第3章 第1节 重组DNA技术的基本工具-【金版新学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程同步课堂高效讲义教师用书word（人教版，多选）

本讲义聚焦重组DNA技术的基本工具及DNA粗提取鉴定，系统梳理限制酶、DNA连接酶、载体的作用与载体条件，结合DNA粗提取鉴定原理与方法，通过概念解析、对比表格、情境活动及自我诊断题搭建学习支架，助力学生构建知识体系。 资料以抗虫棉培育等情境活动激发兴趣，通过实验操作指导（如研磨、离心）培养探究实践能力，对比分析限制酶与连接酶等培养科学思维，思维导图与要语必背强化知识梳理，针对练结合真题，课中辅助教学，课后帮助学生查漏补缺，提升解决实际问题的责任意识。

第1节　重组DNA技术的基本工具 [学习目标]　1.概述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。　2.阐明基因工程载体需要具备的条件。　3.理解DNA粗提取和鉴定的原理，学会DNA粗提取和鉴定的方法。 任务一　基因工程的概念及基本工具 1.基因工程的概念 2.限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀” (1)来源：主要从原核生物中分离纯化出来。 (2)作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 (3)作用结果：产生黏性末端或平末端。 限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即一条链正向读(5'→3')的碱基顺序，与另一条链正向读(5'→3')的顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。 3.DNA连接酶——“分子缝合针” (1)种类 项目 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 特点 都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶 (2)作用 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 4.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。 (2)种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 (3)条件 　　(源于教材P74“拓展应用”)想一想，限制酶不切割细菌本身的DNA分子的原因是：含有某种限制酶的细胞中的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 【自我诊断】 1.限制酶只能用于切割目的基因。 (×) 2.DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。 (×) 3.E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率高于T4 DNA连接酶。 (×) 4.用作载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点。 (√) 5.用作载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。 (×) 学生用书⬇第85页 [活动1]　深入理解基因工程的基本工具 情境：“工欲善其事，必先利其器。”我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”构建成的。培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”，然后导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。 Ⅰ.已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为和，分析回答： (1)用图画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。 (2)写出产生的末端种类：①产生的是黏性末端；②产生的是平末端。 (3)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。 (4)要将限制酶SmaⅠ切割后产生的末端连接起来，宜选用T4 DNA连接酶。 Ⅱ.限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。在质粒上有限制酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个限制酶Ⅱ的切点。 (1)请写出质粒被限制酶Ⅰ切割后形成的黏性末端。 提示： (2)请写出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后形成的黏性末端。 提示：　　　目的基因 GATC—……— —……—CTAG (3)在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？ 提示：能。因为上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的。 【归纳总结】 1.限制酶识别序列的特点 (1)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 (2)能被限制酶特异性识别的序列一般都为回文序列，也就是说，在该序列片段，一条链上按5'→3'读取的序列与其互补链上按5'→3'读取的序列完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。 2.限制酶与DNA连接酶的比较 (1)区别 项目 作用 应用 限制酶 使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 用于获取目的基因和切割载体 DNA 连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于基因表达载体的构建 学生用书⬇第86页 (2)两者的关系可表示为： (3)磷酸二酯键指的是下图椭圆框中的化学键，而限制酶切割或DNA连接酶连接的只能是箭头所指处的化学键，因为圈中另一个化学键属于一个核苷酸的内部结构。 3.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 项目 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键 不同点 模板 不需要模板 需要DNA的一条链为模板 作用对象 游离的DNA片段 单个的脱氧核苷酸 作用结果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一条链 用途 基因工程 DNA复制 4.载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示： 5.基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别 针对练1.(2025·天津红桥高二期中)下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。下图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的 是 (　　) 限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ 识别序列及 切割位点 A.BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键 B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列产生的黏性末端能够相连，连接后的片段还能被Sau3AⅠ切割 C.DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④ D.E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③，且连接效率高 答案：B 解析：限制酶BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ切割，Sau3AⅠ切割，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后的片段能被Sau3AⅠ切割，但是不能被BamHⅠ切割，B正确；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C错误；E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端(如①③)的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶，D错误。 相同黏性末端或平末端的判断方法 　　黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的判断方法：将黏性末端或平末端之一旋转180°后，看它们是不是完全相同的结构。是，则为相同限制酶切割形成的；不是，则为不同限制酶切割形成的。 学生用书⬇第87页 针对练2.(2025·陕西西安高二期末)作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是(　　) A.能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因 B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因，使目的基因能够与其结合 D.对受体细胞无伤害，便于重组DNA的鉴定和选择 答案：A 解析：作为载体必须能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个至多个限制酶切割位点，便于目的基因的插入，B错误；作为载体必须具有某些标记基因，以便于重组DNA分子的筛选，C错误；载体需对受体细胞无伤害，但其目的不是便于重组DNA的鉴定和选择，D错误。 任务二　DNA的粗提取与鉴定 　　(源于教材P75“结果分析与评价”)粗提取的DNA中可能含有哪些杂质？本实验提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 【自我诊断】 1.经研磨后，将研磨液静置几分钟或离心后取上清液进行下一步操作。 (√) 2.研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。 (×) 3.DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。 (×) 4.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可初步分离DNA与蛋白质。 (√) 5.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。 (√) [活动2]　详解DNA的粗提取与鉴定 情境：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对DNA进行提取；在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此可利用二苯胺试剂鉴定DNA。 请结合下列DNA的粗提取与鉴定的基本流程，探讨分析相关问题。 取材研磨过滤取上清液析出DNA鉴定DNA 学生用书⬇第88页 (1)研磨洋葱时加入的研磨液有什么作用？为什么要求充分研磨？ 提示：加入研磨液有利于DNA的释放。研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到白色丝状物或沉淀物、用二苯胺试剂鉴定不显示蓝色等。 (2)上清液中加入预冷的酒精溶液有何作用？为什么要求玻璃棒沿着一个方向搅拌？ 提示：DNA不溶于酒精，加入预冷的酒精溶液有利于DNA的析出。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。玻璃棒沿着一个方向搅拌可防止丝状DNA破碎，能够完整地缠在玻璃棒上。 (3)现有猪血和鸡血适量，能否用来提取DNA？用血细胞作材料可采用何种方法使细胞中的DNA释放？ 提示：不能选用猪血，因为猪属于哺乳动物，其成熟的红细胞中没有细胞核，不含DNA；可选用鸡血作为提取DNA的材料。可向鸡血中加入蒸馏水，使血细胞吸水涨破，从而使其DNA释放。 【归纳总结】 1.DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项 (1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)，可选用鸡血细胞作为材料。 (2)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 (3)提取植物细胞的DNA，在研磨时加入NaCl的目的是溶解DNA。 (4)在DNA进一步提纯时，选用预冷的体积分数为95％的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。 2.DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同 项目 溶解规律 2 mol/L的NaCl溶液 0.14 mol/L的NaCl溶液 DNA 溶解 析出 蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解 针对练3.(多选)(2025·河北保定模拟)如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，下列相关叙述中，错误的是(　　) A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤ B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近 C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组 D．步骤①的目的是初步分离DNA与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2 mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大 答案：ABC 解析：DNA的粗提取和鉴定步骤是：加入蒸馏水，破碎细胞→过滤，获取含DNA的滤液→去除滤液中杂质→DNA的析出→鉴定，因此图中表示正确的实验操作顺序是③→②→①→④→⑤，A错误；猪的成熟红细胞中没有细胞核，提取不到DNA，用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量不相同，B错误；⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是实验组，C错误；步骤①的目的是析出并获得DNA，步骤④中在2 mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大，D正确。 学生用书⬇第89页 针对练4.(2025·广西桂林十中高二期中)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是(　　) A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料 B.DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水 C.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝 D.向洋葱研磨液的上清液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色丝状物 答案：D 解析：酵母和菜花细胞中均含有较多的DNA，均可作为提取DNA的材料，A正确；DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水，B正确；利用DNA与二苯胺沸水浴加热呈蓝色的特征，可用于DNA的鉴定，C正确；向洋葱研磨液的上清液中加预冷的酒精溶液(体积分数为95％)搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物，D错误。 思维导图 要语必背 1.限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 2.DNA分子经过限制酶切割后形成黏性末端或平末端。 3.DNA连接酶可将两个DNA片段连接起来，主要有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。 4.目的基因的主要载体是质粒，它是一种具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 1.(2025·河南开封高二期末)玉米的PEPC固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，不正确的是(　　) A.该技术是在DNA水平上进行设计和施工的 B.该技术的操作环境是生物体内 C.该技术的原理是基因重组 D.该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型 答案：B 解析：由题意可知，该技术为基因工程，原理是基因重组，是在生物体外进行的DNA分子水平上的操作。 2.(2025·大庆市高二期末)以下是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述错误的是(　　) ①—CTGCA　 ②—G　 ③—TG　 —G —CTTAA —AC ④—G　 ⑤—GC —CTGCA —CGC A.以上DNA片段是由5种限制酶切割后产生的 B.若要把相应片段连接起来，应选用DNA连接酶 C.上述能进行连接的两个黏性末端，其连接后形成的DNA序列是 D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 答案：A 解析：从黏性末端是否相同可以看出，①④是由同一种限制酶切割的，其他片段是由不同的限制酶切割的，因此以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的，A错误；DNA相应片段的连接应用DNA连接酶，B正确；①④黏性末端相同，连接后形成的DNA序列是，C正确；DNA连接酶能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，D正确。 3.(2025·重庆一中期末)下列关于质粒的叙述，正确的是(　　) A.细菌质粒和真核细胞DNA的基本组成单位不同 B.细菌质粒的复制过程一定是在受体细胞外独立进行的 C.质粒是存在于所有细胞中的蛋白质合成的场所 D.质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子 答案：D 解析：细菌质粒是一种独立于原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，和真核细胞DNA的基本组成单位相同，都是脱氧核苷酸，A错误，D正确；细菌质粒的复制过程可在受体细胞内进行，B错误；细胞中蛋白质合成的场所是核糖体，C错误。 学生用书⬇第90页 4.(2025·陕西咸阳高二期末)下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是(　　) A.同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性 B.限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA C.限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同 D.限制酶只能从原核生物中提取 答案：B 解析：一种限制酶能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，因此限制酶具有专一性，A错误；限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，不能识别RNA，B正确；限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D错误。 5．(多选)(2024·青岛城阳区高二期末)“DNA粗提取与鉴定”的实验步骤是：研磨→去杂质→析出→鉴定。某研究小组欲探究不同的去杂质方法对实验结果的影响，实验结果如下表所示。下列说法正确的是(　　) 去杂质方式 沉淀质量/g DNA浓度/(ng/μL) OD260/ OD280 二苯胺鉴定 离心 0.068 81.5 1.53 蓝色 4 ℃冰箱静置 0.102 8 336.4 1.41 注：OD260与OD280的比值可检查DNA纯度。纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。 A．猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料 B．对研磨液进行离心是为了加速DNA的沉淀 C．离心法可以获得更高纯度的DNA D．析出时的离心转速明显高于去杂质时 答案：ACD 解析：DNA粗提取与鉴定的实验中，应选择富含DNA的材料，猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，离心法可以获得更高纯度的DNA，B错误，C正确；据表可知，离心时DNA浓度是81.5 ng/μL，4 ℃冰箱静置是336.4 ng/μL，说明静置时蛋白质含量较多，沉淀质量离心时是0.068 g，4 ℃冰箱静置是0.102 8 g，比较可知离心法的沉淀质量小，故析出时的离心转速明显高于去杂质时，D正确。 6.(创新情境)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的识别序列及切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)图中限制酶切割后的DNA片段可以用　　　　　　　　　　　　　　　　酶连接，这两种酶在连接平末端时，效果较好的是　　　　酶。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能　　　　　　　　　　；质粒DNA分子上有　　　　　　　　　　　　　　，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是　　 　　　　　　　。 答案：(1)E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接　T4 DNA连接　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一个至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养受体细胞，能够存活的即为含有质粒载体的受体细胞 解析：(1)图中限制酶切割的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶连接，这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。(2)DNA连接酶通过形成磷酸二酯键，把目的基因与质粒载体片段连接起来。(3)质粒是环状双链DNA分子，常作为基因表达的载体。质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制；质粒DNA分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的导入；质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养受体细胞，能够存活的即为含有质粒载体的受体细胞。 学科网（北京）股份有限公司 $