1.2微生物的培养技术以及应用 课件 2025—2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第一章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用（第一课时） 新课导入 应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。 杂菌 污染 这需要应用无菌技术和微生物的培养技术 思考：怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？ 目录 01 一、微生物的基本培养技术 一、微生物的基本培养技术 1. 微生物 （1）概念：个体无法用肉眼观察的微小生物。 一、微生物的基本培养技术 1. 微生物 （2）类群： 无细胞结构 原核细胞 真核细胞 真菌：酵母菌、毛霉等； 原生生物：草履虫、变形虫、硅藻等 微生物的类群 病毒：SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；噬菌体等DNA病毒 细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌、醋酸菌等；放线菌: 链霉菌等 一、微生物的基本培养技术 微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。 ①要为人们需要的微生物提供合适的______________条件。 ②要确保 ，并将需要的微生物分离出来。 营养和环境 其他微生物无法混入 实验室培养微生物的条件 ——培养基 ——无菌技术 6 一、微生物的基本培养技术 2. 培养基 （1）概念： 人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质。 营养物质 生长繁殖 （2）作用： 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或 。 积累其代谢物 注意: 病毒只能在活细胞中营寄生生活，目前不能使用人工培养基来培养。 一、微生物的基本培养技术 2. 培养基 （3）种类： ①物理性质 液体培养基 固体培养基 （加凝固剂，如 ) 琼脂 扩大微生物种群数量 微生物的分离、鉴定、活菌计数和菌种保存等 液体培养基 固体培养基 注意：①加入培养基中的凝固剂（如琼脂），不能为微生物提供能量和碳源。 ②微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。 菌落：一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 不含凝固剂、呈液体状态的培养基 含有凝固剂、呈固体状态的培养基 琼脂在98 ℃以上熔化，在44℃以下凝固 一、微生物的基本培养技术 2. 培养基 ②功能 选择培养基 鉴别培养基 根据某种微生物的特殊营养要求配置。将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。 加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂。用于鉴别不同类型的微生物。 基础培养基 含一般微生物生长繁殖所需要的基本营养物质 9 一、微生物的基本培养技术 2. 培养基 ③成分 合成培养基 用已知的化学物质配制 天然培养基 含有化学成分还不清楚或化学成分不明确的天然有机物。 工业生产 分类鉴定 10 一、微生物的基本培养技术 2. 培养基 具体处理 原理 目的 选择培养基 鉴别培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌 分离固氮菌 分离自养微生物 鉴别分解尿素的细菌 鉴别纤维素分解菌 加入青霉素 不加氮源 不加有机碳源 加入酚红培养基 加入刚果红 青霉素能抑制细菌生长， 对真菌无作用 固氮微生物能利用空气中的氮气 自养型微生物能利用无机碳源 尿素被分解产生氨，培养基呈碱性，酚红指示剂变红。 刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。 加入伊红-亚甲蓝琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 菌落呈现深紫色 一、微生物的基本培养技术 2. 培养基 （4）营养组成： （1）基本成分： 碳源、氮源、水、无机盐等（一般都有） 合成各种有机物 合成蛋白质、核酸 ①碳源 无机碳源： 有机碳源： CO2、CO32-、HCO3-。 糖类、脂肪酸 、花生饼粉、石油等。 自养微生物 异养微生物 功能：①主要用于合成微生物体内各种有机物 ②对于异养微生物有机碳既是碳源又是能源 注意：自养微生物的培养基中 有机碳源，因其可利用CO2等无机碳源。 可不添加 12 一、微生物的基本培养技术 2. 培养基 （4）营养组成： 氮源 N2、NH4＋、NO3-、NH3、硝酸盐、铵盐等。 尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等。 无机氮源： 有机氮源： 功能：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物 牛肉膏、蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素、有机氮等营养物质。 固氮微生物（根瘤菌）可以利用N2作为氮源，培养基中无需加入氮源。 氨是硝化细菌的氮源，NH3的氧化过程也为硝化细菌提供能源。 对于异养生物，含C、H、O、N的有机化合物（尿素除外）是异养型微生物的碳源、氮源、能源。 注意：主要提供碳源的是牛肉膏， 主要提供氮源的是蛋白胨。 一、微生物的基本培养技术 2. 培养基 （4）营养组成： 无机盐 大量元素： Ca、K 、Mg等 微量元素： Zn、Cu、Mn、Co、Mo等 作用：①提供无机营养；②调节pH；③维持渗透压 培养基经常使用有：K2HPO4 MgSO4 NaCl Ca(NO3)2 FeSO4 水 ①良好的溶剂； ②维持生物大分子结构的稳定 注意：有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）。 一、微生物的基本培养技术 2. 培养基 （4）营养组成： ⑤特殊需求： 满足微生物对 _____________________________的需求 pH、特殊营养物质、氧气 （牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液中含有维生素） 培养的微生物 需要满足的其他要求 乳酸杆菌 培养基中添加___________ 霉菌 将pH调至______ 细菌 将pH调至__________________ 厌氧微生物 需要提供_______条件 维生素 酸性 中性或微碱性 无氧 维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 pH：4.0-5.8 pH：7.0-8.0 酵母菌：3.8-6.0 放线菌：7.5-8.5 先定容再调PH 目录 02 二、无菌技术 二、无菌技术 1. 目的 （1）防止培养物被污染（获得纯净培养物） 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。 （2）防止感染实验操作者 2. 关键 3. 内容 ①消毒： 无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 ②灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 二、无菌技术 1.消毒： 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 2.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 芽孢和孢子的区别： 芽孢是某些细菌在营养条件缺乏时，在菌体内形成的抗逆性强的休眠构造。芽孢萌发可形成细菌体。 孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞，它是有丝分裂或减数分裂的产物 芽孢是抗逆性强的休眠体。 孢子是繁殖体（生殖细胞）。 蘑菇孢子 芽孢的形成 18 二、无菌技术 1.消毒： 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 2.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 （1）对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 （2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 19 二、无菌技术 1.消毒： 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 不包括全部的芽孢和孢子。 ①物理方法： 煮沸消毒： 在100 ℃煮沸5〜6 min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。（日常生活用品餐具等） 巴氏消毒： 对于一些不耐高温的液体，如牛奶，则可使用巴氏消毒法，即在62 〜65 ℃消毒30 min或80〜90 ℃处理30 s 〜1 min，可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分。（啤酒啤酒、人乳及婴儿合成食物等） 紫外线消毒： 接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，以杀死物体表面或空气中的微生物。 二、无菌技术 ①物理方法： ②化学方法： 如采用碘酒、体积分数为75%的酒精等化学药剂，对实验室的空间、操作台表面、实验人员的工作服与手等进行消毒；氯气消毒水源等。 ③生物方法： 生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。 1.消毒： 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 不包括全部的芽孢和孢子。 二、无菌技术 2.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 ①湿热灭菌： 利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。 高压蒸汽灭菌： （效果最好） 实验室常用高压蒸汽灭菌锅，在压力100kPa、温度121 ℃条件下，维持15-30min 原理： 对象： 优点： 高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性 操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。 培养基、部分塑料制品（枪头等） 二、无菌技术 2.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 ①湿热灭菌： ②干热灭菌： 干热灭菌箱内，在160-170 ℃的热空气中维持下1-2h达到灭菌目的 原理： 使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等 对象： 耐高温，需保持干燥的物品 玻璃器皿 （如试管、培养皿、吸管、注射器） 金属器具 （如针头、 镊子、剪刀等） 二、无菌技术 2.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 ①湿热灭菌： ②干热灭菌： ③灼烧灭菌： 将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。 外焰 二、无菌技术 2.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 ①湿热灭菌： ②干热灭菌： ③灼烧灭菌： 将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。 此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。 二、无菌技术 做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。 26 二、无菌技术 (1)酒精消毒液中酒精浓度对效果的影响：75%的酒精杀菌效果最好。原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。 (2)无菌技术措施的选择原则。 ①考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。 ②考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。 培养基灭菌：高压蒸汽灭菌——121℃，气压100kPa，15-30min 培养皿灭菌：干热灭菌——160-170 ℃ ，灭菌2h 27 二、无菌技术 类型 适用范围 操作方法 消 毒 灭 菌 较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子） 强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子） 煮沸消毒法 日常生活 100 ℃煮沸5-6 min 巴氏消毒法 不耐高温的液体 62-65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min 化学药剂 生物活体、水源等 擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源 紫外线 紫外线照射30 min 灼烧灭菌 接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 干热灭菌 耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等 物品放入干热灭菌箱,160-170 ℃加热2-3h 湿热灭菌 培养基、培养皿等,生产和实验室常用 高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15-30 min 接种室、接种箱，超净工作台 28 目录 03 三、微生物的纯培养 三、微生物的纯培养 1. 培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。 2.纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物 菌落 3.纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养 微生物群 分散或稀释 单个细胞 单个菌落 繁殖 4.具体步骤： 配制培养基→灭菌→接种→分离→培养 三、微生物的纯培养 酵母菌的纯培养 (1)实验原理： ①分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。 ②采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 (2)材料用具： 酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸（或报纸）、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。 三、微生物的纯培养 拓展—菌落 ①概念: 分散的微生物(单一个体)在适宜的________________表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的_____________ 。 固体培养基 子细胞群体 形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。 ——是鉴定菌种的重要依据 ②特征: ③纯培养方法: 和 . 平板划线法 稀释涂布平板法 三、微生物的纯培养 (3)方法步骤： 酵母菌的纯培养 ①配制培养基 称取去皮的马铃薯200 g，切成小块，加水1000 mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20 g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15〜20 g琼脂，用蒸馏水定容至1 000 mL。 调节培养基的pH：应该在定容完成后，灭菌之前进行操作。 三、微生物的纯培养 ②灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，灭菌15〜30 min。将5〜8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160〜170 ℃灭菌2 h。 (3)方法步骤： 酵母菌的纯培养 ①能避免因水蒸气凝结而浸湿棉塞；②隔绝空气中杂菌的作用。 1 )灭菌锅内的冷空气必须排尽 ; 2 ) 灭菌完毕,应缓慢减压 ; 三、微生物的纯培养 ③倒平板 (3)方法步骤： 酵母菌的纯培养 待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。具体操作步骤如下。 1.拔出锥形瓶的棉塞。 2.将瓶口迅速通过火焰。 3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 〜 20 mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。 4.等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。 技巧：用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高；将平板倒置，①.避免培养基表面的水分更快地挥发。②.防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 不要完全打开，以免杂菌污染培养基 琼脂在98 ℃以上熔化，在44℃以下凝固 翻转 35 三、微生物的纯培养 ③倒平板 (3)方法步骤： 酵母菌的纯培养 1.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 不能，防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。 2.怎么确定所倒平板未被杂菌污染或灭菌彻底？ 思考： 三、微生物的纯培养 ④接种和分离酵母菌 (3)方法步骤： 酵母菌的纯培养 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。平板划线的具体操作如图的流程图。 玻璃涂布器 （ 涂布平板用） 接种针 （ 穿刺接种用 ） 接种环 （ 划线接种用 ） 微生物群 分散或稀释 单个细菌 单个菌落 连续划线 生长繁殖 三、微生物的纯培养 ④接种和分离酵母菌 ①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ③试管口通过火焰 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞 ⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线 操作要在 进行 酒精灯火焰附近 三、微生物的纯培养 ④接种和分离酵母菌 (3)方法步骤： 酵母菌的纯培养 平板划线法： 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 连续划线法 分区划线法 三、微生物的纯培养 ④接种和分离酵母菌 (3)方法步骤： 酵母菌的纯培养 平板划线法： 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 连续划线法 分区划线法 1 2 3 4 5 三、微生物的纯培养 (3)方法步骤： 平板划线法： 分区划线法 1 2 3 4 5 第1次划线 灼烧接种环灭菌 第2次划线 灼烧接种环灭菌 第3次划线 灼烧接种环灭菌 灼烧接种环灭菌 ①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次； ②划线首尾不能相接； ③每次划线前灼烧接种环进行灭菌； ④划线操作结束后，仍需灼烧接种环，培养皿倒置培养。 【平板划线法注意事项】 问：接种环共需灼烧几次？ 6次 41 三、微生物的纯培养 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时， 仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 灼烧时期 目的 取菌种前 每次划线前 接种结束后 杀死接种环上原有微生物。 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 2.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？ 3.在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？ 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。 以免接种环温度太高，杀死菌种。 三、微生物的纯培养 不能。最后一次划线通常已经将微生物稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了微生物的数目，得不到纯化的效果。 4.最后一次划线与第一次划线能否相连？为什么？ 注意：划线时不能划破培养基表面，否则会影响培养、分离的效果，难以达到分离单菌落的目的。 三、微生物的纯培养 ⑤培养酵母菌 (3)方法步骤： 酵母菌的纯培养 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右 (培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异) 的恒温培养箱中培养24 〜 48h。 未接种的平板作为对照组，若有其上菌落生长，则说明培养基被污染或者灭菌不彻底。 划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照） 三、微生物的纯培养 ①在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？ 在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底 ②在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状 和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？ 在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功。如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。 三、微生物的纯培养 ③你是如何记录实验结果的？ 可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等 【归纳总结】平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作 ①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。 ②划线操作在酒精灯火焰旁进行。 ③接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。 ④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。 三、微生物的纯培养 评估论点的可信程度 所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。 47 三、微生物的纯培养 $