热点题型4 PCR技术-【学霸黑白题】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（浙科版）

热点 强化 热点题型4PCR技术 1.(2023·山东烟台期中)RT-PCR是将mRNA 引物A:5' CGACT GATTA 31 逆转录获得cDNA的方法和cDNA聚合酶链式 (引物B:5' 3 AACTG CAGTT 反应相结合的技术。如图为某兴趣小组为该过程设计的相关引物。下列说法错误的是 ( A.PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲溶液中一般要添加Mg+ B.一般情况下，引物A和B的长度越长，C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设 定就越低 C.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色 D.实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而 失效 2.(2023·河南开封期中)为了解转基因烟草对生 100bp M123456789101112131415161718 250bp 态环境的影响，研究人员以TMV-cp烟草品种即 700bp NC89为实验材料，对转基因烟草外源基因 TMW-cp漂移到杂草上的可能性进行了研究。研 注：1为阳性对照，2为空白（阴性）对照，3~7为NC89烟 究人员随机选取了5株NC89烟草，并在NC89 草样品，8~18表示杂草样品。 烟草株系及周边随机选取各种杂草，提取DNA, 根据TMV-cp基因设计引物进行PCR扩增，电泳结果如图。下列相关叙述错误的是() A.设置空白对照是为排除实验操作等对结果的影响 B.电泳结果表明TMV-cp基因在NC89烟草细胞内稳定存在 C.电泳结果表明烟草中TMV-cp基因未漂移至周边杂草 D.将TMV-cp基因转入其他植物时不需要经过安全性评价 3.加端PCR是使扩增产物的末端加上一段DNA序列的PCR。加端PCR的引物被设计成除与 模板配对的那一部分以外再加上若干碱基，以便能使扩增产物的末端加上额外的一段DNA。 hIGF-1cDNA编码成熟蛋白的序列两端无起始密码子和终止密码子的对应位置，也没有合适 的限制酶切割位点。实验人员为了在枯草杆菌中 引物3引物4 表达hICF-1基因，应用加端PCR技术对hIGF-13' 51 cDNA进行改造，以期获得含有hIGF-1成熟蛋白 引物1引物2 79个氨基酸编码序列，并在两端分别带有PstI和SalI酶切位点的DNA片段。加端PCR技 术示意图如图所示，回答下列问题： (1)进行加端PCR时应选用的引物是 (2)在目的基因的两端添加限制酶切割位点的目的是 将改造后的 06黑白题生物|选择性必修三ZK hIGF-1基因导入枯草杆菌的常用方法是用Ca2+处理枯草杆菌，其目的是 ;原核生物作为基因工程的受体细胞的优点有 (答出3点即可)。 (3)限制酶PstI的识别序列及切割位点为5'-CTGCA'G-3',请根据该序列写出经PstI切割 后产生的黏性末端 (4)在构建基因表达载体时，使用PstI和SalI酶两种限制酶切割hIGF-1基因和质粒，而不 是只选择一种限制酶切割hIGF-1基因和质粒，这样做的优点是 (答出2点即可)。 4.(2023·江苏常州期中)某种病毒可通过其S蛋白和RBD蛋白与人体细胞表面的受体结合而 进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。图1是科研人员利用该病毒S蛋白基因和RBD蛋 白基因，研制该病毒双抗原疫苗的技术路线。 相关限制酶识别序列及切点： BglⅡ：5'-AGATCT-3 Xba I:5'-TCTAGA-3' S基因 RBD基因 HindΠ：5'-AAGCTT-3 Nde I:5'-CATATG-3' 引物1 融合 PCR 扩增 BamH I:5'-G℃ATCC-3' EcoR I:5'-GAATTC-3' S-RBD基因 引物2 荧光蛋 过程重组pX Baill 白基因 一工程菌一筛选 B系列质粒 1?3 pX质粒 Xba I 菌落、 培养基B 4 启动子 HindΠ 123 青霉素抗性基因 终止子 4 123 四环素抗性基因 培养基A 456 培养基A BamH I Nde I 图1 图2 (1)PCR扩增时，微量离心管中需加入的物质有：模板、特异性引物、原料 PCR过程需要特异性引物的原因是 ,PCR的最后一个循环 结束后通常还需要在72℃维持7min左右，其目的是 (2)为使S-RBD基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，再合成RBD 蛋白，则PCR过程中，应在引物1的5'端添加的限制酶序列是 在引物2 的5'端添加的限制酶序列是 (3)过程B需要的工具酶有 基因表达载体中，复制原点中A-T的 比例较高，有利于 0 (4)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常可先后用两种抗生素进行原位影印培养（使用 无菌的线毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如 图2)。培养基A中应添加 ,培养基B中应添加 含有重组质粒的 菌落是 (填写数字)，根据图中信息，鉴定pX质粒和重组pX质粒是否导人工程 菌在细菌群体水平上还可以通过观察 进阶突破·专项练07液0.1L,使每个孔内不多于一个细胞.达到单克隆培养的目的。 (4)因为小鼠形成的抗体对人体来说是抗原，存在着排异反应，故上 述过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体。(5)由于调控细胞 无限增殖的πG基因位于细胞质中，因此若要采用细胞核移植获得 单克隆抗体，只能将浆细胞的细胞核移入到含有pG基因的细胞质 中，获得重组细胞，最终获得单克隆抗体。 3.(1)定期更换培养液加强免疫，刺激小鼠机体产生更多的B淋巴细 胞聚乙二醇(PEG)(2)乙和丙能产生特异性强、灵敏度高的 抗cTl抗体的杂交瘤细胞(3)不同部位酶标抗体与待测抗原结 合，酶催化特定底物反应 解析：(1)在动物细胞培养的过程中，为防止有害代谢物的积累，需要 定期更换培养液：为了提高淋巴细胞的免疫能力，刺激小鼠机体形成 更多能产生抗cTl抗体的B淋巴细胞，一般通过多次注射相同抗原 的方法实现；取脾脏部分组织制成细胞悬液与骨髓瘤细胞诱导融合， 一般采用的化学诱导剂为聚乙二醇(PEG)。(2)据题图1可知，杂交 瘤细胞需要对甲进行筛选，因此乙和丙应该是筛选得到的杂交瘤细 胞；其中①代表用特定的选择培养基进行筛选，②过程表示将乙细胞 接种到多孔培养板上，进行克隆化培养和抗体阳性检测，之后稀释 培养、再检测，并多次重复上述操作，就能获得足够数量的能分泌 抗cTl抗体的细胞，该类细胞的特点是既能大量增殖又能产生特异 性强、灵敏度高的抗cTl抗体。(3)分析题图2中过程可知，两种抗 体与检测的抗原均能结合，但结合部位是不同的：该检测方法中，酶 标抗体与待测抗原结合，酶催化特定底物反应产生检测产物，可通过 测定产物量来判断待测抗原量。 4.(1)CD47蛋白（或CD47或胰蛋白或胶原蛋白）（答出1个即可） (2)选择既能大量增殖，又能产生专一（或特异性）抗体(3)抗原 与抗体特异性结合筛选出能产生抗CD47抗体（或所需抗体）的杂 交瘤细胞(4)不加单克隆抗体的巨噬细胞与肿瘤细胞共同培养体 系高于 解析：(1)为获得抗CD47的单克隆抗体，实验前应给模型小鼠注射 CD47蛋白，以刺激机体产生相应的B淋巴细胞。题图1中制备B淋 巴细胞悬液时可采用机械方法或用相应蛋白酶处理。(2)题图1中 筛选1是将融合细胞放在选择培养基上培养，将既能大量增殖、又能 产生抗体的杂交瘤细胞筛选出来。(3)题图2表示筛选2过程，取 定稀释倍数的杂交瘤细胞悬液加入多孔玻璃板中，适宜条件下培养， 然后利用抗原与抗体特异性结合的原理进行抗体检测。检测阳性反 应孔中的细胞还需多次稀释培养并检测，最终将能产生抗CD47抗 体的杂交瘤细胞筛选出来。(4)为研究抗CD47的单克隆抗体的功 能，实验组为单克隆抗体加入巨噬细胞与肿瘤细胞的共同培养体系， 根据单一变量原则，应设置不加单克隆抗体的巨噬细胞和肿瘤细胞 的共培养体系作为对照组。若实验组中被吞噬的肿瘤细胞所占的比 例高于对照组，则可证明上述推测正确。 热点题型4PCR技术 1.B解析：PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲 溶液中一般要添加Mg2+,Mg2+能激活DNA聚合酶，A正确：一般情况 下，引物A和B的长度越长，C和G比例越高，则PCR循环步骤中的 复性温度设定就越高，B错误：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳 来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色，然后可在紫外灯下检 测出来，C正确：实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引 物B自身出现了局部碱基互补配对而失效，导致子链无法延伸， D正确。故选B。 2.D解析：为了排除实验操作等对结果的影响，需要设置空白对照， A正确：TMV-cp基因在NC89烟草细胞内稳定存在，所以能够在转基 因烟草中提取到TMⅣ-c印基因，电泳会出现相应的条带，B正确：8~ 18表示杂草样品，均没有出现TMW-cp基因条带，说明烟草中 TMW-ep基因没有漂移至周边杂草，C正确：将TMW-cp基因转入其他 植物时仍需要经过安全性评价，D错误。故选D。 3.(1)引物1和引物4(2)使目的基因经限制酶切割后能产生黏性末 端，以便和质粒相连使枯草杆菌处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态原核生物多为单细胞生物：细胞繁殖速度 选择性必修三·ZK舞 快：遗传物质相对较少：易培养：代谢速度快 5'-CTGCA (3) (4)可防止目的基因和质粒反向连接，防止目的基 3-G 因、质粒自身环化 解析：(1)加端PCR所选引物应有一部分序列不与模板链配对，结合 题图可知引物1和引物4是加端PCR所用引物。(2)在目的基因的 两端添加限制酶切割位点后，可使用相应的限制酶分别切割目的基 因和质粒，使二者产生相同的黏性末端，以便连接形成重组质粒。先 用C+处理枯草杆菌，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分 子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导人其中。原核生物 多为单细胞生物，其繁殖速度快，遗传物质相对较少，易培养，代谢速 度快，因此常用原核生物作为基因工程的受体细胞。(3)限制酶 PI的识别序列及切割位点为5'-CTGCA'G-3',该酶切割后产生的 黏性末端如答案所示。(4)在h1GF-1基因的两端加人不同的限制酶 切割位点后，再利用相应的限制酶切割，一般会产生不同的黏性末 端，在利用DNA连接酶连接时，可防止目的基因和质粒反向连接，防 止目的基因、质粒自身环化。 (1)缓冲液耐高温的Tag DNA聚合酶 一方面引物能与目的基因 中特定的核苷酸序列发生碱基互补配对，另一方面引物能使DNA聚 合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸使子链充分延伸（或获得 更多的完整目的片段)(2)5'-AAGCTT-3'5'-CATATG-3' (3)限制酶HindⅢ、限制酶NdeI以及DNA连接酶解旋过程，促进 复制过程(4)青霉素四环素5和6菌落是否具有荧光，有荧 光的则含有pX质粒 解析：(1)PCR全称为聚合酶链式反应，是在DNA聚合酶作用下，在 体外进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术，利用的原理是DNA 复制。微量离心管中需加入的物质有：模板、特异性引物、原料、缓冲 液和耐高温的Tag DNA聚合酶。PCR过程需要特异性引物的原因 是一方面引物能与日的基因中特定的核苷酸序列发生碱基互补配 对，另一方面引物能使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷 酸，PCR的最后一个循环结束后通常还需要在72℃维持7min左右， 这样可以使子链充分延伸（或获得更多的完整目的片段）。(2)为 使S-RBD基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S 蛋白，再合成RBD蛋白，则需要让S基因与启动子靠近，则PCR过程 中，应在引物1的5'端添加限制酶HimdⅢ的序列5'-AAGCTT-3',在 引物2的5'端添加限制酶NdeI的序列5'-CATATG-3'。(3)过程B 为目的基因表达载体的构建，需要的工具酶有限制酶HindⅢ、限制 酶NdI以及DNA连接酶，基因表达载体中，复制原点中A-T的比例 较高，有利于解旋过程，促进复制过程的实现，这是因为A-T之间有 两个氢键，而G-C之间有三个氢键。(4)为筛选出含有目的基因的 大肠杆菌，通常可先后用两种抗生素进行原位影印培养（使用无菌的 线毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B 上)。培养基A中应添加青霉素，培养基B中应添加四环素，能在前 者中生长的大肠杆菌可能是导入了重组质粒和普通质粒的大肠杆 菌，而在构建基因表达载体时，由于四环素抗性基因被破坏，因而含 有重组质粒的大肠杆菌不具有对四环素的抗性，因此，题图2中含有 重组质粒的菌落是5和6，根据题图中信息，鉴定pX质粒和重组pX 质粒是否导入工程菌，在细菌群体水平上还可以通过观察菌落是否 具有荧光，有荧光的则含有pX质粒，这是因为在构建重组质粒的过 程中荧光蛋白基因受到了破坏。 热点题型5基因工程的操作程序 C解析：基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，不是通过PC 扩增获取目的基因，A错误；由于载体E只有产生黏性末端的酶切位 点，要使中间载体P接入载体E,同时防止载体E自身环化，需要用 两种限制酶分别切割载体E和中间载体P,据题图可知，中间载体P 和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI 酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoR V识别位点 并且其切割后为平末端，可以用于连接日的基因，SmaI酶虽然也能 切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoI和PstI酶识别位 白题38