1.2微生物的培养技术及应用（第2课时）2025-2026学年高二生物同步备课优质课件（人教版2019选择性必修3）

第2节 微生物的培养技术与应用 第1章 发酵工程 1 教学目标 TEACHING OBJECTIVES 学习目标： 1.概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求， 进行酵母菌的纯培养。 2.阐明微生物选择培养的原理。 3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 重难点： 1.微生物纯培养的基本操作要求。 2.酵母菌的纯培养。 3.土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 微生物的选择培养和计数 2 微生物的基本培养技术 1 目录 CONTENT 2.方法步骤： （2）接种和分离酵母菌 平板划线法： 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。 分区划线法 1 2 3 4 5 连续划线法 平板划线法： ①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ③试管口通过火焰 ⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。 ⑤试管口通过火焰， 并塞上棉塞 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。 分区划线法 1 2 3 4 5 将聚集的菌种进行稀释，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 注意事项 避免温度过高杀死菌种 1.灼烧接种环后，要等其冷却后再进行划线的目的：__________________________ 2.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。 3.除第一次划线外，为什么每次划线都从上一次划线的末端开始？ 划线后，线条末端细菌的数比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能将聚集的菌种进行稀释，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 4.为什么不能将最后一次的划线与第一次的划线相连？ 5.划线后，培养皿倒置培养。 6.划3个平板（重复实验) + 1个不划线（空白对照） 因为最后一次划线已经将酵母菌稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连，则增加了酵母菌数目，得不到纯化的效果。 7.每次划线前接种环进行灭菌。实验中接种环需灼烧几次？ 灼烧时期 目的 取菌种前 每次划线前 接种结束后 灭菌，杀死接种环上原有微生物。 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞。 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。 2.方法步骤： （3）培养酵母菌 作对照，检验培养基是否被杂菌污染 （1）在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？ 在未接种的培养基表面应该没有菌落生长； 如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。 （2）如何记录实验结果？ 可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加等。 3.结果分析： （3）在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析可能是由哪些原因引起吗？ 在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起。 思考：若某同学将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧几次？ 6次 练习.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。 （1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？ （2）从图中数据可得出什么结论?原因是什么? （3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定? 意味着培养液中02含量不同。 培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。 已经达到了环境容纳量。 情境：聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 在什么微生物体中可以得到这种酶？ 1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。 1.在被石油污染的土壤中可以筛选 微生物； 2.在冰川冻土层可以筛选 微生物； 3.以纤维素为唯一碳源培养基可以筛选 。 分解石油 耐寒 【启示】寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 纤维素分解菌 实验室中微生物的筛选，可以应用这个原理吗？ 4 微生物的选择培养——选择培养基 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 1.实验室中微生物筛选的原理是什么？ 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 2.选择培养基： 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 【举例】选择出抗氨苄（biàn）青霉素能力的细菌 基础培养基 加氨苄青霉素 选择培养基 有抗氨苄青霉素能力的菌落 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 思考：如何证明该选择培养基具有选择性？ 若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 空白 菌落 基础（或完全）培养基 【作对照】 思考 · 讨论：从土壤中分离出能分解尿素的细菌 1.选择培养基配方的设计： 尿素［CO(NH2)2］是一种重要的氮肥。尿素不能直接被农作物吸收，会被土某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。 这些细菌能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源。 （1）要将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ （2）该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 ①提供无机盐 ②调节pH。 4 微生物的选择培养——获得分解尿素的细菌的纯培养物 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离培养：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 问题：土壤细菌数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行什么处理？能否用平板划线法对该细菌进行纯培养和计数？ 两个基本操作： 和 。 梯度稀释 涂布平板 　不能用平板划线法，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 稀释涂布平板法： 平板划线法 稀释涂布平板法 （1）对土壤样品进行梯度稀释： ①铲取土样，将样品装入纸袋中 注意：细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，大部分分布在距地表3~8cm土壤层。 取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。操作完成后，一定要洗手 。 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。（稀释10倍） 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9mL无菌水 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 10g 90mL无菌水 1×10 稀释涂布平板法： （2）涂布平板操作： 稀释涂布平板法： 移液枪 ①取0.1mL 菌液滴加到培养基表面 ②涂布器浸在酒精中。 ③涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，进行涂布。 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：各浓度梯度下至少分别涂布3个平板(平行重复）。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 3.培养并观察培养基菌落： 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入___________中培养 ____d，在涂布有 菌液的平板上就可以观察到分离的 。 倒置 恒温培养箱 1~2 合适浓度 单菌落 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 思考：培养时要为什么将一个未接种的培养基和 已接种的培养基放在一起培养？ 培养未接种的培养基的作用是对照。 未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到杂菌污染。 稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外， 也常用来统计样品中活菌的数目。 问题：根据实验结果，能否计算出细菌数目的是多少？ 平板划线法 稀释涂布平板法 接种工具 纯化原理 在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落。 在稀释度足够高的菌液里，聚集的微生物被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单菌落。 特点 效果图 相同点 接种环 涂布器 方法简单，但不适宜计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂 ⑤分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 5 微生物的数量测定 1. 间接计数法——稀释涂布平板法 (1) 原理： (2) 计数原则：☆ 样品 1×107 稀释倍数足够高 1个单菌落，来源于样品稀释液中的1个活菌 通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 ①选择菌落数为 的平板计数。 ② 同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目 。 ④统计的结果一般用 而不是活菌数。 30~300 3 平均值 低 菌落数 因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后观察到的还是一个菌落。 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 （3）计算公式： 每g样品中的菌落数＝ (C÷V)×M C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) M：稀释倍数 例1.某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 例2.据4号试管的数据计算，每克土壤中的活菌数约为 。 1.1×108 2.直接计数法——显微镜直接计数法 原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。 血细胞计数板→常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 细菌计数板→对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 缺点： ①不能区分死菌和活菌→统计结果偏大。 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 优点： 快速、直观，能观察微生物的形态特征。 可选择用台盼蓝染色法来区分活菌和死菌。 血细胞计数板 每个计数板含2个计数室 中间大方格=计数室 中方格：16个 每个中方格有25个小方格 共9个大方格 1个计数室的体积为0.1mm3。 1个计数室有400个小方格。 每个小方格的体积是1/4000mm3。 1mL培养液所含菌数 ＝每小格平均菌数×400×104×稀释倍数 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 公式 每毫升原液含菌株数＝ 每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 每克样品中的菌株数=(C÷V)×M 　 缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 结果 比实际值偏大 比实际值偏小 探究 ·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.实验目的： 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 2.计数方法： 稀释涂布平板法 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证菌落数在30～300之间。 （1）样品稀释与取样涂布： 测细菌数：一般用104、105、106稀释液 测放线菌：一般用103、104、105稀释液 测真菌数：一般用102、103、104稀释液 每个浓度至少涂布4个平板 3个选择培养基（实验组、平行重复） 1个完全培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。 实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。 （2）培养： 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d） （3）观察： 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）。 3.结果分析与评价 （1）结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染；以及选择培养基是否 筛选出一些菌落。 如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。 （2）你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板? 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近? 如果得到了2个或2个以上菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 （3）你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？ 如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。 如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。 思考：在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出都是分解尿素的微生物吗？ 4.进一步探究——分解尿素细菌的初步鉴定 不一定！因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。 鉴别培养基 （1）鉴定原理： 分解尿素的细菌合成的 将尿素分解为 ，氨使培养基的___性增强，pH ；可在培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。 脲酶 氨 碱 升高 观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 液体培养基： 直接看液体的变色情况。 固体培养基： 带有金属光泽的深紫色菌落 纤维素被分解后出现透明圈 伊红-美蓝培养基 鉴别大肠杆菌 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 碘液培养基鉴别产淀粉酶的菌株 淀粉被分解后出现透明圈 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定作用。 【鉴别培养基】 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种 石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌（ ） √ √ √ 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测 出样品中的活菌数,原因是( ) A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D 【教材习题】 习题巩固 1.解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是( ) A.甲菌属于解脂菌 B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源 C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比 D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力 B 31 2.某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。 (1)实验中盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。 乙培养基中的Y物质是　 　 。甲、乙培养基均属于_____培养基。 (2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。 高压蒸汽灭菌 琼脂 选择 104 (3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是：S的浓度超过某一值时会_______________。 (4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤： 。 (5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即： 。 抑制菌株的生长 取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数 水、碳源、氮源和无机盐 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 培养基 成分 分类 按物理性质： 按成分： 按功能： 无菌技术 消毒 灭菌 无菌操作 微生物的纯培养 接种与分离 数量测定 平板划线法： 稀释涂布平板法： 计数板计数法： 稀释涂布平板法： 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 选择培养基 实验设计 取样： 稀释涂布： 培养与计数： 【知识框架】 感谢观看! 2019人教版·生物·选择性必修3 35 Lavf58.12.100 Tencent APD MTS Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 $