1.2.2 微生物的选择培养和计数（2课时）课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦微生物的选择培养与计数，通过PCR技术需耐高温酶的实例导入，引导学生从环境特点推测微生物特性，构建“环境-功能-选择培养”的学习支架，衔接选择培养基定义、作用及应用等核心知识。 其亮点是以分解尿素细菌的分离实验为主线，融合生命观念（结构与功能观）、科学思维（对照实验设计）和探究实践（完整实验流程）。通过梯度稀释、涂布平板等操作培养科学探究能力，课堂小结与练习强化知识应用，助力学生提升实验技能，为教师提供可直接应用的教学案例。

1.2 微生物的培养技术及应用 1.2.2 微生物的选择培养和计数 一、选择培养基 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 PCR技术是一种常用的DNA扩增技术，此项技术的自动化，需要使用耐高温的DNA聚合酶，如果请你来找这种耐高温的酶，你会去哪里找？ 热泉70-80摄氏度的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而耐热的水生栖热菌脱颖而出。 2 美国黄石国家公园的一个热泉 一、选择培养基 耐寒微生物 石油分解菌 被石油污染的土壤 冰川冻土层 实验室中，人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等) ，同时抑制或阻止其他微生物的生长，从而筛选特定的微生物。 培养基可分离固氮微生物； 培养基中 可培养自养型微生物。 无氮源 不加入有机碳源 一、选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 1. 定义 培养基中加氨苄青霉素 具有抗氨苄青霉素能力的菌落 长出各种各样的细菌 培养基+氨苄青霉素 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 培养基 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？ 【思考·讨论】选择培养基配方的设计 尿素的立体结构 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。 尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。 而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。 CO(NH2)2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 讨论 【思考·讨论】选择培养基配方的设计 配方： 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml 碳源 氮源 ①提供无机盐； ②作为缓冲物质调节pH。 凝固剂 1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基， 判断依据是_________________________________； 该类培养基的主要用途为_____________________； 2.从用途上来讲，培养基二属于______培养基， 目的是为了获得_____________________； 3.两种培养基共有的培养基成分有：________________________； 培养基一的碳源主要为________，主要氮源为________； 培养基二的碳源主要为________，主要氮源为________。 培养基一 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基二 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 固体 添加了凝固剂琼脂 分离、鉴定、计数 选择 能分解尿素的微生物 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 学以致用 二、微生物的选择培养 （一）方法: （二）基本操作: A、梯度稀释菌液 B、涂布平板 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 稀释的原因：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 (2)由于土壤细菌的数量庞大，那么怎么获得要想得到特定微生物的纯培养物呢？ (1)1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 计数：测定分解尿素的细菌的数量 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 稀释涂布平板法 稀释涂布平板法 平板划线法 二、微生物的选择培养 （三）操作步骤: 1.土壤取样： 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 注：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 二、微生物的选择培养 2.样品的稀释（梯度稀释菌液） 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g ②将10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 二、微生物的选择培养 微量 移液器 3.涂布平板 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。 注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。 二、微生物的选择培养 4.培养与观察 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 恒温培养箱 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 二、微生物的选择培养 1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，计算时，不要忽略； 2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证/鉴定； 3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行； 4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 三、微生物的数量测定 ——间接计数法 1.稀释涂布平板法 （1）原理： 当样品的稀释度足够___时，培养基表面生长的一个____，来源于__________中的一个____；通过计数平板上的____数，就能推测出样品中大约含有多少_____。 高 单菌落 样品稀释液 活菌 菌落 活菌 （2）计数原则 ①选择菌落数为_______的平板计数 30-300 ②同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出______； 3 平均值 样品的______将直接影响平板上的菌落数目； 稀释度 三、微生物的数量测定 （3）结果分析： ①统计的菌落数往往比活菌的实际数目____； 原因：__________________________________________ ______________ ②统计结果一般用_______而不是用活菌数来表示； 少 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 菌落数 （4）计算公式： 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) M代表稀释倍数 例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 案例:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、 212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。 2.显微镜直接计数 ——直接计数法 （1）方法： 利用特定的___________或_____________在______下观察、计数，然后再计算_________的样品中微生物的数量； 细菌计数板 血细胞计数板 显微镜 一定体积 血细胞计数板常用于_______________________________等的计数 相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子 细菌计数板可对_________________进行观察和计数； 细菌等较小的细胞 （2）优点： 快速直观 （3）缺点： ①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。 ②个体小的细菌在显微镜下难以观察。③不适于对运动细菌的计数 三、微生物的数量测定 计数区 放大后的计数室 (4)计数方法： 每毫升原液所含细菌数＝ 每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。（“染色排除法”） 2.直接计数法——显微镜直接计数 三、微生物的数量测定 内容 直接计数法 间接计数法 主要用具 计数依据 优点 缺点 显微镜、细菌计数板 或血细胞计数板 涂布器、培养基 细菌个数 培养基上菌落数 计数方便、操作简单 计数的是活菌 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差 常用微生物分离方法比较 比较 平板划线法 稀释涂布平板法 工具 原理 特点 结果 共同点 接种环 涂布器 在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂。 ①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。③观察菌落特征 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 （一）提出问题（实验目的） （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 （二）实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 脲酶 以尿素作为唯一氮源 选择 分解尿素 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 （三）实验流程： 样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察 菌落计数 土壤取样 制备培养基 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 24 1、土壤取样 ①取样地点要求： 酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。 ②取样过程： 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 ③注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 2、制备培养基 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源。 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 3、样品的稀释与涂布平板 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 思考 选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基 （用以判断选择培养基是否具有选择作用） ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ 设置2个平板作为对照： 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基 注意：实验时要对培养皿作好标记注明培养基类型、组别、培养时期、稀释度、培养物等 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ① 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 ② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 ③ 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 4、微生物的培养与观察 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 29 内容 结论分析 结论 有无杂菌污染的判断 （1）对照的培养皿中无菌落生长； （2）培养物中菌落数偏高； （3）菌落形态多样，菌落数偏高 （1）未被杂菌污染； （2）被杂菌污染； （3）培养物中混入其他氮源 选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目大于选择培养基的数目 选择培养基具筛选作用，已筛选出一些菌落 样品的稀释操作 得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功，能进行菌落的计数 重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近；如果结果相差太远，说明实验操作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 CO(NH2)2 脲酶 + CO2 2NH3 + H2O 酚红指示剂将变红 pH↑ 思考：如何对分离的尿素分解菌作进一步的鉴定？ 以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 5.进一步探究 方法 在以尿素为唯一氮源的培养 基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。 液体培养基： 可以直接看液体的变色情况。 固体培养基： 可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 【课堂小结】 【练习与应用】 1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ） √ √ √ 一、概念检测 Q：筛选纤维素分解菌可以到什么环境中取样？ 【练习与应用】 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ） A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D 一、概念检测 【练习与应用】 1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。 二、拓展应用 【练习与应用】 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后， 复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如 下图所示)。请回答下列问题。 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 提示：可以参考本节“探究·实践”中的设 计思路进行设计。 二、拓展应用 【练习与应用】 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 （3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存 的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 二、拓展应用 $