1.2微生物的培养技术及应用（第2课时）课件 2025—2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

人教版高中生物学 选择性必修3《生物技术与工程》 第1章 第1节 微生物的培养技术及应用 （第二课时） 1.概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。 2.阐明微生物选择培养的原理 3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 教学目标 情境导入 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办？ 如何从自然界中分离出需要的特定微生物？ 选择培养基 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。 筛选水生栖热菌的思路是什么样的？ 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 筛选原则 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。 选择培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 ①加富性选择培养基 在培养基中加入分离对象“嗜好”的营养物质。 (投其所好) ②抑制性选择培养基 在培养基中加入分离对象对能够抵抗的某种抗菌物质。 (取其所抗) 1. 定义 2.类型 选择培养基 3.举例 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 耐酸菌 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 pH调至酸性 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 选择培养基 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？ 微生物的选择培养 将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 基本操作：（1）梯度稀释； （2）涂布平板。 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 1.稀释涂布平板法 微生物的选择培养 2.操作步骤: 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。 （1）土壤取样 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 注意 微生物的选择培养 （2）样品的稀释（梯度稀释菌液） 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g 将10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 微生物的选择培养 （3）涂布平板 ①取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。 微生物的选择培养 （4）培养与观察 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。 恒温培养箱 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 微生物的数量测定 1.间接计数法——稀释涂布平板法 （1）原理： 当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含多少活菌。 （2）计数原则 ①一般选择菌落数为30～300的平板计数； ②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 ③适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 微生物的数量测定 （3）结果分析 ①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少； 原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 ②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M M代表稀释倍数； C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL); （4）计算公式： 微生物的数量测定 【例4】某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 【例3】甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 对点训练 微生物的数量测定 2.直接计数法——显微镜直接计数 （1）原理： 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数，血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的观察和计数。 （2）不足： ①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌（数值偏大）。 ②需要相对高的细菌浓度。 ③不适于对运动细菌的计数 （3）优点： 快速、直观 微生物的数量测定 血细胞计数板（厚、深） 细菌计数板（薄、浅） 微生物的数量测定 （4）计数方法： 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。（“染色排除法”） 微生物的数量测定 计算公式 = 80 ×400×104×稀释倍数 A1+A2+A3+A4+A5 1mL样品中酵母菌数= A1+A2+A3+A4+A5 80 ×400÷0.1mm3×稀释倍数 A1、A2、A3、A4、A5分别为五个中方格中的酵母菌数。 25×16型 A1 A2 A3 A4 A5 1mm3=10-3mL 微生物的数量测定 计算公式 = 100 ×400×104×稀释倍数 A1+A2+A3+A4 16×25型 A1 A2 A4 A3 1mL样品中酵母菌数= A1、A2、A3、A4分别为四个中方格中的酵母菌数。 A1+A2+A3+A4 100 ×400÷0.1mm3×稀释倍数 1mm3=10-3mL 微生物的数量测定 微生物的计数方法比较 内容 直接计数法 间接计数法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 计数依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 结果 比实际值偏大 比实际值偏小 微生物的数量测定 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.实验目的 2.实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 3.实验步骤 土壤 取样 制备 培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 菌落计数 （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 微生物的数量测定 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 ①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。 ②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。 ①制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 提供无机盐；调节pH ②制备牛肉膏蛋白胨培养基 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml 4.实验过程 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 4.实验过程 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 测放线菌：一般用103、104、105稀释液。 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 B A C 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养 微生物的数量测定 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 4.实验过程 选择培养基（平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基 ①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基 微生物的数量测定 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 4.实验过程 判断选择培养基是否具有筛选作用 设置两个空白对照 以验证培养基中是否含有杂菌 ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基 涂布的牛肉膏蛋白胨培养基 若对照的培养基中无菌落生长，则说明未被杂菌污染。 若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有筛选作用。 微生物的数量测定 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 4.实验过程 ①培养： ②观察： 根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。 a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。 b．记录菌落的特征： 包括菌落的形状、大小和颜色等。 微生物的数量测定 土壤取样 制培养基 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 4.实验过程 稀释度 104 105 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 菌落数/平板 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数: 微生物的数量测定 微生物的数量测定 5.结果分析与评价 无菌落生长 有菌落生长 大于 30-300 得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 不一定，还需要进一步的鉴定 微生物的数量测定 6.进一步探究 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 土壤中分解尿素的细菌的鉴定 CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3 脲酶 小结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实 验 设 计 Lavf59.27.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v1.2.6 $