫防御屏障，能够参与保a链5 复 Not I:GCGGCCGC 护生物体免受病原体的感染。多聚免 b链3' 质粒 EcoR I:GAATTC Xho I:CTCGAG 引物1 点 疫球蛋白受体(pIgR)作为黏膜免疫防 <终止子 plgR基因 氨苄青霉素抗性基因 御的一个关键因子，能够介导免疫球蛋 白跨过上皮细胞进行转运和分泌，发挥免疫球蛋白在黏液中清除病原体和毒素的作用。研究 人员从大菱鲆提取plgR基因，针对不同器官组织开展了plgR基因研究（如图），其中DEPC 物质可与RNA酶结合使酶发生变性。 08黑白题生物|选择性必修三ZK (1)研究人员通过mRNA得到cDNA时所需要的酶是 提取过程加入DEPC物 质的作用是 0 (2)将pgR基因以正确方向插入质粒需要双酶切，这就要求在设计引物时，需在引物的5'端 加入相应的酶切位点。已知a链为转录模板链，引物1的5'端酶切位点的碱基序列为 GAATTC,则引物2的5'端酶切位点的碱基序列为 理由是 (3)构建plgR基因表达载体后，与处于感受态的大肠杆菌菌株混合，pgR基因表达载体进入 菌体内，此过程称为 。然后将菌液涂布在含有 的LB固体培 养基培养，加入诱导剂诱导plgR基因在大肠杆菌中表达，提取、纯化蛋白质。 (4)在整个实验过程中多次使用PCR技术，如利用PCR技术扩增plgR基因时，需要在反应体 系中加入 、引物、耐高温的Tag DNA聚合酶、缓冲液等物质，设 置PCR仪器的控制参数，启动三步骤扩增过程，在三个步骤中温度最低的是 4.(2023·河北唐山期末)人参皂苷F,作为一种稀有人参皂苷，很难直接从天然人参植物中提 取。已知在人参属植物三七中具有与人参皂苷F,合成相关的PnDDS、CYP12H、CYP6H和 UGTP20四个关键基因，本研究通过在烟草中表达这四个基因，首次获得能够产生人参皂苷 F,的转基因烟草株系和细胞系，研究过程如图1所示。请回答下列问题： 提取三七① 三七总cDNA 总RNA ② 与合成人参皂苷F相关 的PnDDS、CYPI2H、 潮霉素启动子 CYP6H和UGTPn20四 农杆菌 抗性基因 个关键基因 i质粒 T-DNA 终止子 Ti质粒 启动子 检测、 基因表 导入根搞侵染烟草愈筛选能令成人 伤组织 ,参皂苷F 达载体 农杆菌 细胞 的烟草愈 卡那霉素 标记基因 终止子 伤组织细胞 抗性基因 图1 图2 (1)①过程需要 的催化，步骤②中利用PCR技术扩增目的基因时，设计引物序列 的主要依据是 。 PCR反应完成后，常采用 技术 来鉴定PCR的产物。 (2)在构建基因表达载体时，通常用双酶切的好处是 (答出两点即可)。 (3)该实验所用的农杆菌Ti质粒如图2所示，据图可知应在添加 的培养基中筛 选导人目的基因的烟草愈伤组织细胞 (4)图1过程涉及的生物工程包括植物基因工程和植物细胞工程，后者利用了 的原理。 进阶突破·专项练09