1.2.2 微生物的选择培养和计数-2025-2026学年高二生物优质备课课件（人教版选择性必修3）

复习回顾： 1.培养乳酸杆菌需要添加 ；培养霉菌时需将PH调至 ，培养细菌时将PH调至 ； 2.巴氏消毒法优点 3.平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的湿度也比较高，所以将培养皿倒置，为什么？ 4. 维生素 酸性 中性或弱碱性 可以杀死绝大多数的微生物，不破坏营养成分 防止皿盖上的水珠落入培养基，同时避免培养基的水分过快的挥发。 灼烧时期 目的 取菌种前 杀死接种环上 。 每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源 于 ，从而使 ， 直至得到 。 接种结束后 原有的微生物 上次划线的末端 每次划线时菌种数目逐渐减少 单个细胞 杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者 预习自测 (1)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基(　　) (2)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源(　　) (3)用血细胞计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数(　　) (4)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同(　　) (5)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数 (　　) (6)菌落特征是鉴别菌种的重要依据(　　) √ √ × × × × NH3 细菌计数板 两个或多个菌落连在一起时，只能记为一个菌落，因此统计的菌落数小于活菌实际数目 情境导入 提供合适的营养和环境条件 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。 美国黄石公园 那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？ 筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 实验室筛选微生物原理：人为提供_______________的条件 （包括_____、_____和_____等），同时_______________________ 有利于目的菌生长 抑制或阻止其他微生物的生长 营养 温度 pH 第1章 发酵工程 第2节 微生物的选择培养和计数 学习目标： 1.阐明微生物选择培养的原理。 2.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 5 ①加入青霉素的培养基 探究一.选择培养基 在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 1. 选择培养基： 完全培养基 长出各种各样的细菌 分离酵母菌、霉菌等真菌 分离固氮菌 分离自养型微生物 ④加高浓度食盐 金黄色葡萄球菌 ⑤石油作为唯一碳源 能消除石油污染的微生物 ③不加含碳有机物的无碳培养基 ②不加氮源的无氮培养基 探究一.选择培养基 探究任务一：请同学们自主学习教材P16页，小组合作完成思考讨论。 土壤中的细菌将尿素［CO(NH2)2］分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收 。 细菌利用尿素的原因 因为他们能合成脲酶。 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 NO3-、NH4＋ 被植物吸收 设计一种选择培养基，以尿素作为唯一氮源 1.将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 P18探究实践：能分解尿素的细菌都是异养型微生物，不能利用CO2 来合成有机物，可用葡萄糖等有机物作为碳源。 探究二.微生物的选择培养 仅通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 可否直接制备土壤溶液，利用平板划线法接种到选择培养基上，进行培养计数？ 不能。平板划线法最开始的划线细菌可能会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌。 方法: 稀释涂布平板法 探究二.微生物的选择培养 是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 1. 稀释涂布平板法： 2.主要过程: A.梯度稀释菌液 B.涂布平板 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 稀释102倍 稀释103倍 稀释105倍 探究二.微生物的选择培养 3. 操作过程 （1）梯度稀释 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 1×10 90mL无菌水 土壤10g 探究二.微生物的选择培养 （2）涂布平板 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 1ⅹ107 1ⅹ105 1ⅹ106 1ⅹ103 1ⅹ102 1ⅹ104 1mL 1mL 1mL 1mL 9mL无菌水 1mL 待涂布的菌液被吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中培养1-2d。 注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。 探究二.微生物的选择培养 4.稀释涂布平板法和平板划线法的比较 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 效果图 相同点 连续划线 梯度稀释→涂布平板 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 探究三.微生物的数量测定 1. 间接计数 — 稀释涂布平板法 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 统计的菌落往往比活菌的实际数目低； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数； 计数原则: 分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落 探究三.微生物的数量测定 1. 间接计数 — 稀释涂布平板法 M代表稀释倍数； C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 计数公式： 例：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为 个。 1.1×108 （110+108+112）/3 0.1 × 105 = 1.1×108个/克 探究三.微生物的数量测定 2. 直接计数 —显微镜直接计数法（计数板计数法） （1）原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积样品中微生物的数量。 血细胞计数板： 细菌计数板： 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 （2）优点：快速、直观 缺点：①不能区分死菌和活菌→偏大 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 思考: 为了避免上述缺点，我们该如何做？ 可以染色（如使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色）后再进行显微镜计数。 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 探究三.微生物的数量测定 中方格 小方格 大方格 1个计数室的体积为0.1mm3。 1个计数室有400个小方格。 1mL培养液所含菌数＝每小格平均菌数×400×104×稀释倍数 血细胞计数板 探究四.探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 自变量：________________________ 因变量：__________________________ 无关变量：______________________________ 尿素 能分解尿素细菌的生长情况 培养时间、培养基的pH、温度等 2.做出假设 3.实验设计 实验思路 土壤 取样 制备 培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 1.提出问题 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ 利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。 4.进行实验 ①土壤取样 酸碱度接近中性的潮湿土壤。铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。将样品装入事先准备好的信封中。取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 探究四.探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 ②培养基的制备 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用 制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 配方： 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml ①碳源 ②提供能量 氮源 ①提供无机盐； ②调节pH。 凝固剂 探究四.探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 ③样品的稀释与涂布平板 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。 测细菌数：一般用1x104 、1x105 、1x106稀释液 测放线菌：一般用1x103、1x104、1x105稀释液 测真菌数：一般用1x102、1x103、1x104稀释液 思考: 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养； 探究四.探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 ③样品的稀释与涂布平板 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基， 以验证培养基中是否含有杂菌。 ①每个浓度至少设置4个平板 选择培养基（平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。 ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ 为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如：注明组别、培养日期和稀释度。 探究四.探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 ④微生物的培养与观察 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 结果： 一般来说，在相同的培养条件 下，同种微生物表现出稳定的菌落 特征，如形状、大小和颜色等。 探究四.探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 ⑤结果分析与评价 目的 现象 结论 是否有杂菌污染 未被杂菌污染 培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌 选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目 选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目在30~300的平板 重复组的结果 对照组的培养基中无菌落生长 大于 操作成功 若选取同一种土样，统计结果应相近。若差别很大，应从操作是否规范、培养基是否配置合理等方面查找原因 探究四.探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 思考：在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？ 不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。 5.进一步探究 鉴别培养基 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红： ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 探究四.探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 名称 主要用途 主要化学物质 特征性变化 伊红—亚甲蓝 琼脂培养基 鉴别 大肠杆菌 伊红、亚甲蓝 出现金属光泽的深紫色菌落 刚果红培养基 鉴别 纤维素分解菌 刚果红、纤维素 纤维素被分解后出现透明圈 油脂培养基 鉴别产脂肪酶菌株 食用油、吐温、中性红指示剂 由淡红色变成深红色 淀粉培养基 鉴别 产淀粉酶菌株 可溶性淀粉 淀粉被分解后出现淀粉水解圈 H2S试验培养基 鉴别产H2S菌株 醋酸铅 产生黑色沉淀 网络构建 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实验设计 练习与应用 (P20)2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物； 而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法 形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈 （如下图所示）。请回答下列问题。 练习与应用 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 土壤取样 → 富含纤维素的环境 → 以纤维素为唯一碳源，增加目的菌浓度 （选择培养基） → 制备系列稀释液 筛选产生透明圈的菌落 选择培养 涂布平板 → 将样品涂布到含刚果红的培养基上 （鉴别培养基） 梯度稀释 挑选 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3） 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 $