第3章 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建-【金版新学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程同步课堂高效讲义教师用书word（人教版，多选）

本讲义聚焦基因工程基本操作程序的核心知识点，系统梳理目的基因的筛选与获取（含PCR技术原理、条件及过程）、基因表达载体的构建（组成及构建过程），形成从目的基因筛选到载体构建的完整学习支架。 资料通过情境分析、归纳总结及针对练等设计，以PCR引物设计、限制酶选择等实例培养科学思维与探究实践能力，课中辅助教师引导学生主动思考，课后助力学生通过自我诊断与练习查漏补缺，强化知识理解与应用。

第2节　基因工程的基本操作程序 第1课时　目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建 [学习目标]　1.简述PCR的原理、条件及过程。　2.简述基因表达载体的组成及构建过程。 任务一　目的基因的筛选与获取 1.基因工程的四个步骤 (1)目的基因的筛选与获取。 (2)基因表达载体的构建。 (3)将目的基因导入受体细胞。 (4)目的基因的检测与鉴定。 2.筛选合适的目的基因 3.获取目的基因的方法 4.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 (2)PCR反应的条件：一定的缓冲液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。 　　DNA复制时，DNA聚合酶不能从DNA模板链的一端直接开始合成子链，而是需要从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，形成DNA子链。因此进行PCR扩增的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列来合成引物。 　(3)PCR扩增的过程 (4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 　　(源于教材P77“相关信息”)PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋的原因是真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。 【自我诊断】 1.从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。(√) 2.Taq DNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。 (×) 3.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则。 (√) 4.PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚。 (×) 5.DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。 (×) 学生用书⬇第92页 [活动1]　深入理解PCR扩增技术 情境：图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题： (1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。 提示：不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 (2)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？ 提示：第3轮；1/4。 (3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 提示：根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 (4)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。 提示：第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ'自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。 (5)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 提示：要在两种引物的5'端分别添加上限制酶的识别序列。 (6)如果循环n次，则共需消耗多少对引物？ 提示：共需消耗2n－1对引物。 【归纳总结】 1.聚合酶链式反应(PCR) (1)PCR反应的过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 ①变性：当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (2)PCR反应的结果 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与 学生用书⬇第93页 引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，耐高温的DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数式扩增。 2.生物体内DNA复制与PCR反应的比较 比较项目 体内DNA复制 PCR反应 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的3'端开始延伸，都是连续合成 过程 循环次数 受生物体自身控制 30多次 产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段 相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的2种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则 针对练1.(2025·山东临沂高二期末)下列关于PCR技术的叙述，错误的是(　　) A.PCR技术的原理是DNA半保留复制 B.该反应体系缓冲液中一般要添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶 C.引物应选用图中的A、D D.引物是一小段DNA或RNA，用于PCR的引物长度通常为30～40个核苷酸 答案：D 解析：PCR技术的原理是DNA半保留复制，A正确；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此缓冲液中一般要添加Mg2＋，B正确；引物应选用图中的A、D，才能将目的基因片段扩增出来，C正确；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，D错误。 PCR过程的四点提醒 (1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3'端，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 (3)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。 (4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。　　 针对练2.(2024·河北沧州高二期末)引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法不正确的有(　　) A.PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA B.若引物的C—G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高 C.在PCR的退火步骤，两种引物分别结合在模板链的3'端和5'端 D.若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引物分子 答案：C 解析：PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，体内的DNA复制引物通常是RNA，PCR引物一般是单链DNA，A正确；G与C之间有3个氢键，稳定性高，若引物的C—G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高，B正确；在PCR的退火步骤，两种引物都结合在模板链的3'端，C错误；若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，得到10×210个＝10 240个DNA分子，共10 240×2＝20 480条链，由于初始的20条链不需要引物，故至少需要20 480－20＝20 460个引物分子，D正确。 引　物 (1)引物的本质：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段。 (2)引物的长度：用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。 (3)一个PCR反应所需引物的种类：2种。DNA的两条链是反向平行的，2种引物要分别与两条模板链结合。 (4)设计引物：设计的两种引物之间的碱基序列不能互补配对。 学生用书⬇第94页 任务二　基因表达载体的构建 1.启动子是转录的起始信号，而非转录的起始位点；终止子是转录的终止信号，而非转录的终止位点。 2.构建基因表达载体时，可以用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段；也可以用能产生相同末端的不同限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段。 　　(源于教材P80图3-6)观察基因表达载体构建模式图，写出结构①和②的名称：①启动子，②终止子；物质A和B的名称：A.限制酶，B.DNA连接酶。 【自我诊断】 1.一个完整的基因表达载体由目的基因、标记基因、起始密码子、终止密码子和复制原点等组成。 (×) 2.启动子位于目的基因的上游，是转录的起始位点，是一段有特殊序列结构的DNA片段。 (×) 3.构建基因表达载体时，必须使用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段。 (×) 4.基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取。 (×) 5.基因表达载体含有启动子和终止密码子。 (×) 6.标记基因不一定是抗生素抗性基因。 (√) [活动2]　深度分析基因表达载体的构建 情境：目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 学生用书⬇第95页 分析回答下列问题： (1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为限制酶和DNA连接酶。 (2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因是SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因。 (3)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA，但会导致目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接等问题，为避免以上问题出现，应使用BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)两种限制酶。 (4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上启动子，其是RNA聚合酶识别和结合的部位。 【归纳总结】 基因表达载体构建时有关限制酶的选择 1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 2.根据质粒的特点确定限制酶的种类 针对练3.(2025·黑龙江双鸭山期末)如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　) A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 B.基因表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C.图示过程是基因工程的核心步骤 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 答案：B 解析：卡那霉素抗性基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，A正确；构建基因表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B错误；图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，C正确；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。 1.“单酶切法”和“双酶分别切割法”均能成功构建基因表达载体。 2.与“单酶切法”相比，“双酶分别切割法”不要求载体和目的基因两侧具有同一种限制酶的识别序列，只要两种限制酶切割后形成的黏性末端是互补(相同)的即可，具有一定程度的灵活性。 3.“单酶切法”和“双酶分别切割法”都不能避免载体和目的基因的自身环化，也都不能避免载体与目的基因的反向连接。 学生用书⬇第96页 针对练4.(2024·浙江金华高三期末)东南景天中的HMA3基因能编码Cd(镉)转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是(　　) A.欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得 B.用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带 C.构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列 D.用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞 答案：C 解析：欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或含Ti质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误。 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 思维导图 要语必背 1.培育转基因抗虫棉需要4个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2.苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 3.PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 4.一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。 学生用书⬇第97页 1.(2025·漯河四高高二期末)下列关于PCR的叙述，错误的是(　　) A.PCR只能扩增引物之间的DNA片段而非整个完整的模板DNA分子 B.PCR过程中变性的目的是让引物与模板DNA单链结合 C.PCR的原理是DNA半保留复制 D.PCR的过程需要耐高温的DNA聚合酶但不需要解旋酶 答案：B 解析：变性的目的是通过升高温度，破坏氢键，打开模板DNA分子，为子链的延伸提供模板，B错误。 2.(2025·全国课后作业)在基因表达载体的构建中，下列说法正确的是(　　) ①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、起始密码子、终止子和标记基因 ②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA ③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止 ④所有基因表达载体的构建是完全相同的 ⑤必须在细胞外进行 A.②③⑤　 B.①④　 C.①②⑤　 D.③④ 答案：A 解析：基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等，起始密码子位于mRNA上，①错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，使转录在所需要的地方停止，③正确；由于受体细胞有植物细胞、动物细胞以及微生物细胞之分，目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因工程的操作环境是在生物体外，因此基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤正确。综上所述，②③⑤正确，A符合题意。 3.(2024·广东茂名高三期末)在细菌和病毒类疾病检测、遗传疾病诊断、肿瘤筛查和诊断中，都可采用PCR技术。PCR反应由变性→复性→延伸三个基本反应步骤构成，PCR完成以后常需要鉴定PCR的产物。下列叙述正确的是(　　) A.变性：耐高温的DNA聚合酶将双链DNA解链为单链 B.复性：两种引物与两条单链DNA结合不必控制温度 C.延伸：4种脱氧核苷酸加到引物的5'端 D.鉴定：DNA聚合酶质量不好可能导致鉴定结果不仅有一条带 答案：D 解析：变性过程中DNA双链解开是温度作用的结果，不是耐高温的DNA聚合酶的作用，A错误；两种引物与两条单链DNA结合需要适宜的温度，B错误；DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸的，4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，C错误；DNA聚合酶质量不好可能导致实验失败，出现不仅一条带，D正确。 4.(2025·吉林通化高二阶段考)科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是(　　) A.为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因 B.构建基因表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达 C.启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位，可以驱动遗传信息的转录 D.基因表达载体中的标记基因可以用来鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞 答案：C 解析：启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，C错误。 5．(多选)(2024·江苏苏州高二期末)某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析正确的是(　　) A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段 B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因 C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA 学生用书⬇第98页 D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长 答案：ABD 解析：限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个切割位点，用HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；AluⅠ的切割位点位于目的基因内部，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；不宜选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，因为质粒中的两个标记基因均会被破坏，且DNA会反向连接至载体上，C错误；构建重组DNA时，选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 6.(创新情境)(2025·湖北黄冈中学调研)基因工程自20世纪70年代兴起后，得到了飞速的发展。到2015年，我国仅转基因抗虫棉就已经育成100多个品种。请回答下列相关问题： (1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的　　　　　　　　　　　　的基因中进行筛选。 (2)目的基因可以人工合成、从基因文库中获取，还可以利用PCR技术获取和扩增。图1展示了PCR技术获取和扩增目的基因的原理。 ①PCR技术利用了DNA半保留复制原理和　　　　　　　　原则。PCR的一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，复性的作用是　　　　　　　　　　　　　　　。 ②将一个DNA分子进行扩增，理论上目的基因最早在第　　　　次循环后获得；第5次循环后，可扩增得到目的基因　　　　个。 (3)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如图2所示。其中链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。 ①EcoRⅠ酶切后得到的—AATT称为黏性末端，“黏性”的含义是　　　　　　　。 ②不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增的原因是　　　　　　　。 ③图2中环状DNA进行PCR的过程中，子链沿引物A延伸的方向是　　　　　(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物　　　　(填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位点。 答案：(1)已知结构和功能清晰　(2)①碱基互补配对　使引物结合到模板链上　②3　22　(3)①两个末端互补的碱基之间可以自发形成氢键　②DNA两端序列未知，无法设计引物　③逆时针　含有 解析：(1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的已知结构且功能清晰的基因中去筛选，这种方法较为高效，从而能顺利获得所需要的基因。(2)①PCR技术的原理是DNA的半保留复制和碱基互补配对原则；复性的作用是使引物结合到模板链上，便于子链的延伸。②以原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物1或引物2，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有。以图示来分析PCR产物： 据图分析可知，理论上目的基因最早在第3次循环后获得。第5次循环后，可扩增得到目的基因25－2×5＝22个。(3)①EcoRⅠ酶切后得到的—AATT称为黏性末端，“黏性”的含义是两个末端互补的碱基之间可以自发形成氢键。②由于DNA分子两端的脱氧核苷酸序列未知，故无法设计引物，所以不能直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增。③图2中环状DNA进行PCR的过程中，子链沿引物A逆时针延伸，沿引物a顺时针延伸，才能扩增得到未知序列。由于碱基互补配对，环化后的DNA分子含有EcoRⅠ的切割位点，则PCR产物也含有EcoRⅠ的酶切位点。 学科网（北京）股份有限公司 $