1.2 微生物的培养技术及应用（第2课时） 课件 2025—2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第1章 第2节 人教版 选择性必修3 1 目录 CONTENTS 微生物的选择培养和计数 2/ 选择培养基 1/ 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌 水生栖热菌 耐高温的DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应（PCR） 水生栖热菌 为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？ 这是因为水生栖热菌能在 70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 水生栖热菌 根据这个原理，我们能不能从许多微生物中筛选出我们需要的一种呢？ 实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 01 选择培养基 （1）原理：人为提供 目的菌生长的条件(包括 、 和 等) ，同时 其他微生物的生长。 （2）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 不加碳源的培养基 分离出自养微生物 分离耐热菌 70～80℃的高温 不加氮源的培养基 分离固氮微生物 加青霉素的培养基 分离真菌 加高浓度食盐 分离金黄色葡萄球菌 改变培养条件 添加某种化学物质 营养条件 加石油为唯一碳源 分离出分解石油的微生物 特殊碳、氮源 (青霉素能杀死细菌、放线菌) （3）实例： 选择培养基 有利于 营养 温度 pH 抑制或阻止 8 +氨苄青霉素 具有抗氨苄青霉素能力的菌落 没有氨苄青霉素抗性的细菌 选择培养基 培养基+氨苄青霉素 培养基 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 一、选择培养基 问题：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 一、选择培养基 问题：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 微生物的选择培养和计数 2 二、选择培养基配方的设计 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的 农业氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的细菌将尿素 分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收 。 细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为他们能合成脲酶。 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 11 习题巩固 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来， 培养基的配方该如何设计？ 设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。 2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 12 1.选择培养基的制备 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml ①提供无机盐 ②调节pH。 三、微生物的选择培养——获得分解尿素的细菌的纯培养物 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源 ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用 ③不涂布稀释液的选择培养基： 作为空白对照， 判断是否有杂菌污染 13 习题巩固 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基二 4.从用途上来讲，培养基二属于 培养 基，目的是为了获得 。 5.两种培养基共有的培养基成分有： 。 培养基一的碳源为 ，氮源为 ；培养基二的碳源为 ， 氮源为 。 3.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据__________________该类培养基的主要用途为 。 固体 添加了凝固剂琼脂 分离、鉴定、计数 选择 能分解尿素的微生物 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 14 微生物的选择培养 02 1g土壤中含有多少能分解尿素的细菌？ 选择培养基 以尿素为唯一氮源 选择培养基 稀释涂布平板法 + 对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 微生物的数量测定·稀释涂布平板法 03 1.原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个 。 注：通过统计平板上的 ， 就能推测出样品中大约含有多少活菌。 活菌 菌落数 2.计数原则： ①一般选择菌落数为 的平板进行计数 ②在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。 30～300 3 平均值 →重复实验的目的：减小实验误差，增强实验的说服力和准确性。 107 108 √ 微生物的选择培养·稀释涂布平板法 02 具体操作：（一）系列稀释操作 90mL无菌水 ①铲取土样， 将样品装入纸袋中。 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。 铲取土样的铁铲和纸袋是否也需要灭菌？为什么？ 思考 需要；因为也会造成杂菌污染，影响实验结果。 将10g土样加入盛有90mL无菌水，代表稀释多少倍？ 思考 10倍。 微生物的选择培养·稀释涂布平板法 02 ②取1mL上清液加入盛有9mL 的试管中，依次 稀释。 90mL无菌水 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 具体操作：（一）系列稀释操作 无菌水 等比 表述： ①稀释 倍的稀释液；②稀释 的稀释液； 10n 10-n ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 （2）涂布平板 稀释涂布平板法 微生物的选择培养 涂布结束后，要将涂布器灼烧灭菌。 19 二、微生物的选择培养 （一）方法： 稀释涂布平板法 3.实验设计： （3）微生物的培养： （1）待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置（同时放一个未接种的培养基），放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。 恒温培养箱 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 培养未接种的培养基的作用是对照。 一、微生物的数量测定 （一）统计菌体数目： 1 2 显微镜直接计数法 稀释涂布平板计数法 血细胞/细菌计数板 ——间接计数法 ——直接计数法 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测除样品中大约含有多少活菌。 原则 一般选择菌落数在 的平板进行计数。 同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取其平均值。 缺点 统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。 因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。 因此，统计结果一般用 而不用活菌数来表示。 30~300 少 菌落数 微生物的数量测定 （间接计数） 、 是成功统计菌落数目的关键。 恰当的稀释度 涂布是否均匀 1 稀释涂布平板计数法计数 22 微生物的数量测定·稀释涂布平板法 03 【思考】 4号试管的结果表明 每克土壤中的活菌数 约为 个。 每克样品中的菌株数= 某稀释度下平板上生长的平均菌落数 涂布平板时所用的稀释液的体积 ×稀释倍数 1.1×108 101倍 102倍 103倍 104倍 105倍 平均数：110个 甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 = 9 ×107个/克 M代表稀释倍数； C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 计算公式 微生物的数量测定 1 稀释涂布平板计数法计数 24 案例:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、 212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的做法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。 通常计数结果相差超过一个数量级，则需舍弃该数据后进行计数 （4）结果与分析 。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果 25 分离纯化方法：平板划线法和稀释涂布平板法 02 请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 思考 不能。 请结合图片分析，稀释涂布平板法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 思考 原因：①最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数。 ②灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 原因：在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触， 可以确定菌落的密度，再通过计算可以得知原液中的活细菌数。 能。 原理 利用特定的 或 ，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 细菌计数板 血细胞计数板 较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 细菌计数板 血细胞计数板 优点 快速、直观、设备简单；能观察微生物的形态特征。 ①不能区分死菌和活菌 缺点 也可选择用台盼蓝染色法来区分活菌和死菌。 微生物的数量测定 2 显微镜直接计数 细菌计数板 血细胞计数板 ②不适于运动的和个体小的细菌 →统计结果会偏大 能被染色的为死菌 27 2.直接计数法——显微镜直接计数法 （3）计数方法 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。 （“染色排除法”） 28 注意事项 1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时， 不要忽略； 2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即 目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长 繁殖，所以还需要进一步验证； 3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行； 4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽， 然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的 烧杯中，以免引燃酒精。 29 一、微生物的数量测定 微生物的计数方法比较 内容 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 计数依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差 计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝ 平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数 04 土壤中分解尿素细菌的分离与计数 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 提出问题 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ ①绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成 的微生物才能分解尿素。 ②利用 的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 实验原理 脲酶 尿素作为唯一氮源 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 实验设计 (1)土壤取样： ①土壤要求：酸碱度接近 且潮湿。 ②取样部位：距地表约 的土壤层。 中性 3～8cm 取样时一般要 铲去表层土 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 实验设计 (2)样品的稀释： 测定土壤中细菌的数量，一般选用 倍稀释的稀释液进行平板培养。 1×104、1×105、1×106 测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为什么？ 思考 提示： ； 因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要 。 不相同 少 注：第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。 如：将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养， 以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 实验设计 (3)微生物的培养与观察： ①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在 ℃的温度下培养 d。 ②观察：每隔 h统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果，这样可以防止 。 另外，还需要记录菌落的特征： 包括菌落的 、 和 等。 30～37 1～2 24 菌落数目稳定 因培养时间不足而遗漏部分菌落 形状 大小 颜色 实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 04 实验结果 未接种 以尿素为唯一氮源的选择 培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基 1×104 1×105 1×106 牛肉膏蛋白胨培养基中的菌落数大于选择培养基中的菌落数，说明 . ； 该选择培养基 有筛选作用 未接种的培养基上无菌落的生长，说明： ； ； 培养基没有被杂菌污染 鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色。 滤膜法 伊红-美蓝培养基鉴别大肠杆菌 37 选择培养基与鉴别培养基 项目 选择培养基 鉴别培养基 原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应 用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物 举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌 (若有，则菌落呈黑色) 图示 尿素分解菌 大肠杆菌 38 练习与应用 1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ） 2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ） A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 √ √ √ D 练习与应用 4. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。 （2）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 （1）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 41 $