1.2.2微生物的选择培养和计数 课件 2025—2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第1章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术与应用（2） 微生物的选择培养和计数 问题探讨 【资料1】聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外进行DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 【资料2】美国黄石国家公园的热泉中有一种水生栖热菌，能在70～80℃的高温条件下生存。 如果让你寻找一种耐高温的DNA聚合酶，该如何寻找？ 思考 思路：耐高温的酶←耐高温生物体←高温环境； 从热泉中筛选出的水生栖热菌中提取出来。 耐寒微生物 石油分解菌 被石油污染的土壤 冰川冻土层 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 1 选择培养基 【自主学习】阅读教材P9-10页，思考下列问题： 1.选择培养基的概念、原理及类型？ 2.分析教材P16“分离尿素分解菌的选择培养基”，总结选择培养基配方如何设计？ 选择培养基 1.概念： 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 2.原理： 人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 3.类型： a.改变培养条件 70～80℃的高温 使用将pH调至酸性的培养基 分离耐高温的水生栖热菌 分离耐酸菌 b.改变培养基中的营养成分 不加碳源（含碳有机物）的培养基 不加氮源的培养基 分离出固氮菌 分离出自养型微生物 c.添加某种化学物质 加入青霉素 加入高浓度食盐的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌 分离得到金黄色葡萄球菌（耐盐） 判断以下条件，可以筛选出什么微生物？ ①不加氮源,筛选出 ； ②不加碳源,筛选出 ； ③只提供纤维素为唯一碳源,筛选出 ； ④不提供氧气的生存环境,筛选出 ； ⑤只提供石油为唯一碳源,筛选出 ； ⑥只提供琼脂为唯一碳源,筛选出 。 快问快答 自养型微生物 固氮菌 石油降解菌 纤维素分解菌 厌氧微生物 琼脂分解菌 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 思考 基础培养基 选择培养基 思考分析：尿素分解菌的选择培养基配方如何设计？ 资料： 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。 CO(NH2)2 ＋H20 脲酶 + CO2 2NH3 蔗糖 30g NaNO₃ 3.0g K₂HPO₄ 1.0g KCl 0.5g MgSO₄·7H₂O 0.5g 琼脂 20g 蒸馏水 定容至1000mL 思路： 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 尿素CO(NH2)2 拓展延伸 如何判定选择培养基上的菌落是否为尿素分解菌? 提醒：有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物。 所以需要进一步验证 鉴定培养基 原理：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 呈碱性，遇酚红指示剂呈红色。 酚红可用作酸碱指示剂，其变色范围较为明确。 在低pH值时（如pH<6.8），酚红呈现黄色； 在高pH值时（如pH>8.4），则呈现红色。 在pH值6.8至8.4之间，酚红会呈现橙色过渡色。 液体培养基： 可以直接看液体的变色情况； 可以观察菌落周围是否出现红色环带； 红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 固体培养基： 几种常用的鉴别培养基 伊红—亚甲蓝琼脂培养基分离鉴别革兰氏阴性肠道杆菌 淀粉培养基 尿路菌群显色培养基 念珠菌群显色培养基 鉴别培养基： 伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌 大肠杆菌菌落呈现深紫色 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 10 葡萄糖 10 g KH2PO₄ 0.5 g MgSO₄·7H2O 0.2 g NaCl 0.1 g 琼脂 15 g 蒸馏水 1000 mL 培养基（一） 纤维素 15 g NaNO₃ 2.0 g Na₂HPO₄ 2.5 g KH₂PO₄ 0.5 g MgSO₄·7H₂O 0.5 g 琼脂 15 g 蒸馏水 1000 mL 培养基（二） 观察分析左侧两种培养基配方，回答下列问题： 1.从物理性质来讲，两者都属于_____培养基，判断依据是_______________；该类培养基的主要用途为_______________。 2.从用途（功能）上来讲，两者属于 培养基，目的分别是为了到 、 。 3.一般培养基需要的成分有： 。 培养基一的碳源为 ，氮源为 ； 培养基二的碳源为 ，氮源为 。 固体 添加了凝固剂琼脂 分离、鉴定、计数、保存 选择 固氮菌 纤维素分解菌 碳源、氮源、无机盐、水 葡萄糖 无（空气中的N₂） 纤维素 NaNO₃ 1.下表为某培养基的配方，有关叙述错误的是（     ） 成分 牛肉膏 葡萄糖 K2HPO4 抗生素 琼脂 蒸馏水 含量 10g 10g 2g 适量 适量 1000mL A．该培养基pH调好后还需要灭菌后才能用于接种 B．该培养基中的牛肉膏来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质 C．此培养基可以用来检测自来水中细菌含量是否符合饮用水标准 D．应用湿热灭菌法对该培养基进行灭菌 C 课 堂 检 测 2 微生物选择培养 【自主学习】阅读教材P17-18页，学习微生物选择培养的操作过程及注意事项 微生物的选择培养 1.原理:通过对土样进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上，即可得到能分解尿素的细菌的纯培养物。 2.方法: 稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 3.主要过程: A、梯度稀释菌液 B、涂布平板 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 4.具体操作： （一）土壤取样 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 注意 （二）样品的稀释（梯度稀释菌液） 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1×10 90mL无菌水 1 mL 1×102 9 mL 无菌水 移液枪 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 （三）涂布平板操作 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿,使涂布均匀。 ④将涂布器放在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液器 注：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 注：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 稀释涂布平板操作后分离得到单菌落 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 恒温培养箱 （四）培养与观察 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 效果图 相同点 连续划线 梯度稀释→涂布平板 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 平板划线法和稀释涂布平板法的比较 拓展延伸 19 2.某同学在进行微生物的纯培养和选择培养时，下列相关操作合理的是（     ） A．在酒精灯火焰旁将培养基倒入培养皿后应立即倒置 B．平板划线操作时每次划线完均需对接种环进行消毒 C．在进行涂布之前需要将涂布器浸入无菌水中再灼烧 D．涂布时转动培养皿可使菌液在培养基上涂布更均匀 D 课 堂 检 测 3.（不定项）某生物兴趣小组为探究不同抗生素对大肠杆菌的抑制效果，进行了如下实验：将大肠杆菌菌液均匀涂布于LB固体培养基表面，然后在培养基上放置分别含有青霉素、链霉素和红霉素的滤纸片，培养24小时后观察抑菌圈大小。下列叙述正确的是（　　 ） A．实验需设置无抗生素的滤纸片作为对照，以排除杂菌污染的干扰 B．涂布菌液前需将涂布器在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后再使用 C．若某滤纸片周围出现的抑菌圈越大，说明该抗生素的抑菌效果越好 D．配制LB培养基时需添加琼脂、碳源、氮源、水和无机盐等，并调节pH后灭菌 BCD 课 堂 检 测 3 微生物的数量测定 【自主学习】阅读教材P18-19页，学习微生物数量测定的两种方法及其注意事项，总结两种方法的优缺点的： 微生物的数量测定 1.直接计数法——显微镜直接计数法 利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数然后再计算一定容积里样品中微生物的数量。 计数板正面 缺点： a.不能区分死菌和活菌→偏大。 b.不适于对运动细菌的计数。 c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。 优点： 快速、直观 用台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 计算公式：每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 选择30-300个菌落的平板进行计数； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 2.间接计数法——稀释涂布平板法 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 计数原则: 106 107 √ 统计的菌落往往比活菌的实际数目偏低， 原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 重复实验：减小实验误差，增强实验的说服力和准确性。 ①1、2、3是 （实验组） 作用： 。 1.每个浓度至少设置 个平板。 对目标微生物进行分离和计数 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如：注明组别、培养日期和稀释度。 4 接种的选择培养基 2.实验还要设置 个 对照。 ②4是 (对照组) 作用： 。 ① 。② 。 作用： 。 空白 不接种的选择培养基 不接种的牛肉膏蛋白胨培养基 验证培养基是否有杂菌污染 判断选择培养基是否具有选择作用 接种的牛肉膏蛋白胨培养基 2 思考分析： 25 计算公式: 每g样品中的菌落数＝ (C÷V)×M M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 （234÷0.1）×106=2.34×109 答 B 例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 4.某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 请评价这两位同学的实验结果的有效性： 1.甲同学____________________________________； 原因是_______________________________________。 2.乙同学____________________________________； 原因是________________________________________________________________。 实验操作不合理 没有设置重复组，结果不具有说服力 结果计算不合理 第1个平板的计数结果与另外两个相差太远，因此不能对这三个平板的计数值求取平取值 课 堂 检 测 内容 显微镜直接计数法 间接计数法（稀释涂布平板法） 主要用具 计数依据 优点 计算公式 缺点 结果 微生物的计数方法比较 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器、培养基 细菌个数 培养基上菌落数 计数方便、操作简单 计数的是活菌 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 比实际值偏大 比实际值偏小 拓展延伸 28 阅读书本P19，请同学们用所学的知识，完善“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验设计。 探究•实践 提示： 实验原理 实验设计 提出问题 作出假设 设计实验 分析结果，得出结论 表达与交流 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究•实验 1.实验原理： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 2.实验设计： 提出问题：土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ 作出假设：利用以“尿素为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。 设计实验： 步骤1：土壤取样 ①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。 ②取样部位：距地表约3～8cm的土壤层。 步骤2：配制培养基 ①选择培养基——以尿素为唯一氮源 ②完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）——作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用 土壤不需要灭菌，其他操作工具及培养基一定要灭菌或消毒处理 步骤3：样品的稀释 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 一般选用1×104、1×105、1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。 注：第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。 步骤4：培养与观察 ①每个浓度至少设置4个平板 ②不同种类的微生物，往往需要 不同的培养温度和培养时间。 ③每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目） 选择培养基（平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基 （用以判断选择培养基是否具有选择作用） 分析结果，得出结论： 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 未接种 以尿素为唯一氮源的选择 培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基 1×104 1×105 1×106 未接种的培养基上无菌落的生长，说明： 培养基没有被杂菌污染 牛肉膏蛋白胨培养基中的菌落数大于选择培养基中的菌落数，说明： 该选择培养基有筛选作用 思考：得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 不一定； 因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。 鉴定培养基：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，观察菌落周围出现红色环带，若出现，则可说明该菌种能够分解尿素。红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 （1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌，请你给出详细的实验方案。 用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。 拓展应用（P20） 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 富含纤维素的环境 如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等 （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的适宜环境，纤维素分解菌会在滤纸上聚集。就可以从腐烂的滤纸上筛选出纤维素分解菌。 课堂小结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 结果分析评价 5.（不定项）某兴趣小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了相关实验。下列叙述正确的有（     ） A．梯度稀释时可用微量移液器进行操作 B．甲组中a培养基上的菌落连成一片，是稀释度不够造成的 C．以乙组计数，1g土壤中尿素分解菌的估算数目是2.8×10⁸个 D．若平板上长出形态、大小不一的菌落，说明土壤中除目标菌外还有其他能利用尿素的杂菌 AC 课 堂 检 测 6.有机农药苯磺隆是一种强效除草剂，长期使用会严重污染环境；研究发现，苯磺隆能被土壤中某种微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示，请回答相关问题： (1)微生物的培养基一般都应该含有的成分有水、无机盐和 。土壤有“微生物的天然培养基”之称，为了获取能降解苯磺隆的菌种，选择的土壤样品应来 自 。 (2)图甲中选择培养的目的是 ；在划线纯化操作时，划线工具使用前后都要进行 灭菌。 (3)若要检测土样中的细菌含量，应采用 法进行接种。运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小，原因是 。 碳源、氮源 长期施用苯磺隆的农田土壤 增加降解苯磺隆菌株的浓度（或富集目标菌种） 灼烧 稀释涂布平板 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 课 堂 检 测 $