2026届高三生物二轮复习课件知识点30 基因工程

知识点30 基因工程 贺老师 专题九 生物技术与工程 1 基因工程 蛋白质工程 结果 改造蛋白质 制造新蛋白质 操作对象： 工具 T4DNA连接酶 限制酶 结果 DNA连接酶 载体： E.coliDNA连接酶 平末端 黏性末端 如质粒、病毒等 （核心） 操作程序 植物：花粉管通道法、农杆菌转化法 动物：显微注射法 微生物：Ca2+处理法 常用方法： PCR扩增、人工合成、基因文库 分子水平检测： PCR扩增技术、分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术 个体水平检测：接种实验 ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测与鉴定 核心知识梳理 基因 抗原 — 抗体杂交的本质：蛋白质与抗体特异性结合 DNA 是核酸，不是蛋白质，没有抗原抗体特异性识别的基础 2 考点1 限制酶的选择技巧 1.不破坏 原则； 2.不破坏 、 、 、 原则； 3.限制酶切割位点位于 和 。 目的基因 启动子 终止子 标记基因 复制原点 启动子下游 终止子上游 1.农杆菌转化法中，酶切点应该位于Ti质粒的 ； 2.双酶切 ---为了避免目的基因自身环化，载体的自身环化，以及目的基因和载体的反向连接； T-DNA内部 常规规律 情境中的规律 (2023·山东，25 节选) (1)如图构建重组质粒后，为了确定 J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行 ，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________________________。 F1和R2(或F2和R1) 考点2 单酶切法中正向连接与反向连接的判断方法 方法一：利用PCR和电泳进行检测 引物选择原则： 1条引物以载体为模板，另1条引物以目的基因为模板 PCR 检测 若电泳后 ，则说明J 基因连接到质粒中且插入方向正确； 若电泳后 ，则说明J 基因未连接到质粒或反接。 有扩增产物 无扩增产物 4 方法： 考点2 单酶切法中正向连接与反向连接的判断方法 方法二：利用限制酶和电泳进行检测 限制酶选择原则： 挑选目的基因内部的一个酶切位点（避免选择正中间位置，可偏向一侧）及载体插入片段一侧的酶切位点。 应选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析 载体自连 正接 反接 结果如图2所示。图中第________泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。 5 考点3 引物的设计与应用 2、作用： 引物能使 从引物的 端开始连接 。 3、结合部位： 引物结合在_____________端 1、概念： 模板链的3’ 是一小段能与 的一段碱基序列互补配对的 。 3’ 4、设计引物： 需以目的基因的 为依据 5.为 ，需要在两种引物的 端添加不同限制酶的识别序列。 DNA母链 短单链核酸 DNA聚合酶 两端核苷酸序列 脱氧核苷酸 使 PCR扩增的目的基因能与运载体正确连接 5’ 5'→3'聚合活性：DNA聚合酶只能沿模板链的3'→5'方向移动，将脱氧核苷酸（dNTP）添加到新生链的3'-OH末端，形成磷酸二酯键，合成方向为5'→3'。 依赖模板和引物：必须以单链DNA为模板，并需要一段短RNA或DNA引物（3'-OH末端）提供起始点，无法从头合成DNA。 校对功能（3'→5'外切酶活性）：多数DNA聚合酶（如原核的DNA聚合酶III、真核的DNA聚合酶δ/ε）具有3'→5'外切酶活性，可切除错配的核苷酸，确保复制高保真性（错误率低至约10⁻⁹）。 6 考点3 引物的设计与应用 扩增X蛋白基因所需的引物序列是__________________；_________________。 5′-ATGCCG-3′ 5′-TGATCT-3′ 例1.如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：（写出引物前6位碱基序列） 第一步：确定引物的位置： 引物与模板链的3‘端反向结合 第二步：书写引物序列： 通过碱基互补配对原则进行书写 【快速书写策略，“照抄”非模板链序列】 5′ 3′ 3′ 5′ 1 引物序列的书写 5′ 3′ 3′ 5′ 规律一：引物与目的基因5’端的一段核酸序列相同 快速书写策略，“照抄”非模板链序列（要求写几个碱基就写几个，没有要求的就把“暴露出来”的都写了） 有时需要在引物5’端添加限制酶识别序列 7 考点3 引物的设计与应用 2 启动子位置及转录模板链的判断 大本p118 基于图1中的信息能否判断启动子位置及转录模板链？ 答案是否定的，若要对转录情况做出准确判断，必须明确以下三个要素： (1)链方向。 (2)链性质(编码链或模板链)。 (3)功能区域(启动子或终止子)。 确定其中2个要素即可确定第3个要素。 链 链 例2.(2023·山东，25 节选) 已知 J基因转录的模板链位于 b 链，由此可知引物 F1 与图甲中J基因的________(填“a 链”或“b 链”)相应部分的序列相同。 a链   根据启动子方向判断转录方向 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 与b链互补 编码链（coding strand） 得名的核心原因是：它的碱基序列与转录生成的 mRNA 几乎完全一致（仅 T→U 替换），直接对应蛋白质的氨基酸密码子，是基因编码信息的直观体现。 关注学生有思维定式，认为F1与al链互补。规律一：引物与目的基因5’端的一段核酸序列相同 快速书写策略，“照抄”非模板链序列（要求写几个碱基就写几个，没有要求的就把“暴露出来”的都写了） 有时需要在引物5’端添加限制酶识别序列 8 考点4 基因编辑技术 短链RNA (sgRNA、向导RNA) Cas9蛋白 CRISPR/Cas系统是细菌和古菌在长期演化过程中形成的一种 ，用来抵抗外源遗传物质的入侵，为它们提供获得性免疫。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们 ，沉默外源基因的表达。 2.CRISPR/Cas9组分及功能： 1.问题的提出： 作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合 与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂 1 CRISPR/Cas系统 细胞自身存在的DNA损伤修复的应答机制可使双链DNA断裂的上下游两端的序列连接起来 3.DNA的修复： 免疫系统 切断 基因组编辑的含义：对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。 9 (1)基因敲除 (2)定点转基因 4.CRISPR/Cas9技术的主要应用 5.CRISPR/Cas9技术的风险 (1)基因组编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。 (2)对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德。 考点4 基因编辑技术 10 1.CRISPR/Cas9 是大肠杆菌等细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的部分病毒(DNA)及外源DNA。其原理是由一条单链向导RNA引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。CRISPR/Cas9 基因编辑技术是通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可以对目标DNA 上几乎任何一个位置进行删除或添加特定的DNA 片段，如下图所示。下列叙述错误的是( ) A.识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同 B.在被切割后的目标DNA中添加特定的DNA片段需要DNA连接酶 C.大肠杆菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒(DNA)及外源DNA互补的RNA序列 D.Cas9能专一性破坏双链DNA分子中碱基之间的氢键来切割DNA 分子 典题感悟 磷酸二酯键 D 识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同，都是、、、，A正确； 在被切割后的目标 中添加特定的片段需要连接酶将 片段连接起来，B正确； 大肠杆菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒及外源互补的 序列，C正确； 能特异性的切断目标 的磷酸二酯键，D错误。 11 2.我国科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了水稻香味抑制基因Badh2，获得了有香味的水稻，机理如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．sgRNA的识别序列过短可能会导致编辑对象出错 B．Cas9蛋白功能类似于限制酶，可以识别并剪切特 定DNA片段 C．在培养基中加入潮霉素，可用于筛选导入基因敲除 载体的植物细胞 D．构建好的基因敲除载体可用农杆菌转化法导入水稻 细胞 Cas9蛋白可以剪切特定DNA片段，sgRNA能识别靶基因的特定序列 B 典题感悟 12 考点4 基因编辑技术 2 Cre-LoxP重组酶系统 Cre-LoxP系统是一种由Cre重组酶和LoxP位点组成的位点特异性重组的基因编辑技术。 LoxP序列（34bp） Cre酶 结构为 13 bp 反向重复 + 8 bp 核心间隔 + 13 bp 反向重复 作用：反向重复区是 Cre 结合位点； 8 bp 间隔区决定 loxP 方向，直接影响重组。 来源于P1噬菌体，特异性识别 loxP，催化DNA链切割与重连。 5’-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT- -ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3’ 3’-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA- -TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5’ 待敲基因 LoxP序列 LoxP序列 Cre酶结合位点 Cre酶结合位点 决定 loxP 方向 Cre酶结合位点 Cre酶结合位点 决定 loxP 方向 经典序列： 13 2 Cre-LoxP重组酶系统 5’-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT- -ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3’ 3’-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA- -TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5’ 待敲基因 LoxP序列 LoxP序列 Cre 结合位点 Cre 结合位点 决定 loxP 方向 Cre 结合位点 Cre 结合位点 决定 loxP 方向 条件1：同一条 DNA 链、两个 loxP 同向： 过程： 考点4 基因编辑技术 结果： Cre 切割 → 环化切除中间片段 → 连接剩余 DNA，仅留一个 loxP。 基因删除（最常用） 14 2 Cre-LoxP重组酶系统 5’-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT- -ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3’ 3’-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA- -TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5’ 中间基因 LoxP序列 LoxP序列 Cre 结合位点 Cre 结合位点 决定 loxP 方向 Cre 结合位点 Cre 结合位点 决定 loxP 方向 条件2：同一条 DNA 链、两个 loxP 反向： 过程： 结果： 条件3：loxP 位于不同 DNA 链 / 染色体。 Cre 切割 → 目的基因反接（倒位） 将两个位点之间的DNA片段进行180°的翻转（倒位） 片段交换或染色体易位，用于染色体重排研究。 结果： 高效性：Cre重组酶与具有LoxP位点的DNA片段形成复合物之后，可以提供足够的能力引发之后的DNA重组过程，重组过程简约高效。 特异性强：LoxP位点是一段含回文序列结构和中间有间隔的34bp元件，这种结构保证了LoxP序列的唯一性，从而保证基因重组的特异性很强。 应用范围广：Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用。 Ⅱ型启动子启动表达：Cre重组酶的编码基因可由任何一种Ⅱ型启动子驱动，由此保证Cre重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的胜利条件下表达，从而实现较高的组织和细胞特异性。Ⅱ型启动子可分为组成型启动子、特异性启动子、诱导启动子，其特点是转录产物长度不限，编码与否不限等特点。 但也有缺点，一是操作复杂‌，需要精确控制Cre重组酶的表达时间和空间，操作较为复杂；二是对细胞毒有性‌，长期表达Cre重组酶可能对细胞有毒性影响。 15 典题感悟 1．Cre酶是一种重组酶，LoxP 是能被 Cre酶识别的特异DNA 序列。Cre/LoxP重组酶系统能够实现特异位点的基因敲除、基因插入等操作。一般而言，当一条 DNA 链上存在两个相同的 LoxP 序列且方向相同时，Cre酶能有效切除两个位点间的 DNA 序列，如图所示。下列说法正确的是（　　） A．Cre酶能将两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键断开 B．启动子能启动绿色荧光基因翻译荧光蛋白的过程 C．当有两个相同的 LoxP 序列时 Cre酶就能有效切除一个 D．无 Cre酶存在的细胞因 STOP 的作用而无法发出荧光 D 脱氧核糖核苷酸 需满足两个 LoxP 序列方向相同 转录 16 2.Cre-Loxp系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre酶能根据两个Loxp的方向删除或倒置位于两个Loxp序列间的基因，如图1所示。现使用Cre-Loxp系统构建TK基因缺失的病毒毒株，为研发该病毒的疫苗提供候选毒株，构建过程如图2所示，下列分析错误的是（    ） 要通过Cre酶删除RFP基因，根据图1可知，RFP基因两端的Loxp序列方向应该相同 B 典题感悟 A．图1中Gene两端需含有两个相同的碱基序列 B．位于RFP基因两端的Loxp序列方向相反 C．Cre酶处理之前，应初步筛选出有红色荧光基因的病毒 D．Cre酶在图2过程中的具有限制酶和DNA连接酶的功能 17 3.（2024·浙江杭州二模）Cre-loxP是一种常用的基因改造工具，Cre基因的表达产物是Cre酶，loxP是一段DNA序列。当Cre酶遇到两段loxP序列时，能将两段loxP序列中间的序列删除。甲为Cre基因的杂合个体（全身各细胞均表达Cre基因），乙是含外源基因D的纯合个体（D基因两端带有loxP序列），两种基因在染色体上的分布如图所示。现将甲和乙杂交，得到的F1自由交配，则F2中含D基因的个体的比例为（　 　） A.1/4      B.3/8 C.5/16      D.9/32       典题感悟 设不含Cre基因的染色体用O表示，不含外源基因D的染色体上的基因用d表示，由图可知甲和乙的基因型分别为Ccdd和ccDD，两者F1基因型为1/2Ccdd（乙的D基因两端带有loxP序列，且当Cre酶遇到两段loxP序列时，能将两段loxP序列中间的序列删除，因此子一代基因型为CODd的个体中D基因被删除,由CcDd→Ccdd）和1/2ccDd，F1自由交配，能得到D基因的组合为1/2Ccdd×1/2ccDd=1/2×1/2×1/2×1/2×2=1/8（ccDd） 1/2ccDd×1/2ccDd自交后代含D为1/2×1/2×3/4=3/16 C 由题意可知，F产生的配子及比例为Cred:Od:OD=1:2:1，自由交配得到F2中含D基因的个体有1/16 CreODd(D基因会被删除),4/1600Dd,1/1600DD，故F，中含D基因的个体的比例为5/16,C正确。 18 1.全称： ； 2.原理： ； 3.条件： ①缓冲液：含有 ，目的是 ； ②模板：DNA双链； ③原料：4种 ，既作为 ，又可以 ； ④酶： 的 酶； ⑤引物： 种，使DNA聚合酶能从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 Mg2+ 激活DNA聚合酶 脱氧核苷酸（dNTP) 原料 耐高温 DNA聚合 2 3’ PCR基础知识回顾 4.过程： 变性（高温）：DNA解旋为单链 复性（降温）：引物与单链DNA结合 延伸：耐高温的DNA聚合酶从引物3’进行子链的合成 供能 19 引物A 引物B 引物C 引物D PCR1 PCR2 PCR3 PCR4 图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，不选划“×”） √ √ × × × × √ √ × × × × √ × × √ 考点5 PCR及PCR定点诱变技术 1 重叠延伸PCR——获得定点突变基因 无法延伸 可延伸 重叠PCR是采用具有 的引物,使PCR产物形成了 ，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的 ，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，主要应用于基因的 与 。 互补末端 重叠链 定点突变 基因拼接 延伸 问题：如何利用PCR技术实现基因内部的定点突变？ 20 PCR1 PCR2 链Ａ 链Ｂ PCR3 基因Ａ 基因Ｂ Ａ－Ｂ融合基因 互补 PCR4 3’- -5’ -3’ 5’- P1 5’- P2 -5’ P3 5’- P4 -5’ PCR1和PCR2分开进行 链A和链B部分互补配对 PCR3不需要引物 PCR4(用P1和P4 扩增融合基因) 考点5 PCR及PCR定点诱变技术 1 重叠延伸PCR——获得融合变基因 问题：如何利用PCR技术将两个来源不同的DNA连接起来？ 高温变性 5’- -3’ -5’ 3’- 问题：如何将两个不相关的DNA连接起来？ 21 重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述错误的是(　　) A．引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高 B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此两者置于不同反应系统中 C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后，共产生4种双链DNA分子 D．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制 C 典题感悟 2种 22 考点5 PCR及PCR定点诱变技术 2 大引物PCR——获得定点突变基因 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段； 第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 问题：如何只用一条突变引物就能引入突变？ 大引物 如果我想简化操作，只用一条突变引物就能引入突变，有没有其他方法？ 23 考点5 PCR及PCR定点诱变技术 3 利用环状质粒PCR引入突变位点——在目的基因一端或内部引入突变位点 p113 (1)在两个引物中引入突变位点 (2)在一个引物中引入突变位点 ①内外圈DNA单链的脱氧核苷酸数量相同 ②结果：环状质粒→线性质粒（PCR体系中无DNA连接酶） 24 考点5 PCR及PCR定点诱变技术 4 反向PCR——扩增已知序列两侧的位置序列 问题：当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，如何解决？ 扩增未知序列 3.最后得到的DNA和原来的环状DNA等长吗？ 如果不等长，有什么差异？ 反向 PCR得到的为线性 DNA 片段 产物为未知序列+引物 1.为什么用相同的限制酶对未知序列进行切割？ 使未知序列的两端产生相同的粘性末端，进而连接成为环状DNA分子 2.如何设计引物来扩增未知序列？ 设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。 ①用限制酶切割该DNA ②随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。 ③以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。 最后得到的DNA和原来的环状DNA等长吗？如果不等长，有什么差异？ 25 考点5 PCR及PCR定点诱变技术 4 反向PCR——扩增已知序列两侧的位置序列 26 4 反向PCR——扩增已知序列两侧的位置序列 （2020·江苏卷，大本p115）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是_______ 引物 ①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′ ④② 5′ 3′ 3′ 5′ 27 ①该技术用到的酶有哪些？ ②若扩增两侧的未知序列，需要选用引物_______,且_____（能/不能）互补配对。 ③最终得到的PCR产物？ 包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子。 DNA连接酶、限制酶、Taq酶。 3、4 不能 28 利用图中的引物___________组合可扩增出两侧的未知序列。 ①④ 4 反向PCR——扩增已知序列两侧的位置序列 29 考点5 PCR及PCR定点诱变技术 5 实时荧光定量PCR——检测病毒核酸 ①当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号； ②当PCR扩增时(在延伸阶段)，探针会被Taq酶的5′→3′外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子。 ③结果： 越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。 PCR产物 病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。 30 (2)某新冠病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图中所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为________。 考点5 PCR及PCR定点诱变技术 5 实时荧光定量PCR——检测病毒核酸 (1)Ct 值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct 值就________。 越小　 阳性　 (3)阴性结果也不能排除新冠病毒感染。可能产生假阴性的因素有_______。 a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值 b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 c．病毒发生变异 abc　 31 6 巢式PCR技术 问题：如何提高PCR的特异性？ ①极高的扩增特异性 🎯 • 两轮引物均与目标序列互补，只有同时匹配两轮引物的模板才会被成功扩增。 • 大幅降低非特异性扩增（如引物二聚体、错配序列）的概率，避免假阳性结果。 • 特别适合复杂模板（如基因组 DNA、cDNA 文库）中目的片段的精准扩增。 ② 超高的检测灵敏度 🔍 • 第一轮扩增先富集目标序列，为第二轮提供充足模板，可检测到极低拷贝数的模板（如单拷贝基因、微量临床样本）。 • 能有效放大微弱信号，解决常规 PCR 因模板量不足导致的扩增失败问题。 优点：提高特异性： 第一轮PCR使用一对外引物进行扩增，这些引物与模板DNA进行非特异性配对，可能导致非特异性产物的产生。 第二轮PCR使用一对内引物（巢式引物），这些引物位于第一轮PCR产物的内部，只能与正确扩增的产物结合，从而大大降低了非特异性扩增的可能性。 增强灵敏度： 第二轮PCR的扩增产物通常较短，这意味着它可以从低拷贝的起始DNA样本中扩增出更多的产物，从而克服了单次PCR扩增的灵敏度限制。通过两轮PCR，可以从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物，这对于从低浓度的DNA样本中检测目标基因非常重要。 提高特异性： 第一轮PCR使用一对外引物进行扩增，这些引物与模板DNA进行非特异性配对，可能导致非特异性产物的产生。 第二轮PCR使用一对内引物（巢式引物），这些引物位于第一轮PCR产物的内部，只能与正确扩增的产物结合，从而大大降低了非特异性扩增的可能性。 增强灵敏度： 第二轮PCR的扩增产物通常较短，这意味着它可以从低拷贝的起始DNA样本中扩增出更多的产物，从而克服了单次PCR扩增的灵敏度限制。通过两轮PCR，可以从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物，这对于从低浓度的DNA样本中检测目标基因非常重要 利用两套引物进行两轮PCR扩增。 首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15~30次循环), 第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板,利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部,经过15~30次循环,获得第二轮扩增片段(即目的基因), 最终第二轮扩增片段短于第一轮,基本过程如图所示: 32 考点6 基因测序 1 第一代基因测序技术——双脱氧链终止法（桑格测序法） （1）ddNTP(双脱氧三磷酸核苷酸) ddNTP缺少3’-OH，不能与另外的dNTP连接形成磷酸二酯键， 因此，双脱氧核苷酸可使DNA子链延伸终止。（即ddNTP 的碱基可代替dNTP与模板链上的碱基互补配对，但该位点之后不能延伸子链） 33 1 第一代基因测序技术——双脱氧链终止法（桑格测序法） (2)双脱氧法原理示意图： 分4组PCR，都含有4种dNTP，每组一种ddNTP，即每组4+1原料 得到特定碱基为末端的片段 电泳分析，或电泳后检测荧光图谱 34 思考： （1）读图：写出待测模板序列：_______________________________________ （2）电泳结果共出现了10条长短不同的条带，但被测模板实际碱基数要超过10个。（ ） 读取子链：5’TACTACGCTA 3’ 推出模板：3’ATGATGCGAT 5’ √ 因为子链延伸时还需引物。 1 第一代基因测序技术——双脱氧链终止法（桑格测序法） 35 典题感悟 （2025 广东卷）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的(　　) A．1′-碱基 B．2′-氢 C．3′-羟基 D．5′-磷酸基团 DNA聚合酶催化游离脱氧核苷酸加到已有的DNA片段3′端的羟基上，形成磷酸二酯键，如果保护底物中脱氧核糖结构上的3′-羟基，使其无法参与反应，那么DNA聚合酶就不能继续催化下一个脱氧核苷酸的加入，DNA链也就不再继续延伸，C符合题意。 C (不定项)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在 PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷 三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP 或 ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则， 以加入 ddATP 的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延 伸；PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下 列叙述正确的是( ) A．上述 PCR 反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基 C 突变为 G AC 典题感悟 37 38 $