专题13 基因工程（2大串讲+2大题型）（复习讲义）（北京专用）2026年高考生物二轮复习讲练测

专题13 基因工程 ( 目录 第一部分 知识网络构建 思维导航，融会贯通 第二部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第三部分 核心知识串讲 核心串讲 串讲 1 基因工程 串讲 2 蛋白质工程 能力进阶 能力1 PCR技术拓展 热点情境 基因编辑猪器官移植 第四部分 分层精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 基因工程 题型02 蛋白质工程 B组· 增分能力练 第五部分 真题 实战进阶 对标高考，感悟考法 ) （附思维导图图片） 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程 （2025北京卷）PCR扩增的原理与过程 （2024北京卷）PCR扩增的原理与过程 （2023北京卷）基因工程基本操作 1. 科研情境从"模拟"转向"真实"：直击前沿研究一线； 2. 基因编辑技术 3. 开放性实验 新风向演练 1．【新考法-无缝克隆技术】无缝克隆技术(In—Fusion技术)是一种先进的DNA重组技术，用于将目标DNA片段插入载体中。如图为利用无缝克隆In—fusion技术构建含P基因的重组载体，P基因左右两侧的序列是不同的。In—fusion酶具有3'→5'外切酶活性，从DNA的3'端切除15个核苷酸，进而出现单链区域，最终实现目的基因与线性化质粒连接。下列关于该技术的叙述错误的是（　　） A．推测In—Fusion酶可替代限制酶和DNA连接酶用于构建重组载体 B．选用引物1和4进行PCR2，从而获得线性化质粒 C．按照以上流程构建图示重组载体时，可避免目的基因与载体的反向连接 D．当目的基因内部有多种限制酶识别序列时，In—Fusion技术将无法使用 2．【新载体-融合表达】为治理水体镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子，如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．对目的基因进行PCR扩增时，因参与反应而浓度下降的组分只有脱氧核苷酸和引物 B．为避免CADR、GP1、YFP基因错误连接，需向GP1基因两端分别添加XbaI和SmaI的识别序列 C．可根据黄色荧光来筛选融合蛋白表达成功的衣藻，但基因工程成功与否还需通过测定镉吸收率来鉴定 D．相较于直接投加化学药剂处理镉污染，该治理法的优势在于能够持续吸附镉离子并具备自我增殖能力 3．【新情境-系统性红斑狼疮】科研人员将ETS1基因中①②之间的片段（图1）切除，从而获得雌雄各一头系统性红斑狼疮（SLE）猪（亲本），并分别使用荧光标记的P1、P2、P3三种探针对两者的个体甲、乙、丙进行基因检测，结果如图2所示，相关基因用E/e表示。下列叙述错误的是（　　） A．亲本雌雄猪的基因型分别为Ee、Ee B．图2中Ⅰ、Ⅱ使用的探针分别是P2、P3 C．只有的乙才是纯合SLE模型猪 D．中含大条带与小条带的猪占1/2 4．【新载体-实验探究】科研人员发现BbCUC蛋白与野生型球孢白僵菌（WT）分生孢子的形成有关，利用基因工程获得了BbCUC蛋白编码基因敲除菌株△BbCUC和超量表达菌株BbCUCOE，并将BbCUC基因导入△BbCUC获得回补菌株BbCUCCOM。将等量菌株分别接种在相同且适宜的培养基上，统计相关数据，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．构建BbCUCOE菌株时可将BbCUC基因的启动子替换为活性更强的启动子 B．BbCUC基因通过促进球孢白僵菌产孢结构的发生促进分生孢子的形成 C．可以利用抗原-抗体杂交技术检验目的菌株是否构建成功 D．BbCUCCOM表型并未完全与WT一致，说明导入后可能影响其他基因表达 5．【新情景-基因编辑】2025年，科研团队为了培育适用于异种器官移植的基因编辑猪，利用碱基编辑器（利用碱基互补配对原理，在特定位点操作可对单个碱基进行编辑）对猪的基因组进行精准修饰，敲除了猪内源性逆转录病毒基因（PERV），避免患者受PERV感染，敲除了GGTA1、βGALNT2、CMAH等基因，以减少抗原暴露，降低免疫排斥风险。同时插入CD46、CD55、TBM等基因，以增强人源基因表达、提升异种移植相容性。其中敲除PERV及插入CD46基因的操作流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．设计sgRNA时需与PERV基因和CD46基因的序列互补，以实现精准编辑 B．碱基编辑器的作用是切断猪基因组DNA双链，为CD46基因插入提供位点 C．替换图中sgRNA序列，即可用碱基编辑器进一步敲除GGTA1等基因 D．该基因编辑猪的器官移植到人体后，PERV引发的免疫排斥将完全消除 核心串讲1 基因工程 一、基因工程的工具 1.限制酶 (1)存在:主要是原核生物中,部分真核细胞中也存在,如酵母菌。 (2)作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 (3)形成末端的类型  2.DNA连接酶 (1)作用:将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 (2)种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 特点 只“缝合”黏性末端 黏性末端和平末端都可“缝合 相同点 都“缝合”磷酸二酯键 3.运载体 （1）作用：将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （2）种类 ①质粒（常用）：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ②动植物病毒 ③噬菌体 （3）运载体需具备的条件 ①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； ②有一个至多个限制酶切点； ③有某些标记基因； ④对受体细胞无害、易分离。 载体≠表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 【易错提醒】 载体≠表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 二、限制酶的选择技巧 1.根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 2.根据质粒的特点选择限制酶(如图) 3.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 【易错提醒】 若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使目的基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。 三、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 （1）方法：从基因文库中直接获取。基因文库类型:基因组文库（包含一种生物的所有基因）；部分基因文库（包含一种生物的一部分基因）（cDNA文库）。 （2）人工合成：逆转录法、化学合成法。 （3）利用PCR技术获取和扩增 2.基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使其能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体的组成和功能 3. 将目的基因导入受体细胞 （1） 导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法。 （2） 导入动物细胞：显微注射法。受体细胞：受精卵。 （3） 导入微生物细胞：Ca2+处理。可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 农杆菌转化法操作流程 4.目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 【典例1】（25-26高三上·北京石景山·期末）下图为农杆菌转化法培育转基因抗病毒番茄的过程示意图。下列叙述不正确的是（    ） A．过程①需要限制酶和DNA连接酶的参与 B．过程②与③均需要用Ca2+处理受体细胞 C．过程④体现了植物细胞的全能性 D．转基因番茄是否培育成功可通过接种病毒进行鉴定 【典例2】（25-26高三上·北京通州·期末）为获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建含抗病基因D的重组Ti质粒，如下图，将重组质粒导入水稻愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是（　　） A．构建该重组质粒需要用限制酶和RNA聚合酶 B．将重组质粒用显微注射法转化入水稻愈伤组织 C．用含潮霉素的培养基筛选成功转化的愈伤组织 D．含D基因的幼苗都能稳定表现抗白叶枯病性状 【典例3】（25-26高三上·北京昌平·期末）为实现水稻产量提升，科研人员构建含有动物来源的肥胖基因FTO cDNA的T-DNA序列如下图，用于将FTO转入水稻细胞，下列说法错误的是（    ） A．T-DNA可携带FTO整合到水稻细胞染色体DNA上 B．可用含潮霉素的培养基筛选含重组Ti质粒的农杆菌 C．Flag与FTO串联便于通过抗原抗体杂交检测目标蛋白 D．构建该T-DNA需用到逆转录酶、限制酶、DNA连接酶 【典例4】（25-26高三上·北京·月考）用限制酶SpeⅠ和HindⅢ切割质粒，用限制酶HindⅢ和XbaⅠ切割目的基因，之后连接，构建基因表达载体。下列叙述不正确的是（    ） 限制酶 SpeⅠ HindⅢ XbaⅠ 识别序列 5＇-A↓CTAGT-3＇ 3＇-TGATC↑A-5＇ 5＇-A↓AGCTT-3＇ 3＇-TTCGA↑A-5＇ 5＇-T↓CTAGA-3＇ 3＇-AGATC↑T-5＇ A．青霉素抗性基因可作为筛选标记 B．限制酶可使磷酸二酯键发生断裂 C．表中限制酶切割之后均会产生黏性末端 D．连接后的基因表达载体可被SpeⅠ切开 【典例5】（2025·北京·模拟预测）下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（　　） A．①中Ti质粒应该包含标记基因、复制原点等元件 B．②的构建需要使用限制性核酸内切酶和DNA聚合酶 C．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 D．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 核心串讲2 PCR技术和蛋白质工程 一、PCR技术 1.概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2.条件 DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链 DNA两条母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 Taq DNA聚合酶 催化合成DNA子链 与两条母链结合的2种引物 使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 3.PCR原理：DNA的半保留复制。 4.扩增过程 【易错提醒】 （1）DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只有当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶才能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 （2）缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，四种脱氧核苷酸，分别与两条模板链相结合的两种引物，耐高温的DNA聚合酶。 （3）PCR和细胞内复制的不同点 PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。 二、蛋白质工程 1. 基本原理 （1） 天然蛋白质合成的过程 ①原理：按照中心法则进行。 ②过程：基因→表达(转录和翻译)→形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。 （2）蛋白质工程的基本思路 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 【典例1】（2025·北京通州·一模）利用转基因技术将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到表达Gata3 - GFP蛋白质的杂合子小鼠，交配获得Gata3 - GFP基因纯合子小鼠。为鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B．翻译时先合成GFP蛋白，再合成Gata3蛋白 C．2号小鼠是Gata3 - GFP基因的纯合子，4号小鼠是野生型 D．用引物1和引物3进行PCR，能更好区分杂合子和纯合子 【典例2】（24-25高三上·北京昌平·期末）人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因（下图），下列说法错误的是（   ） A．可通过人工合成获取突变型目的基因 B．上述方法可将待突变序列改造成5'-AAGCCC-3’ C．需要在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸 D．通过电泳检测PCR产物，可确定基因是否改造成功 【典例3】（2024·北京昌平·二模）下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ） A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 【典例4】（2024·北京丰台·二模）为研究玉米的抗逆机制，科研人员利用图中的双分子荧光互补技术分析玉米M5与B72蛋白的相互作用。下列说法正确的是（　　） A．直接将YFP剪切为N端和C端后，分别与M5和B72蛋白连接 B．设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因 C．将M5和B72基因融合后连接到质粒上的YFP基因中 D．将含有M5和B72的基因表达载体分别导入不同细胞中 【典例5】（24-25高三上·北京朝阳·期末）IL-17A是一种细胞因子，在银屑病等自身免疫病的发病机制中发挥关键作用。我国科研人员研发了抗IL-17A人源-鼠源重组单克隆抗体。以下关于该抗体制备过程的叙述正确的是（    ） A．用IL-17A注射小鼠，从小鼠血清中分离出B细胞 B．用灭活病毒诱导小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞 C．用克隆化培养和PCR技术筛选出能分泌抗IL-17A抗体的杂交瘤细胞 D．用蛋白质工程技术直接将鼠源抗IL-17A抗体中的部分氨基酸序列替换为人源的 能力1 PCR技术拓展 1.逆转录PCR(简称RT-PCR):是从mRNA获得cDNA(互补DNA)并进行扩增的一种实验技术。进行逆转录PCR的步骤： 2.实时荧光定量PCR(简称qPCR):在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 ①qPCR试剂盒：通常都应该含有检测者mRNA、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Taq Man探针、引物、dNTP、Mg²+等。这种qPCR检测具有特异性和高灵敏性的特点，主要与试剂盒中的引物、Taq Man探针有关。 ②Taq Man探针：是qPCR技术中的一种常用探针，是一小段可与靶DNA序列互补的脱氧核苷酸单链。 a.结构 b.荧光原理：当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R,R发出荧光信号，能被相应仪器检测到。 ④结果：每扩增1个DNA分子，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可测得Ct值，如图所示(Ct值表示达到荧光阈值所经历的循环次数，该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。 三、PCR定点突变技术 1.原理：通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。 2.类型 （1）大引物PCR:该技术需要用到三条引物进行两轮PCR,这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 （2）重叠延伸PCR:该技术需要使用四条引物。引物2和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 因此，分别利用引物1和引物2,引物3和引物4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和引物3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 【典例1】东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 (1)研究发现，东方果蝇中dsx基因 出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 (2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是 （选填字母）。 ②由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为 （填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 。 (3)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的端和端 ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）， ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 ，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 热点情境01 基因编辑猪器官移植 情境解读： 器官短缺是全球性难题，每年数百万患者因无法匹配供体而死亡。基因编辑猪因其器官大小、生理功能与人类相似，且可通过CRISPR等技术改造以降低免疫排斥和病毒风险，成为异种移植的理想供体。近年来，中美科学家在心脏、肾脏、肝脏、肺等多个器官上取得里程碑式进展。 中国团队在2025年3月率先完成世界首例基因编辑猪肝脏移植至脑死亡受体，猪肝在体内正常分泌胆汁、维持血流，10天内未见排异或病毒感染。同年10月，中国再次实现世界首例活人猪肝脏移植，患者携带辅助猪肝存活171天，虽最终因上消化道出血去世，但证明了猪肝可在人体内发挥代谢与凝血功能。 中国也于2025年完成亚洲首例终末期肾病患者猪肾移植，69岁刘阿姨术后60天状态良好，无需透析，标志着国产基因编辑猪肾进入临床验证阶段。 此外，中国还完成了世界首例基因编辑猪肺移植至脑死亡受体，维持通气功能达9天。 1. 技术手段： （1） 基因编辑技术：目前主要采用CRISPR-Cas9等基因编辑工具，对供体猪的基因组进行“敲除”和“插入”操作。 （2） 体细胞克隆技术-批量复制“合格供体”。 （3）免疫耐受与抗排斥技术-术后“保驾护航”。 2.技术核心：如何让猪器官“骗过”人体免疫系统？ （1）敲除致排异基因：如GGTA1、CMAH、B4GALNT2，这些基因表达的糖类抗原会引发人体强烈免疫攻击。 （2）插入人类保护基因：如CD46、CD55（抑制补体激活）、THBD、PROCR（调节凝血）、CD47（“别吃我”信号）等，帮助器官逃避免疫清除。 （3）灭活内源性逆转录病毒（PERV）：通过CRISPR技术使猪基因组中所有PERV失活，防止跨物种感染。 3.当前挑战 （1）基因编辑的“艺术”与平衡： ①编辑数量的“度”，并不是改得越多越好； ②未知抗原的“盲区”： 即使经过多基因编辑，人体血清中仍可能检测到针对猪细胞的未知抗体； ③个体差异： 即使是经过相同基因编辑的“克隆猪”，在不同受体身上表现也不一致，有的长期存活，有的却迅速排斥，这种不确定性是临床应用的巨大障碍。 （2） 免疫排斥 ①抗体介导的排斥（AMR）： 这是目前导致移植失败的主因。 ②免疫抑制剂的“双刃剑”： 为了压制排斥，患者必须服用强效免疫抑制剂。 （3） 生物安全与跨物种感染 ①内源性逆转录病毒（PERV）： 这种病毒的基因片段镶嵌在猪的基因组中，虽然目前通过基因编辑和隔离饲养降低了风险，但理论上仍存在病毒复活并感染人类、甚至造成公共卫生风险的可能。 ②未知病原体： 猪身上可能携带对猪无害但对人致命的未知病毒或病原体，跨物种传播的风险需要长期观察。 典型例题： 1.2024年，全球首例接受经过CRISPR/Cas9基因编辑的猪肾脏移植手术取得成功。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪肾脏进行了基因编辑（敲除α-Gal基因，过程如图1）。CRISPR/Cas9工具主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图2。下列相关叙述错误的是（　　） A．图1中受体细胞通常选择受精卵，注入受体细胞的常用方法是显微注射法 B．α-Gal基因控制的蛋白质可能是猪的主要组织相容性抗原 C．Cas9蛋白相当于限制酶，能作用于脱氧核糖和碱基之间的磷酸二酯键 D．不同的向导RNA（sgRNA）需要根据目标基因设计不同识别序列 01 基因工程 1.（25-26高三上·北京通州·期末）在高中生物学基础实验中，需要在严格无菌条件下进行的是（　　） A．从新鲜菜花中粗提取DNA B．将外植体接种到培养基上 C．使用PCR仪扩增目的基因 D．对酵母菌进行显微计数 2.荒漠植物的 Z 基因与其抗旱性强有关。科学家利用 Z 基因和农杆菌的 Ti 质粒（如图，T-DNA 为可转移的 DNA）构建表达载体，培育抗旱转基因小麦。下列说法错误的是（　　） A．T-DNA 能整合到小麦细胞染色体上 B．可用限制酶 ClaⅠ和 SacⅠ处理 Z 基因 C．可用卡那霉素筛选含重组 Ti 质粒的农杆菌 D．可在个体水平检测小麦是否获得抗旱性状 3.（2025·北京西城·一模）化疗会造成癌症病人血小板减少，血小板生成素（TPO）可促进血小板产生。研究人员将含人TPO基因的表达载体导入中国仓鼠卵巢细胞中，获得有生物活性的TPO并应用于临床。下列叙述不正确的是（　　） A．构建表达载体需要解旋酶和DNA聚合酶 B．用PCR技术可获取和扩增人TPO基因 C．表达载体包括TPO基因、标记基因、启动子和终止子等 D．用抗原—抗体杂交技术可检测TPO基因的表达情况 4.（2025·北京大兴·模拟预测）由于基因工程技术打破了原有物种间的生殖隔离，将遗传关系较远的外源基因导入到一个新的遗传背景，因此如何保障转基因植物的环境安全成为人们广泛关注的热点问题。下列做法错误的是（　　） A．利用农杆菌转化法将抗虫基因导入烟草叶绿体中 B．利用种子特异启动子启动不育基因表达 C．利用基因编辑技术将选择标记基因敲除 D．利用PCR向花瓣发育相关基因引入突变，将植物改造为闭花受精 5．（2025·北京海淀·二模）为合成出局部为双链的RNA用于沉默特定基因，先将目的基因X从重组质粒pHIBS切割出来，再巧妙地连接到质粒载体pUAST中，如下图，其中质粒只展示了局部。 下列叙述正确的是（　　） A．该操作过程中还需要DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 B．利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST连接 C．基因X的DNA片段需要完整保留启动子和终止子区域 D．可以用E和Bg，或者Xh和K双酶切重组pUAST 6．（2025·北京西城·二模）根的向地性与生长素（IAA）分布不均有关。对IAA敏感的启动子与绿色荧光蛋白基因形成的融合基因在根中表达情况如图，下列叙述错误的是（　　） A．根的向地性利于植物吸收水分和无机盐 B．横放的根近地侧细胞生长速度大于远地侧细胞 C．可用农杆菌转化法将融合基因导入植物细胞中 D．绿色荧光的位置和强度代表IAA的分布和浓度 02 蛋白质工程 7.．（2025·北京顺义·一模）转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。相关叙述正确的是（    ） A．使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接 B．选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接 C．可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞 D．融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累 8.近年来，人工智能（AI）技术在蛋白质工程领域的应用取得了显著成果，不仅攻克了长期存在的蛋白质结构预测问题，还成功设计了多种新型功能蛋白，为多个领域带来了潜在的生物活性分子。下列说法正确的是（　　） A．蛋白质工程需要改造蛋白质分子的所有氨基酸序列 B．蛋白质工程的目标是改造现有蛋白质或创造新蛋白质 C．AI在蛋白质工程中的应用说明不再需要基因工程水平的操作 D．AI设计的蛋白质功能必然超过自然界中发现的任何蛋白质 9．（23-24高三下·北京延庆·阶段练习）研究发现，为心梗患者注射适量t-PA蛋白会诱发颅内出血，但若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，改良后的t-PA蛋白成为心梗和脑血栓的急救药。下图所示，通过基因工程大量制备改良药物t-PA蛋白，下列说法错误的是（    ） A．制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程 B．利用重组pCLY11质粒可获得牛乳腺生物反应器 C．选用限制酶XmaI和BglⅡ切割质粒pCLY11，构建重组质粒 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现蓝色 10.快速、准确地确定蛋白质的三维空间结构，一直是生命科学领域的研究热点和难点。人工智能程序AlphaFold 2对大部分蛋白质结构的预测极为精准，接近真实的蛋白质结构，达到了人类利用冷冻电镜等复杂仪器观察预测的水平。下列相关叙述不正确的是（ ） A．蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础 B．预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程 C．结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制 D．依据新蛋白质的氨基酸序列能推出唯一的基因序列 11．（25-26高三上·北京海淀·期中）科研人员利用相关技术改变了胰岛素β链的第9位氨基酸，从而避免了胰岛素结合成无活性的二聚体形式。下列相关叙述错误的是 （　　） A．胰岛素的本质是蛋白质，不宜口服使用 B．可通过测定DNA序列确定突变是否成功 C．该过程的操作对象是胰岛素分子 D．对胰岛素结构的改造属于蛋白质工程 12．（20-21高三上·北京朝阳·期中）新冠病毒的表面棘突蛋白（S蛋白）的受体结合域（RBD）与人体细胞表面的ACE2受体相互作用感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白RBD紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列说法不合理的是（    ） A．LCB1的作用机理与S蛋白的抗体类似 B．LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计 C．LCB1是通过细胞中原有基因表达产生的 D．可用蛋白质工程进行LCB1的设计和生产 1.CRISPR/Cas9系统由向导RNA和Cas9蛋白组成，由向导RNA（gRNA）引导Cas9蛋白在特定的基因位点进行切割，从而完成基因的编辑过程，过程如图所示。现欲用CRISPR/Cas9编辑技术对轮状病毒（双链RNA病毒）进行编辑，下列相关叙述错误的是（　　） A．可以根据目标基因的碱基序列人工设计向导RNA B．Cas9类似于基因工程中的限制酶，其作用位点是磷酸二酯键 C．若向导RNA的序列为5'-UCACAUC-3'，则其识别的基因靶序列为3'-AGTGTAG-5' D．向导RNA的碱基序列越短，则其在基因上出现定位错误的概率越高 2.微生物DNA分子中腺嘌呤会被甲基化酶修饰，腺嘌呤的甲基化会影响不同限制酶的切割情况，下表是腺嘌呤甲基化前后某些限制酶切割的情况。下列叙述错误的是（　　） 限制酶 识别序列 甲基化前 甲基化后 TaqI 5'-T↓CGA-3' 切割 不切割 DpnI 5'-GA↓TC-3' 不切割 切割 ClaI 5'-AT↓CGAT-3' 切割 不切割 BamHI 5'-G↓GATCC-3' 切割 切割 A．DNA腺嘌呤的甲基化并不会改变生物基因的碱基序列 B．DNA腺嘌呤甲基化可能导致限制酶切割的特异性降低 C．通过甲基化关闭某些酶切位点时可能打开新的酶切位点 D．基因工程操作过程中最好选用对甲基化不敏感的限制酶 3.（25-26高三上·北京朝阳·期中）人乳头瘤病毒（HPV）通过促进子宫颈细胞p53蛋白降解和pRb蛋白失活，导致细胞生长分裂失控，诱发宫颈癌。下列分析错误的是（    ） A．p53基因和pRb基因应属于抑癌基因 B．子宫颈细胞癌变后细胞膜上的糖蛋白增多 C．可利用核酸分子杂交技术检测HPV感染 D．机体通过免疫监视功能清除突变子宫颈细胞 4.（2025·北京昌平·二模）H18杂交瘤细胞能够产生抗人肝癌单克隆抗体，但该细胞在培养过程中的凋亡现象制约着其生产能力的提高。Bcl-XL是一种抗凋亡蛋白，利用Bcl-XL基因改造杂交瘤细胞，获得了稳定表达Bcl-XL的杂交瘤细胞。下列说法错误的是（　　） A．制备H18杂交瘤细胞利用了动物细胞融合技术 B．利用产生特定抗体的B细胞与瘤细胞制备H18杂交瘤细胞 C．将Bcl-XL基因直接注射至H18杂交瘤细胞可实现稳定表达 D．经筛选可获得既抗凋亡又能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞 5．（24-25高三上·北京石景山·期末）多囊肾病（PKD）是一种单基因显性遗传病，致病基因位于常染色体上。对某患者相关基因进行检测，得到2种序列（如下图）。图中限制酶E的识别序列为GATATC。下列判断正确的是（　　） A．致病基因碱基序列的改变导致密码子由GAT变为AAT B．用限制酶E切割该患者的基因，得到2种不同长度的片段 C．对患病家系进行调查，统计获得该病在人群中的发病率 D．若该患者与正常人婚配，生育患PKD男孩的概率为1/4 6．（24-25高三上·北京丰台·期末）分生孢子是真菌产生的一种无性繁殖体。科研人员对麦根腐平脐蠕孢中与分生孢子形成相关的Bsb基因进行研究，构建了Bsb基因缺失突变体Bsb-n和在此基础上重新导入Bsb基因的回补实验株Bsb-c，检测相关指标，结果如图。下列叙述不正确的是（    ） A．麦根腐平脐蠕孢通过减数分裂产生分生孢子 B．Bsb基因可调控分生孢子的产生量使其降低 C．获得Bsb-n和Bsb-c都需构建基因表达载体 D．Bsb-c组是为了进一步验证Bsb基因的功能 7．（24-25高三上·北京·期中）科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，Ti质粒如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．农杆菌的拟核基因与番木瓜基因发生重组 B．构建重组质粒均需使用限制酶和DNA聚合酶 C．含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D．转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 8．（24-25高三上·北京朝阳·期中）我国科学家开发了一种利用自体肝细胞治疗遗传性肝病的新技术（如图）。用基因编辑技术对体外培养的患者肝细胞进行基因修复后，将细胞移植给人酪氨酸血症模型小鼠，小鼠肝功能得到有效改善。相关叙述错误的是（    ） A．用胶原蛋白酶或胰蛋白酶处理可分散肝组织细胞 B．基因编辑工具使肝细胞内致病基因修复为正常基因 C．此过程利用显微注射技术将正常基因导入肝细胞 D．使用免疫缺陷小鼠可避免异种移植引发的免疫排斥 9．（2024·北京·模拟预测）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建重组质粒，并转化到受体菌中。下列叙述不正确的是（    ） A．若用HindⅢ酶切，通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒 B．若用PvuⅠ酶切，在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因 C．若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得正确的重组质粒 D．若用ScaⅠ酶切，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建是否成功 10．（2024·北京海淀·一模）双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 11．（25-26高三上·北京房山·期末）水稻杂交后代具有高产等杂种优势，科研人员欲利用花药发育不良、花粉败育的雄性不育系培育杂交种。 (1)研究人员在野外发现一株稳定遗传的细胞核雄性不育突变体，基因型记作rr，将该突变体与野生型可育水稻杂交，F1均表现可育，F1自交得到的F2中雄性不育株占 ，F2可育植株中，自交后代不会出现性状分离的个体占 。 (2)传统育种时，用三系法保持水稻的雄性不育系。下表为三系水稻的基因型及育性。 三系水稻 保持系 不育系 恢复系 基因型 N（rr） S（rr） N（RR）、S（RR） 育性 可育 不育 可育 注：N-质可育基因，R-核可育基因，S-质不育基因 ①三系法杂交稻育种中，雄性不育株作为 （填“父本”或“母本”）与恢复系水稻杂交得到可育的杂种F1用于大田生产。 ②写出繁育雄性不育系的杂交过程。 (3)现有可育的优良品系甲和乙，可用于生产杂交水稻。为简化育种过程，研发了Bn-Bs核基因雄性不育系统。其中核糖核酸酶基因（Bn）表达产物可以水解RNA，Bs基因表达的产物能特异性抑制Bn蛋白的活性。为利用Bn-Bs系统制备转基因的甲品系植株，设计出图1所示的表达载体。 注：启动子1在植物体所有细胞中都能持续、稳定地启动连接基因表达。 ①结合转基因植株表型分析，启动子2应为 启动子，从而获得雄性不育株。 ②T-DNA在染色体上是随机插入的，研究人员使用NcoⅠ酶对转基因植株的基因组DNA进行酶切、电泳，以Bn基因作探针进行DNA分子杂交，结果如图2。由此判断， 号植株为单基因插入，是育种的理想品系（甲-Bn）。 ③利用表达载体2将Bs基因定点整合到乙品系（与甲品系Bn基因位点相同）中，获得纯合的乙-Bs。研究人员利用Bn-Bs系统制备具有杂种优势的杂合种子，如下表所示。 阶段一 阶段二 阶段三 方法一 方法二 甲-Bn×甲 ↓ F1 将F1种成母本行，将乙-Bs种成父本行 F1与乙-Bs混种 将获得的种子用于大田生产 幼苗长出后喷洒除草剂 分行收取种子 从所有植株上收取种子 科研人员选择 中的种子用于阶段三大田生产，理由是 。 12．（25-26高三上·北京通州·期末）经典的孟德尔遗传规律和自然选择限制了对野生植物种群进行基因改造，因为某些对人类有利的性状对植物自身是不利的，研究者开发了CAIN技术解决这一难题。 (1)Cas9-gRNA系统是基因编辑的重要工具，如图1所示，gRNA通过 原则识别并结合DNA上靶序列，同时招募Cas9蛋白对该靶序列进行切割，造成DNA损伤。 (2)基于Cas9-gRNA系统，研究者构建了CAIN技术，其载体结构如图2所示。DMC1启动子可以驱动Cas9基因和gRNA序列的转录，进而特异性地破坏花粉萌发的必需基因NPG1；同时需要引入“基于同义密码子替换靶序列的NPG1基因”（简称NPG1-ty基因），NPG1-ty基因的具体功能是 。为了将NPG1-ty基因重组到C载体中，需要用到的限制酶是 ，重组后的载体称为CAIN载体。 注：同义密码子是指同一氨基酸被多个不同密码子编码。DMC1是雄蕊花粉母细胞特异启动子。TPD1是花粉细胞特异启动子。 (3)科学家用 方法，将1个CAIN载体导入到植物拟南芥染色体中，且转入的CAIN载体稳定存在并表达。以该转基因植株作为父本，以野生型为母本进行人工授粉，F1中携带CAIN载体的比例为 。 (4)结合所学知识，有关本研究的表述中正确的是_______。 A．Cas9-gRNA功能类似“解药”，NPG1-ty功能类似“毒药” B．通过特异性抗体，能够区分NPG1和NPGI-ty基因表达的蛋白质 C．CAIN技术可用于破坏外来入侵植物的育性相关基因，控制入侵植物数量 D．CAIN技术被不当使用会影响生物安全，因此需要进行严格的监管和论证 13．（25-26高三上·北京朝阳·期末）炎症性肠病是一种常见的肠道疾病，目前诊断主要依赖侵入性的肠镜检查。研究者利用大肠杆菌尼氏菌株（EcN），构建可响应肠道炎症标志物硫代硫酸盐的益生菌传感器，以实现该疾病的无创超声成像检查。 (1)大肠杆菌是一种常见的微生物，常被改造为基因工程菌，其原因包括 （写出2点）。 (2)为实现超声成像，研究者将声学报告基因（ARG）导入EcN。ARG编码的蛋白组装成气囊能产生超声信号。图1为硫代硫酸盐感应及ARG表达调控的示意图。 S和R基因的启动子是 （填“组成型”或“硫代硫酸盐诱导型”）。硫代硫酸盐作为 与膜传感器激酶S结合，进而磷酸化响应调节蛋白R，磷酸化的R蛋白形成 后结合P启动子激活ARG基因表达。 (3)为进一步提高传感器的灵敏度，研究者引入了Bxb1重组酶系统（如图2）。该系统在感应硫代硫酸盐后，表达Bxb1重组酶，催化attB与attP位点之间的不可逆重组。 ①与图1相比，Bxb1重组酶系统的引入使传感器的信号强度“不可逆放大”，其机制是 。 ②温度响应型终止子TR在37℃（体温）条件下失活。Bxb1上游加入TR的作用是 。 (4)将优化后的传感器应用于肠道炎症诊断，采用“先定植-后检测”的模式（先口服工程益生菌，24小时后超声检查），检测效果显著优于“口服后立即检查”。推测“先定植-后检查”模式效果好的原因 。 (5)在ARG基因后添加attB-P7-attP-抗炎蛋白基因模块可实现 。 14．（25-26高三上·北京东城·期末）已有研究发现，N蛋白(一种RNA甲基转移酶)在多种癌细胞中表达上调，具有促进癌细胞增殖和转移的作用，对其机制展开研究。 (1)N蛋白可以结合靶基因的相应RNA片段，使其胞嘧啶发生甲基化(修饰)，导致RNA稳定性提高，相应蛋白含量增加，此时RNA的碱基序列 (填“改变”或“不改变”)。 (2)为寻找N蛋白调控肝癌发生的靶基因，研究者对肝癌细胞进行mRNA相关水平的检测，筛选出11个候选基因。写出图1中的筛选指标 。 (3)进一步研究确定了P基因为N蛋白的靶基因。培养过表达N蛋白的肝癌细胞，收集细胞裂解液，利用图2技术进行验证。对照组加入无关抗体和磁珠组成的复合物，实验组应加入 ，一段时间后，用磁力架吸取磁珠并提取磁珠复合物上的RNA，逆转录后利用PCR技术检测 。 (4)细胞呼吸中葡萄糖分解为丙酮酸的过程称为糖酵解，P基因编码该过程中的一种关键酶。糖酵解产生的某些物质会向细胞外释放，利用癌细胞进行实验，结果如图3. ①加入2-DG后，阶段三数值恢复至初始水平，该操作的目的是 。 ②该实验为“N蛋白促进癌细胞的增殖和转移是通过调控P基因实现”提供了证据，请解释说明 。 1．（2022·北京·高考真题）下列高中生物学实验中，对实验结果不要求精确定量的是（　　） A．探究光照强度对光合作用强度的影响 B．DNA的粗提取与鉴定 C．探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度 D．模拟生物体维持pH的稳定 2．（2020·北京·高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 3．（2025·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）~（4）题。 野生动物个体识别的新方法 识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年，人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA，PCR扩增特定的DNA片段，测定产物的长度或序列，据此可识别个体，在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。 微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段，广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列，每个重复单位长度为2~6bp（碱基对），重复数可以达到几十个（图1）．基因组中有很多个微卫星DNA，分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”，能组成多种“基因型”．分析多个微卫星“基因”，可得到个体特异的“基因型”组合，由此区分开不同的个体。 依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列（图1），设计并合成特异性引物，PCR扩增后，检测扩增片段长度，即可得知所测个体的“等位基因”（以片段长度命名），进而获得该个体的“基因型”。例如，图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图，个体A的“基因型”为177/183。 有一个远离大陆的孤岛，陆生哺乳动物几乎无法到达，人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便，提取DNA，扩增并分析了10个微卫星“基因”，结果在30份样品中成功鉴定出个体（如表）。几个月后再次采集貉的新鲜粪便，进行同样的分析，在40份样品中成功鉴定出个体（如表）。据此，科学家估算出该岛上貉的种群数量。 两次采样所鉴定出的貉的个体编号 第一次采集的30份粪便样品所对应的个体编号 N01 N02 N03 N04 N05 N06 N07 N08 N08 N09 N10 N11 N12 N12 N13 N14 N14 N15 N16 N17 N18 N18 N19 N20 N21 N22 N22 N23 N24 N24 第二次采集的40份粪便样品所对应的个体编号 N03 N04 N05 N08 N09 N09 N12 N14 N18 N23 N24 N25 N26 N26 N26 N27 N28 N29 N30 N30 N31 N32 N32 N33 N33 N33 N34 N35 N36 N37 N38 N39 N40 N41 N42 N43 N44 N44 N45 N46 (1)图2中个体B的“基因型”为 。 (2)使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和 的数目决定的。 (3)科学家根据表1信息，使用了 法的原理来估算这个岛上貉的种群数量，计算过程及结果为 。 (4)在上述研究基础上，利用现有DNA样品，设计一个实验方案，了解该岛貉种群的性别比例 。 4．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。 5．（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。 (1)嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生 ，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的 将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。 (2)初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于 序列所编码的蛋白区段。 (3)为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由 组成。 (4)在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。 如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因 。 6．（2022·北京·高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 (1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。 (2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。 (3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子： 。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因： A．GFP    B．Gal4    C．雌激素受体基因（ER）  D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） (4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后 造成不育。 (5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是 。 7．（2020·北京·高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 （1）纤维素属于 糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是 。 （2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为 。 （3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是 。 （4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为 。 （5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用 。（举一例） / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题13 基因工程 ( 目录 第一部分 知识网络构建 思维导航，融会贯通 第二部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第三部分 核心知识串讲 核心串讲 串讲 1 基因工程 串讲 2 蛋白质工程 能力进阶 能力1 PCR技术拓展 热点情境 基因编辑猪器官移植 第四部分 分层精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 基因工程 题型02 蛋白质工程 B组· 增分能力练 第五部分 真题 实战进阶 对标高考，感悟考法 ) （附思维导图图片） 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程 （2025北京卷）PCR扩增的原理与过程 （2024北京卷）PCR扩增的原理与过程 （2023北京卷）基因工程基本操作 1. 科研情境从"模拟"转向"真实"：直击前沿研究一线； 2. 基因编辑技术 3. 开放性实验 新风向演练 1．【新考法-无缝克隆技术】无缝克隆技术(In—Fusion技术)是一种先进的DNA重组技术，用于将目标DNA片段插入载体中。如图为利用无缝克隆In—fusion技术构建含P基因的重组载体，P基因左右两侧的序列是不同的。In—fusion酶具有3'→5'外切酶活性，从DNA的3'端切除15个核苷酸，进而出现单链区域，最终实现目的基因与线性化质粒连接。下列关于该技术的叙述错误的是（　　） A．推测In—Fusion酶可替代限制酶和DNA连接酶用于构建重组载体 B．选用引物1和4进行PCR2，从而获得线性化质粒 C．按照以上流程构建图示重组载体时，可避免目的基因与载体的反向连接 D．当目的基因内部有多种限制酶识别序列时，In—Fusion技术将无法使用 【答案】D 【详解】A、根据题意，In-Fusion酶可以替代限制酶和DNA连接酶，用于构建基因表达载体，A正确； B、观察图示，引物1和4分别位于质粒的两个不同位置，使用引物1和4进行PCR2时，可以扩增出包含两个15bp互补序列的线性化质粒。而引物2和3位于质粒内部，若使用它们进行PCR2，会导致质粒环化或无法获得所需线性化产物，B正确； C、P基因左右两侧序列不同，通过PCR1扩增后，两端形成的单链区域具有特异性；线性化质粒两端的单链区域仅能与P基因对应端的单链互补结合，无法反向互补，因此可避免反向连接，C正确； D、当目的基因内部有多种限制酶识别序列时，将无法使用限制酶构建重组载体，但可设计15bp末端序列，使用In-Fusion酶来构建，D错误。 故选D。 2．【新载体-融合表达】为治理水体镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子，如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．对目的基因进行PCR扩增时，因参与反应而浓度下降的组分只有脱氧核苷酸和引物 B．为避免CADR、GP1、YFP基因错误连接，需向GP1基因两端分别添加XbaI和SmaI的识别序列 C．可根据黄色荧光来筛选融合蛋白表达成功的衣藻，但基因工程成功与否还需通过测定镉吸收率来鉴定 D．相较于直接投加化学药剂处理镉污染，该治理法的优势在于能够持续吸附镉离子并具备自我增殖能力 【答案】B 【详解】A、PCR扩增过程中，脱氧核苷酸作为原料被消耗，引物与模板结合后延伸，浓度也会下降，其他组分(如Taq酶、缓冲液)浓度基本不变，A正确； B、为避免CADR、GP1、YFP基因错误连接，需向三个基因两端添加不同的限制酶识别序列，因Nbe Ⅰ和Xba Ⅰ酶切后产生的黏性末端相同，因此向CADR基因两端添加 Xba Ⅰ和Sma Ⅰ识别序列，向GP1两端添加Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ识别序列来避免错误连接，B错误； C、YFP为黄色荧光蛋白，可根据细胞表面是否呈黄色荧光筛选融合蛋白表达成功的衣藻；但基因工程的核心目标是吸附镉离子，因此还需测定镉吸收率鉴定工程是否成功，C正确； D、转基因衣藻可自主增殖，持续吸附镉离子，相较于直接投加化学药剂，具有可持续性且对环境影响更小，D正确。 故选B。 3．【新情境-系统性红斑狼疮】科研人员将ETS1基因中①②之间的片段（图1）切除，从而获得雌雄各一头系统性红斑狼疮（SLE）猪（亲本），并分别使用荧光标记的P1、P2、P3三种探针对两者的个体甲、乙、丙进行基因检测，结果如图2所示，相关基因用E/e表示。下列叙述错误的是（　　） A．亲本雌雄猪的基因型分别为Ee、Ee B．图2中Ⅰ、Ⅱ使用的探针分别是P2、P3 C．只有的乙才是纯合SLE模型猪 D．中含大条带与小条带的猪占1/2 【答案】B 【详解】A、因e基因是E基因敲除部分外显子得到的，故大条带（分子量大）表示E基因，小条带（分子量小）表示e基因。亲本交配后子代出现不同条带组合，说明亲本都是杂合子，基因型均为Ee，A正确； B、据图1可知，P1与外显子1附近序列结合，P2与外显子6附近序列结合，P3与外显子12附近序列结合，E基因和e基因都含有外显子1和外显子12，所以探针P1、P3与E基因序列结合能形成大条带，与e基因序列结合形成小条带，而e基因因外显子6缺失无法与探针P2结合，图2-Ⅰ中甲只有大条带，丙有大条带和小条带，乙只有小条带，故甲、乙、丙的基因型分别为EE、ee和Ee，因此Ⅰ使用的探针为P1或P3，图2-Ⅱ中甲、丙只有大条带，乙无条带，故Ⅱ使用的探针为P2，B错误； C、乙的基因型为ee，该个体没有正常的基因，因而为纯合的SLE疾病模型猪，C正确； D、亲本基因型为Ee，的基因型理论比为EE∶Ee∶ee=1∶2∶1，故中含大条带与小条带的猪占1/2，D正确。 故选B。 4．【新载体-实验探究】科研人员发现BbCUC蛋白与野生型球孢白僵菌（WT）分生孢子的形成有关，利用基因工程获得了BbCUC蛋白编码基因敲除菌株△BbCUC和超量表达菌株BbCUCOE，并将BbCUC基因导入△BbCUC获得回补菌株BbCUCCOM。将等量菌株分别接种在相同且适宜的培养基上，统计相关数据，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．构建BbCUCOE菌株时可将BbCUC基因的启动子替换为活性更强的启动子 B．BbCUC基因通过促进球孢白僵菌产孢结构的发生促进分生孢子的形成 C．可以利用抗原-抗体杂交技术检验目的菌株是否构建成功 D．BbCUCCOM表型并未完全与WT一致，说明导入后可能影响其他基因表达 【答案】B 【详解】A、超量表达菌株构建常采用强启动子(如组成型或诱导型高效启动子)替代原启动子，以增强目的基因转录水平，A正确； B、根据柱状图，BbCUC蛋白编码基因敲除菌株△BbCUC的分生孢子数量和产孢结构平均数量都高于野生型，说明BbCUC基因通过抑制球孢白僵菌产孢结构的发生抑制分生孢子的形成，B错误； C、Western-blot(抗原-抗体杂交)可检测BbCUC蛋白有无及表达量差异，是验证基因敲除、超表达及回补效果的可靠手段，C正确； D、回补菌株表型未完全恢复，可能因随机插入导致邻近基因表达受影响、拷贝数变异或表观遗传修饰，该解释合理，D正确。 故选B。 5．【新情景-基因编辑】2025年，科研团队为了培育适用于异种器官移植的基因编辑猪，利用碱基编辑器（利用碱基互补配对原理，在特定位点操作可对单个碱基进行编辑）对猪的基因组进行精准修饰，敲除了猪内源性逆转录病毒基因（PERV），避免患者受PERV感染，敲除了GGTA1、βGALNT2、CMAH等基因，以减少抗原暴露，降低免疫排斥风险。同时插入CD46、CD55、TBM等基因，以增强人源基因表达、提升异种移植相容性。其中敲除PERV及插入CD46基因的操作流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．设计sgRNA时需与PERV基因和CD46基因的序列互补，以实现精准编辑 B．碱基编辑器的作用是切断猪基因组DNA双链，为CD46基因插入提供位点 C．替换图中sgRNA序列，即可用碱基编辑器进一步敲除GGTA1等基因 D．该基因编辑猪的器官移植到人体后，PERV引发的免疫排斥将完全消除 【答案】C 【详解】A、sgRNA可通过碱基互补配对原则与PERV基因特定序列结合，从而对PERV基因进行精准编辑，但CD46基因是要插入，并非与sgRNA互补，A错误；    B、由题干信息可知，碱基编辑器是对单个碱基进行编辑，并非切断猪基因组DNA双链，B错误；    C、因为碱基编辑器能在特定位点对单个碱基进行编辑，所以替换图中sgRNA序列，就可用碱基编辑器进一步敲除GGTA1等基因，C正确；    D、该基因编辑猪敲除PERV基因可避免患者受PERV感染，但仅敲除PERV基因不能使PERV引发的免疫排斥完全消除，D错误。 故选C。 核心串讲1 基因工程 一、基因工程的工具 1．限制酶 (1)存在:主要是原核生物中,部分真核细胞中也存在,如酵母菌。 (2)作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 (3)形成末端的类型  2．DNA连接酶 (1)作用:将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 (2)种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 特点 只“缝合”黏性末端 黏性末端和平末端都可“缝合 相同点 都“缝合”磷酸二酯键 3．运载体 （1）作用：将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （2）种类 ①质粒（常用）：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ②动植物病毒 ③噬菌体 （3）运载体需具备的条件 ①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； ②有一个至多个限制酶切点； ③有某些标记基因； ④对受体细胞无害、易分离。 载体≠表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 【易错提醒】 载体≠表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 二、限制酶的选择技巧 1．根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 2．根据质粒的特点选择限制酶(如图) 3．根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 【易错提醒】 若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使目的基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。 三、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取 （1）方法：从基因文库中直接获取。基因文库类型:基因组文库（包含一种生物的所有基因）；部分基因文库（包含一种生物的一部分基因）（cDNA文库）。 （2）人工合成：逆转录法、化学合成法。 （3）利用PCR技术获取和扩增 2．基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使其能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体的组成和功能 3. 将目的基因导入受体细胞 （1） 导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法。 （2） 导入动物细胞：显微注射法。受体细胞：受精卵。 （3） 导入微生物细胞：Ca2+处理。可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 农杆菌转化法操作流程 4．目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 【典例1】（25-26高三上·北京石景山·期末）下图为农杆菌转化法培育转基因抗病毒番茄的过程示意图。下列叙述不正确的是（    ） A．过程①需要限制酶和DNA连接酶的参与 B．过程②与③均需要用Ca2+处理受体细胞 C．过程④体现了植物细胞的全能性 D．转基因番茄是否培育成功可通过接种病毒进行鉴定 【答案】B 【详解】A、过程①为构建基因表达载体，该过程需要限制酶切割目的基因和运载体，还需要DNA连接酶将目的基因和运载体连接起来，A正确； B、过程②将重组质粒导入农杆菌细胞时，需要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于感受态，便于吸收重组质粒；而过程③是将含有重组质粒的农杆菌导入番茄细胞，此过程不需要用Ca2+处理番茄细胞，B错误； C、过程④是将番茄细胞培育成番茄植株，该过程采用了植物组织培养技术，植物组织培养技术的原理是植物细胞具有全能性，C正确； D、要确定转基因番茄是否培育成功，可通过接种病毒来鉴定该植株是否具有抗病毒的特性，D正确。 故选B。 【典例2】（25-26高三上·北京通州·期末）为获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建含抗病基因D的重组Ti质粒，如下图，将重组质粒导入水稻愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是（　　） A．构建该重组质粒需要用限制酶和RNA聚合酶 B．将重组质粒用显微注射法转化入水稻愈伤组织 C．用含潮霉素的培养基筛选成功转化的愈伤组织 D．含D基因的幼苗都能稳定表现抗白叶枯病性状 【答案】C 【详解】A、构建重组质粒需要用限制酶切割目的基因和载体，然后用DNA连接酶连接，不需要RNA聚合酶，A错误； B、将重组质粒导入水稻愈伤组织常用农杆菌转化法，而显微注射法一般用于将目的基因导入动物细胞，B错误； C、由图可知，重组质粒中含有潮霉素抗性基因，所以可用含潮霉素的培养基筛选成功转化的愈伤组织，C正确； D、含D基因的幼苗不一定都能稳定表现抗白叶枯病性状，可能存在基因表达等问题，D错误。 故选C。 【典例3】（25-26高三上·北京昌平·期末）为实现水稻产量提升，科研人员构建含有动物来源的肥胖基因FTO cDNA的T-DNA序列如下图，用于将FTO转入水稻细胞，下列说法错误的是（    ） A．T-DNA可携带FTO整合到水稻细胞染色体DNA上 B．可用含潮霉素的培养基筛选含重组Ti质粒的农杆菌 C．Flag与FTO串联便于通过抗原抗体杂交检测目标蛋白 D．构建该T-DNA需用到逆转录酶、限制酶、DNA连接酶 【答案】B 【详解】A、 农杆菌转化植物时，Ti质粒的T-DNA会从农杆菌转移到植物细胞，并随机整合到植物染色体DNA 上，因此携带的FTO基因也会一同整合，A正确； B、图中潮霉素抗性基因的启动子是植物细胞特异性启动子（仅在植物细胞中启动转录），而农杆菌是原核生物，该启动子在农杆菌中无法激活潮霉素抗性基因的表达。因此，含重组Ti质粒的农杆菌仍对潮霉素敏感，无法在含潮霉素的培养基中存活，B错误； C、Flag是一种短肽标签，与FTO基因串联后，会表达出 “FTO 蛋白 + Flag 标签” 的融合蛋白。利用抗Flag的抗体进行抗原 - 抗体杂交，可高效检测FTO蛋白是否成功表达，C正确； D、逆转录酶：用于以动物FTO基因的mRNA为模板，逆转录合成cDNA（图中FTO以cDNA形式存在）。 限制酶：切割载体（Ti质粒的T-DNA区）和目的基因（FTOcDNA），产生互补黏性末端。 DNA连接酶：连接切割后的载体与目的基因，形成重组T-DNA，D正确。 故选B。 【典例4】（25-26高三上·北京·月考）用限制酶SpeⅠ和HindⅢ切割质粒，用限制酶HindⅢ和XbaⅠ切割目的基因，之后连接，构建基因表达载体。下列叙述不正确的是（    ） 限制酶 SpeⅠ HindⅢ XbaⅠ 识别序列 5＇-A↓CTAGT-3＇ 3＇-TGATC↑A-5＇ 5＇-A↓AGCTT-3＇ 3＇-TTCGA↑A-5＇ 5＇-T↓CTAGA-3＇ 3＇-AGATC↑T-5＇ A．青霉素抗性基因可作为筛选标记 B．限制酶可使磷酸二酯键发生断裂 C．表中限制酶切割之后均会产生黏性末端 D．连接后的基因表达载体可被SpeⅠ切开 【答案】D 【详解】A、青霉素抗性基因是质粒中的标记基因，表达产物能抵抗青霉素，故青霉素抗性基因可作为筛选标记，A正确； B、限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，B正确； C、由表格可知，这3种限制酶都是在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开，产生黏性末端，C正确； D、题干中用限制酶Spe Ⅰ切割质粒产生的黏性末端和用限制酶Xba Ⅰ切割目的基因产生的黏性末端遵循碱基互补配对，在DNA连接酶的作用下拼接起来，拼接起来的部分碱基序列为ACTAGA，而限制酶Spe Ⅰ识别的碱基序列为ACTAGT，所以连接后的基因表达载体不能被Spe I切开，D错误。 故选D。 【典例5】（2025·北京·模拟预测）下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（　　） A．①中Ti质粒应该包含标记基因、复制原点等元件 B．②的构建需要使用限制性核酸内切酶和DNA聚合酶 C．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 D．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 【答案】A 【详解】A、基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子、复制原点组成，A正确； B、构建载体需要限制酶和DNA连接酶，B错误； C、③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T-DNA整合到染色体上，C错误； D、染色体上含有目的基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，D错误。 故选A。 核心串讲2 PCR技术和蛋白质工程 一、PCR技术 1．概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2．条件 DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链 DNA两条母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 Taq DNA聚合酶 催化合成DNA子链 与两条母链结合的2种引物 使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 3．PCR原理：DNA的半保留复制。 4．扩增过程 【易错提醒】 （1）DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只有当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶才能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 （2）缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，四种脱氧核苷酸，分别与两条模板链相结合的两种引物，耐高温的DNA聚合酶。 （3）PCR和细胞内复制的不同点 PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。 二、蛋白质工程 1. 基本原理 （1） 天然蛋白质合成的过程 ①原理：按照中心法则进行。 ②过程：基因→表达(转录和翻译)→形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。 （2）蛋白质工程的基本思路 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 【典例1】（2025·北京通州·一模）利用转基因技术将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到表达Gata3 - GFP蛋白质的杂合子小鼠，交配获得Gata3 - GFP基因纯合子小鼠。为鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B．翻译时先合成GFP蛋白，再合成Gata3蛋白 C．2号小鼠是Gata3 - GFP基因的纯合子，4号小鼠是野生型 D．用引物1和引物3进行PCR，能更好区分杂合子和纯合子 【答案】C 【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合于Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5'→3'，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B错误； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C正确； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法区分杂合子和纯合子，D错误。 故选C。 【典例2】（24-25高三上·北京昌平·期末）人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因（下图），下列说法错误的是（   ） A．可通过人工合成获取突变型目的基因 B．上述方法可将待突变序列改造成5'-AAGCCC-3’ C．需要在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸 D．通过电泳检测PCR产物，可确定基因是否改造成功 【答案】D 【详解】A、在基因工程中，确实可以通过人工合成的方法获取目的基因，包括突变型目的基因，A正确； B、根据图示，正常引物延伸方向是从5'到3'，突变引物延伸方向也是从5'到3'，按照碱基互补配对原则，最终得到的突变序列应该是5'-AAGCCC-3’，B正确； C、PCR 技术需要在耐高温的 DNA 聚合酶（如 Taq 酶）作用下进行延伸，这是 PCR 技术的基本条件之一，C正确； D、PCR 产物电泳主要是用于检测 PCR 扩增是否成功，即是否得到了预期大小的 DNA 片段。但仅通过电泳检测 PCR 产物，并不能确定基因是否改造成功。基因改造成功与否不仅取决于是否扩增出特定片段，还涉及到基因序列的精确改变、是否插入或缺失特定碱基对、基因表达情况以及是否产生预期的功能变化等多方面。电泳只能直观呈现 DNA 片段的大小和数量，无法反映基因内部序列的精确改变以及功能上的变化，D错误。 故选D。 【典例3】（2024·北京昌平·二模）下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ） A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 【答案】A 【详解】 A、图示操作中不需要用限制酶处理目的基因，A错误； B、实现基因的定点诱变时，需要根据目的基因序列设计两种常规引物，以及根据拟突变位点处碱基序列的位置设计两种突变引物，图中属于突变引物的是引物2、3；与常规引物相比，图中的2、3两种引物必须要有一段互补的序列，可以进行碱基互补配对，而且应含有拟突变位点，否则无法实现进行PCR3筛选的突变产物的形成，B正确； C、进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，不需要另加引物。但是，若要获得大量目的基因需要进行PCR3，引物选择1、4，C正确； D、利用重叠延伸PCR技术实现了基因的定点诱变。可见，此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组，D正确。 故选A。 【典例4】（2024·北京丰台·二模）为研究玉米的抗逆机制，科研人员利用图中的双分子荧光互补技术分析玉米M5与B72蛋白的相互作用。下列说法正确的是（　　） A．直接将YFP剪切为N端和C端后，分别与M5和B72蛋白连接 B．设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因 C．将M5和B72基因融合后连接到质粒上的YFP基因中 D．将含有M5和B72的基因表达载体分别导入不同细胞中 【答案】B 【详解】AC、结合题意分析可知，该操作应该是将M5和B72基因分别连接在YEP蛋白对应的基因的5'端和3'端，AC错误； B、设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因，为构建基因表达载体作准备，B正确； D、将含有M5和B72的基因表达载体导入同一细胞中，D错误。 故选B。 【典例5】（24-25高三上·北京朝阳·期末）IL-17A是一种细胞因子，在银屑病等自身免疫病的发病机制中发挥关键作用。我国科研人员研发了抗IL-17A人源-鼠源重组单克隆抗体。以下关于该抗体制备过程的叙述正确的是（    ） A．用IL-17A注射小鼠，从小鼠血清中分离出B细胞 B．用灭活病毒诱导小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞 C．用克隆化培养和PCR技术筛选出能分泌抗IL-17A抗体的杂交瘤细胞 D．用蛋白质工程技术直接将鼠源抗IL-17A抗体中的部分氨基酸序列替换为人源的 【答案】B 【详解】A、在制备单克隆抗体的过程中，需要用特定的抗原（这里是IL−17A）注射到小鼠体内，使其产生免疫反应。然而，从小鼠血清中分离出的是抗体，而不是B细胞。B细胞是产生抗体的免疫细胞，它们位于小鼠的脾脏等免疫器官中，A错误； B、制备杂交瘤细胞时，通常使用灭活的病毒或化学试剂（如聚乙二醇）作为融合剂，诱导小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合。这个过程是制备单克隆抗体的关键步骤之一，B正确； C、在筛选出能分泌抗IL−17A抗体的杂交瘤细胞时，通常使用克隆化培养（即将单个杂交瘤细胞培养在多个培养皿中，以形成克隆）和特异性抗原-抗体反应（如使用IL−17A作为抗原进行抗体检测）来筛选。而PCR技术（聚合酶链式反应）是一种用于扩增特定DNA片段的技术，它不能用于筛选杂交瘤细胞，C错误； D、据题干信息分析可知，抗IL−17A人源-鼠源重组单克隆抗体是通过基因工程技术将鼠源抗体的基因与人源抗体的基因进行重组而获得的，而不是直接替换氨基酸序列。这种技术通常涉及将鼠源抗体的可变区（即与抗原结合的区域）与人源抗体的恒定区（即与效应细胞结合的区域）进行重组，以获得既具有特异性又降低免疫原性的抗体，D错误。 故选B。 能力1 PCR技术拓展 1．逆转录PCR(简称RT-PCR):是从mRNA获得cDNA(互补DNA)并进行扩增的一种实验技术。进行逆转录PCR的步骤： 2．实时荧光定量PCR(简称qPCR):在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 ①qPCR试剂盒：通常都应该含有检测者mRNA、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Taq Man探针、引物、dNTP、Mg²+等。这种qPCR检测具有特异性和高灵敏性的特点，主要与试剂盒中的引物、Taq Man探针有关。 ②Taq Man探针：是qPCR技术中的一种常用探针，是一小段可与靶DNA序列互补的脱氧核苷酸单链。 a.结构 b.荧光原理：当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R,R发出荧光信号，能被相应仪器检测到。 ④结果：每扩增1个DNA分子，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可测得Ct值，如图所示(Ct值表示达到荧光阈值所经历的循环次数，该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。 三、PCR定点突变技术 1．原理：通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。 2．类型 （1）大引物PCR:该技术需要用到三条引物进行两轮PCR,这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 （2）重叠延伸PCR:该技术需要使用四条引物。引物2和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 因此，分别利用引物1和引物2,引物3和引物4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和引物3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 【典例1】东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 (1)研究发现，东方果蝇中dsx基因______出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 (2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是______（选填字母）。 ②由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为______（填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是______。 (3)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的端和端_____ ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）， ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若______，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在______℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 【答案】(1)转录 (2) ad C 在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡 (3) 18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18 【详解】（1）转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，东方果蝇中dsx基因（DNA）通过转录形成前体RNA，故前体RNA是由dsx基因转录出的。 （2）①用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游和下游，根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是ad。 ②RTA基因表达出的蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为C。而在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡，因此雄性个体不会致死。 （3）①图2虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3’端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下： 。 ②由题意可知：RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）（全为转基因雄性果蝇）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若G1具有cs效应，则18℃组雄性个体所占比例小于29℃组。 ⅳ：在18℃时可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培养具有cs效应的G1果蝇。 热点情境01 基因编辑猪器官移植 情境解读： 器官短缺是全球性难题，每年数百万患者因无法匹配供体而死亡。基因编辑猪因其器官大小、生理功能与人类相似，且可通过CRISPR等技术改造以降低免疫排斥和病毒风险，成为异种移植的理想供体。近年来，中美科学家在心脏、肾脏、肝脏、肺等多个器官上取得里程碑式进展。 中国团队在2025年3月率先完成世界首例基因编辑猪肝脏移植至脑死亡受体，猪肝在体内正常分泌胆汁、维持血流，10天内未见排异或病毒感染。同年10月，中国再次实现世界首例活人猪肝脏移植，患者携带辅助猪肝存活171天，虽最终因上消化道出血去世，但证明了猪肝可在人体内发挥代谢与凝血功能。 中国也于2025年完成亚洲首例终末期肾病患者猪肾移植，69岁刘阿姨术后60天状态良好，无需透析，标志着国产基因编辑猪肾进入临床验证阶段。 此外，中国还完成了世界首例基因编辑猪肺移植至脑死亡受体，维持通气功能达9天。 1. 技术手段： （1） 基因编辑技术：目前主要采用CRISPR-Cas9等基因编辑工具，对供体猪的基因组进行“敲除”和“插入”操作。 （2） 体细胞克隆技术-批量复制“合格供体”。 （3）免疫耐受与抗排斥技术-术后“保驾护航”。 2．技术核心：如何让猪器官“骗过”人体免疫系统？ （1）敲除致排异基因：如GGTA1、CMAH、B4GALNT2，这些基因表达的糖类抗原会引发人体强烈免疫攻击。 （2）插入人类保护基因：如CD46、CD55（抑制补体激活）、THBD、PROCR（调节凝血）、CD47（“别吃我”信号）等，帮助器官逃避免疫清除。 （3）灭活内源性逆转录病毒（PERV）：通过CRISPR技术使猪基因组中所有PERV失活，防止跨物种感染。 3．当前挑战 （1）基因编辑的“艺术”与平衡： ①编辑数量的“度”，并不是改得越多越好； ②未知抗原的“盲区”： 即使经过多基因编辑，人体血清中仍可能检测到针对猪细胞的未知抗体； ③个体差异： 即使是经过相同基因编辑的“克隆猪”，在不同受体身上表现也不一致，有的长期存活，有的却迅速排斥，这种不确定性是临床应用的巨大障碍。 （2） 免疫排斥 ①抗体介导的排斥（AMR）： 这是目前导致移植失败的主因。 ②免疫抑制剂的“双刃剑”： 为了压制排斥，患者必须服用强效免疫抑制剂。 （3） 生物安全与跨物种感染 ①内源性逆转录病毒（PERV）： 这种病毒的基因片段镶嵌在猪的基因组中，虽然目前通过基因编辑和隔离饲养降低了风险，但理论上仍存在病毒复活并感染人类、甚至造成公共卫生风险的可能。 ②未知病原体： 猪身上可能携带对猪无害但对人致命的未知病毒或病原体，跨物种传播的风险需要长期观察。 典型例题： 1．2024年，全球首例接受经过CRISPR/Cas9基因编辑的猪肾脏移植手术取得成功。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪肾脏进行了基因编辑（敲除α-Gal基因，过程如图1）。CRISPR/Cas9工具主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图2。下列相关叙述错误的是（　　） A．图1中受体细胞通常选择受精卵，注入受体细胞的常用方法是显微注射法 B．α-Gal基因控制的蛋白质可能是猪的主要组织相容性抗原 C．Cas9蛋白相当于限制酶，能作用于脱氧核糖和碱基之间的磷酸二酯键 D．不同的向导RNA（sgRNA）需要根据目标基因设计不同识别序列 【答案】C 【详解】A、受精卵全能性最高，图1中受体细胞通常选择受精卵，注入受体细胞的常用方法是显微注射法，A正确； B、为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪肾脏敲除了α-Gal基因，α-Gal基因控制的蛋白质可能是猪的主要组织相容性抗原，B正确； C、Cas9蛋白相当于限制酶，能作用于脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，C错误； D、sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，即sgRNA通过与目标DNA碱基互补配对引导Cas9蛋白定位，不同的向导RNA（sgRNA）需要根据目标基因设计不同识别序列，D正确。 故选C。 01 基因工程 1．（25-26高三上·北京通州·期末）在高中生物学基础实验中，需要在严格无菌条件下进行的是（　　） A．从新鲜菜花中粗提取DNA B．将外植体接种到培养基上 C．使用PCR仪扩增目的基因 D．对酵母菌进行显微计数 【答案】B 【详解】A、从新鲜菜花中粗提取DNA：该实验通过物理研磨和化学试剂（如洗涤剂、食盐）破坏细胞结构，利用DNA在不同浓度酒精中的溶解度差异进行粗提取。整个过程在开放环境中进行，无需严格无菌条件，A不符合题意； B、将外植体接种到培养基上：属于植物组织培养实验。外植体（如茎尖、叶片等）需在无菌操作台中进行表面消毒和接种，培养基也需灭菌处理。若存在杂菌污染，会与植物细胞竞争营养并分泌有害物质，导致培养失败，B符合题意； C、使用PCR仪扩增目的基因：PCR（聚合酶链式反应）在密闭的仪器中进行，通过高温变性、退火、延伸等步骤扩增DNA。反应体系中的酶（如Taq酶）具有耐高温特性，且试剂本身已灭菌，操作过程无需严格无菌环境，C不符合题意； D、对酵母菌进行显微计数：通常采用血细胞计数板在显微镜下直接计数。酵母菌培养液可能含有其他微生物，但计数过程在开放环境中进行，且计数结果反映的是包括杂菌在内的总数，无需无菌操作，D不符合题意。 故选B。 2．荒漠植物的 Z 基因与其抗旱性强有关。科学家利用 Z 基因和农杆菌的 Ti 质粒（如图，T-DNA 为可转移的 DNA）构建表达载体，培育抗旱转基因小麦。下列说法错误的是（　　） A．T-DNA 能整合到小麦细胞染色体上 B．可用限制酶 ClaⅠ和 SacⅠ处理 Z 基因 C．可用卡那霉素筛选含重组 Ti 质粒的农杆菌 D．可在个体水平检测小麦是否获得抗旱性状 【答案】B 【详解】A、农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T- DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，A正确； B、限制酶ClaI在Ti质粒的T-DNA上没有酶切位点，且会破坏标记基因卡那霉素抗性基因，限制酶SacI在Ti质粒的T-DNA上没有酶切位点，且会破坏复制起点，不能用限制酶ClaI和SacI处理 Z 基因，B错误； C、农杆菌Ti质粒上存在卡那霉素抗性基因，可用卡那霉素筛选含重组Ti质粒的农杆菌，C正确； D、荒漠植物的Z基因与其抗旱性强有关，可在个体水平检测小麦是否获得抗旱性状，D正确。 故选B。 3．（2025·北京西城·一模）化疗会造成癌症病人血小板减少，血小板生成素（TPO）可促进血小板产生。研究人员将含人TPO基因的表达载体导入中国仓鼠卵巢细胞中，获得有生物活性的TPO并应用于临床。下列叙述不正确的是（　　） A．构建表达载体需要解旋酶和DNA聚合酶 B．用PCR技术可获取和扩增人TPO基因 C．表达载体包括TPO基因、标记基因、启动子和终止子等 D．用抗原—抗体杂交技术可检测TPO基因的表达情况 【答案】A 【详解】A、构建表达载体需要限制酶切割目的基因和载体，并用DNA连接酶连接，不需要解旋酶和DNA聚合酶。解旋酶用于DNA复制时解开双链，而构建载体时无需此过程，A错误； B、PCR技术可通过体外扩增快速获取大量人TPO基因，B正确； C、表达载体必须包含目的基因（TPO基因）、标记基因、启动子（启动转录）和终止子（终止转录）等结构，C正确； D、抗原—抗体杂交技术通过特异性结合检测TPO蛋白（基因表达的产物），D正确。 故选A。 4．（2025·北京大兴·模拟预测）由于基因工程技术打破了原有物种间的生殖隔离，将遗传关系较远的外源基因导入到一个新的遗传背景，因此如何保障转基因植物的环境安全成为人们广泛关注的热点问题。下列做法错误的是（　　） A．利用农杆菌转化法将抗虫基因导入烟草叶绿体中 B．利用种子特异启动子启动不育基因表达 C．利用基因编辑技术将选择标记基因敲除 D．利用PCR向花瓣发育相关基因引入突变，将植物改造为闭花受精 【答案】A 【详解】A、农杆菌转化法常用于将外源基因导入植物核基因组，农杆菌无法直接将基因导入叶绿体，A错误； B、种子特异启动子可以限制基因的表达仅在种子中，避免花粉或其他组织表达不育基因，从而防止基因漂移，这是一种常见的生物安全策略，用于控制转基因植物的繁殖，B正确； C、选择标记基因，在转基因过程中用于筛选成功转化的细胞，但后续可能不需要，敲除标记基因可减少潜在的环境风险，C正确； D、闭花受精是指植物在未开放的花中完成受精，可减少花粉扩散，降低基因漂移风险，即利用PCR向花瓣发育相关基因引入突变，将植物改造为闭花受精，降低基因漂移风险，D正确。 故选A。 5．（2025·北京海淀·二模）为合成出局部为双链的RNA用于沉默特定基因，先将目的基因X从重组质粒pHIBS切割出来，再巧妙地连接到质粒载体pUAST中，如下图，其中质粒只展示了局部。 下列叙述正确的是（　　） A．该操作过程中还需要DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 B．利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST连接 C．基因X的DNA片段需要完整保留启动子和终止子区域 D．可以用E和Bg，或者Xh和K双酶切重组pUAST 【答案】B 【详解】A、基因工程中，切割目的基因和载体需限制酶，连接二者需DNA连接酶；耐高温的DNA聚合酶用于PCR技术，而本题操作是切割和连接，无需PCR，A错误； B、B和Bg均产生-GATC-黏性末端（同尾酶），可互补连接。S 和Xh为另一对同尾酶，均产生-TCGA-黏性末端，切割后也能连接，利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST反向连接，B正确； C、启动子和终止子是驱动基因表达的调控序列，应存在于载体（pUAST）中，而非目的基因片段中，C错误； D、重组质粒（pUAST-基因 X）中，已不存在Bg和S酶切位点，D错误。 故选B。 6．（2025·北京西城·二模）根的向地性与生长素（IAA）分布不均有关。对IAA敏感的启动子与绿色荧光蛋白基因形成的融合基因在根中表达情况如图，下列叙述错误的是（　　） A．根的向地性利于植物吸收水分和无机盐 B．横放的根近地侧细胞生长速度大于远地侧细胞 C．可用农杆菌转化法将融合基因导入植物细胞中 D．绿色荧光的位置和强度代表IAA的分布和浓度 【答案】B 【详解】A、根的向地性利于植物从土壤中吸收水分和无机盐，A正确； B、横放的根近地侧细胞生长素浓度高，生长受到抑制，所以生长速度小于远地侧细胞，B错误； C、可用农杆菌转化法将融合基因导入植物细胞中，因为农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以将目的基因转入植物染色体DNA，C正确； D、题干中将对IAA敏感的启动子与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，所以绿色荧光的位置和强度代表IAA的分布和浓度，D正确。 故选B。 02 蛋白质工程 7．．（2025·北京顺义·一模）转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。相关叙述正确的是（    ） A．使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接 B．选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接 C．可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞 D．融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累 【答案】C 【详解】A、DNA聚合酶的功能是催化DNA链的延伸（如PCR中），而连接两个基因需要的是DNA连接酶（如T4 DNA连接酶），因此使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接，A错误； B、PCR检测融合基因时，需选择位于两个基因外侧的引物（如C基因上游和Bt基因下游），确保仅当基因正确连接时才能扩增出目标片段，因此选择引物1和4进行PCR才可以确定基因正确连接，B错误； C、花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管，利用受精过程将基因整合到胚胎细胞中，因此可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞，C正确； D、C蛋白能结合纤维素（主要存在于细胞壁），融合基因表达后，Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向至细胞壁附近，减少细胞质中的积累，从而避免非期望效应，D错误。 故选C。 8．近年来，人工智能（AI）技术在蛋白质工程领域的应用取得了显著成果，不仅攻克了长期存在的蛋白质结构预测问题，还成功设计了多种新型功能蛋白，为多个领域带来了潜在的生物活性分子。下列说法正确的是（　　） A．蛋白质工程需要改造蛋白质分子的所有氨基酸序列 B．蛋白质工程的目标是改造现有蛋白质或创造新蛋白质 C．AI在蛋白质工程中的应用说明不再需要基因工程水平的操作 D．AI设计的蛋白质功能必然超过自然界中发现的任何蛋白质 【答案】B 【详解】A、由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成，A错误； B、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，B正确； C、人工智能（AI）技术在蛋白质工程领域的应用取得了显著成果，但蛋白质工程的操作最终还必须通过改造或合成基因来完成，仍然需要基因工程水平的操作，C错误； D、AI设计的蛋白质功能不一定超过自然界中发现的蛋白质，D错误。 故选B。 9．（23-24高三下·北京延庆·阶段练习）研究发现，为心梗患者注射适量t-PA蛋白会诱发颅内出血，但若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，改良后的t-PA蛋白成为心梗和脑血栓的急救药。下图所示，通过基因工程大量制备改良药物t-PA蛋白，下列说法错误的是（    ） A．制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程 B．利用重组pCLY11质粒可获得牛乳腺生物反应器 C．选用限制酶XmaI和BglⅡ切割质粒pCLY11，构建重组质粒 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现蓝色 【答案】D 【详解】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。依题意，改良后的药物t-PA蛋白将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸改良而来，因此，制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程，A正确； B、科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。因此，利用重组pCLY11质粒也可获得牛乳腺生物反应器，B正确； C、t-PA改良基因的黏性末端如图所示，则所选的限制酶所获得的切口应与t-PA改良基因的黏性末端相同，因此需选用限制酶XmaI和BglⅡ切开质粒pCLY11，C正确； D、结合图示可知，限制酶XmaI和BglⅡ会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，但不会破坏新霉素抗性基因，导入重组质粒的大肠杆菌具有新霉素抗性，但由于mlacZ基因被破坏，没有相应产物，因而菌落呈现白色，D错误。 故选D。 10.快速、准确地确定蛋白质的三维空间结构，一直是生命科学领域的研究热点和难点。人工智能程序AlphaFold 2对大部分蛋白质结构的预测极为精准，接近真实的蛋白质结构，达到了人类利用冷冻电镜等复杂仪器观察预测的水平。下列相关叙述不正确的是（ ） A．蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础 B．预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程 C．结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制 D．依据新蛋白质的氨基酸序列能推出唯一的基因序列 【答案】D 【详解】A、蛋白质多样性与组成蛋白质的氨基酸的种类、数目、排列顺序及肽链盘曲折叠形成的蛋白质的空间结构不同有关，因此蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础，A正确； B、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求，因此预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程，B正确； C、结构决定功能，结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制，C正确； D、一个氨基酸的密码子可能有多个，因此依据新蛋白质的氨基酸序列能推出多个基因序列，D错误。 故选D。 11．（25-26高三上·北京海淀·期中）科研人员利用相关技术改变了胰岛素β链的第9位氨基酸，从而避免了胰岛素结合成无活性的二聚体形式。下列相关叙述错误的是 （　　） A．胰岛素的本质是蛋白质，不宜口服使用 B．可通过测定DNA序列确定突变是否成功 C．该过程的操作对象是胰岛素分子 D．对胰岛素结构的改造属于蛋白质工程 【答案】C 【详解】A、胰岛素的本质是蛋白质不宜口服使用，否则会被消化酶分解，A正确； B、基因突变会导致基因中碱基序列发生改变，因此可通过测定DNA的序列确定突变是否成功，B正确； C、该过程的操作对象是胰岛素基因，但不是胰岛素分子，C错误； D、对胰岛素结构的改造属于蛋白质工程，D正确。 故选C。 【点睛】 12．（20-21高三上·北京朝阳·期中）新冠病毒的表面棘突蛋白（S蛋白）的受体结合域（RBD）与人体细胞表面的ACE2受体相互作用感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白RBD紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列说法不合理的是（    ） A．LCB1的作用机理与S蛋白的抗体类似 B．LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计 C．LCB1是通过细胞中原有基因表达产生的 D．可用蛋白质工程进行LCB1的设计和生产 【答案】C 【详解】A、由题意可知，新冠病毒的表面棘突蛋白（S蛋白）存在受体结合域（RBD），而LCB1可与S蛋白RBD紧密结合，故LCB1的作用机理与S蛋白的抗体类似，A正确； B、LCB1的作用机理与S蛋白的抗体类似，可依据受体（S蛋白的RBD）结构进行设计，B正确； C、由题意可知，LCB1是自然界中不存在的蛋白质，故无法通过细胞中原有基因表达产生，C错误； D、LCB1是自然界中不存在的蛋白质，可用蛋白质工程进行LCB1的设计和生产，D正确。 故选C。 【点睛】掌握体液免疫中抗体的生理作用和蛋白质工程的原理是解答本题的关键。 1．CRISPR/Cas9系统由向导RNA和Cas9蛋白组成，由向导RNA（gRNA）引导Cas9蛋白在特定的基因位点进行切割，从而完成基因的编辑过程，过程如图所示。现欲用CRISPR/Cas9编辑技术对轮状病毒（双链RNA病毒）进行编辑，下列相关叙述错误的是（　　） A．可以根据目标基因的碱基序列人工设计向导RNA B．Cas9类似于基因工程中的限制酶，其作用位点是磷酸二酯键 C．若向导RNA的序列为5'-UCACAUC-3'，则其识别的基因靶序列为3'-AGTGTAG-5' D．向导RNA的碱基序列越短，则其在基因上出现定位错误的概率越高 【答案】C 【详解】A、向导 RNA（gRNA）靠碱基互补配对识别目标基因，可以按目标序列人工设计，A正确； B、Cas9切割 DNA，断开 磷酸二酯键，功能和限制酶一样，定点切割核酸，B正确； C、向导 RNA 是 RNA：含 U，识别的基因靶序列是 DNA：含 T，正确配对应该是：5'-UCACAUC-3'与3'-AGTGTAG-5'，C错误； D、序列越短，随机匹配上的概率越大，脱靶（定位错）率越高，D正确。 故选C。 2．微生物DNA分子中腺嘌呤会被甲基化酶修饰，腺嘌呤的甲基化会影响不同限制酶的切割情况，下表是腺嘌呤甲基化前后某些限制酶切割的情况。下列叙述错误的是（　　） 限制酶 识别序列 甲基化前 甲基化后 TaqI 5'-T↓CGA-3' 切割 不切割 DpnI 5'-GA↓TC-3' 不切割 切割 ClaI 5'-AT↓CGAT-3' 切割 不切割 BamHI 5'-G↓GATCC-3' 切割 切割 A．DNA腺嘌呤的甲基化并不会改变生物基因的碱基序列 B．DNA腺嘌呤甲基化可能导致限制酶切割的特异性降低 C．通过甲基化关闭某些酶切位点时可能打开新的酶切位点 D．基因工程操作过程中最好选用对甲基化不敏感的限制酶 【答案】B 【详解】A、DNA腺嘌呤甲基化属于表观遗传修饰，不改变基因的碱基序列，A正确； B、限制酶的特异性由其识别序列决定，甲基化可能阻止或允许切割（如TaqI甲基化后不切割、DpnI甲基化后切割），但未改变识别序列本身，故不会降低特异性，B错误； C、如DpnI在甲基化后从不切割变为切割，相当于“打开”新酶切位点；而TaqI甲基化后“关闭”酶切位点，C正确； D、基因工程中若使用对甲基化敏感的限制酶（如TaqI），其切割结果受宿主甲基化状态影响，可能导致操作失败，故应优先选用对甲基化不敏感的限制酶（如BamHI），D正确。 故选B。 3．（25-26高三上·北京朝阳·期中）人乳头瘤病毒（HPV）通过促进子宫颈细胞p53蛋白降解和pRb蛋白失活，导致细胞生长分裂失控，诱发宫颈癌。下列分析错误的是（    ） A．p53基因和pRb基因应属于抑癌基因 B．子宫颈细胞癌变后细胞膜上的糖蛋白增多 C．可利用核酸分子杂交技术检测HPV感染 D．机体通过免疫监视功能清除突变子宫颈细胞 【答案】B 【详解】A、抑癌基因的作用是阻止细胞不正常的增殖。p53蛋白和pRb蛋白能抑制细胞生长分裂失控，当它们的功能受影响（如p53蛋白降解、pRb蛋白失活）会导致细胞癌变，所以p53基因和pRb基因应属于抑癌基因，A正确； B、细胞癌变后，细胞膜上的糖蛋白会减少，使得癌细胞之间的黏着性降低，容易在体内分散和转移，而不是增多，B错误； C、核酸分子杂交技术的原理是碱基互补配对，HPV含有特定的核酸序列，因此可利用核酸分子杂交技术检测HPV感染，C正确； D、机体的免疫监视功能能够识别和清除突变的细胞，防止肿瘤的发生，所以机体可通过免疫监视功能清除突变子宫颈细胞，D正确。 故选B。 4．（2025·北京昌平·二模）H18杂交瘤细胞能够产生抗人肝癌单克隆抗体，但该细胞在培养过程中的凋亡现象制约着其生产能力的提高。Bcl-XL是一种抗凋亡蛋白，利用Bcl-XL基因改造杂交瘤细胞，获得了稳定表达Bcl-XL的杂交瘤细胞。下列说法错误的是（　　） A．制备H18杂交瘤细胞利用了动物细胞融合技术 B．利用产生特定抗体的B细胞与瘤细胞制备H18杂交瘤细胞 C．将Bcl-XL基因直接注射至H18杂交瘤细胞可实现稳定表达 D．经筛选可获得既抗凋亡又能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞 【答案】C 【详解】AB、动物细胞融合技术可使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞，融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。利用产生抗人肝癌抗体的B细胞与瘤细胞融合，可制备H18杂交瘤细胞，A正确，B正确； C、将Bcl-XL基因直接注射至H18杂交瘤细胞可能出现Bcl-XL基因被降解、Bcl-XL基因无法正确并稳定表达等问题，故要将Bcl-XL基因与载体构成基因表达载体，再导入H18杂交瘤细胞进行稳定表达，C错误； D、通过基因改造后，如果H18杂交瘤细胞成功整合了Bcl-XL基因，则H18杂交瘤细胞能同时具备既抗凋亡又能分泌单克隆抗体两种特性，可筛选出这样的细胞，D正确。 故选C。 5．（24-25高三上·北京石景山·期末）多囊肾病（PKD）是一种单基因显性遗传病，致病基因位于常染色体上。对某患者相关基因进行检测，得到2种序列（如下图）。图中限制酶E的识别序列为GATATC。下列判断正确的是（　　） A．致病基因碱基序列的改变导致密码子由GAT变为AAT B．用限制酶E切割该患者的基因，得到2种不同长度的片段 C．对患病家系进行调查，统计获得该病在人群中的发病率 D．若该患者与正常人婚配，生育患PKD男孩的概率为1/4 【答案】D 【详解】A、密码子是mRNA上的三个相邻碱基，而题干中给出的是DNA序列，所以不能直接得出致病基因碱基序列的改变导致密码子由GAT变为AAT，A错误； B、多囊肾病（PKD）是一种单基因显性遗传病，由图可知，正常基因有2个限制酶E的识别序列，致病基因有1个限制酶E的识别序列，用限制酶E切割该患者的基因（杂合子，含正常基因和致病基因），会得到3种不同长度的片段，B错误； C、对患病家系进行调查，可统计该病的遗传方式，而要统计获得该病在人群中的发病率，应该在人群中随机调查，C错误； D、设致病基因为A，正常基因为a，患者基因型为Aa，正常人基因型为aa，他们婚配后生育患病孩子（Aa）的概率为1/2，生育男孩的概率为1/2，所以生育患PKD男孩的概率为1/2×1/2 = 1/4，D正确。 故选D。 6．（24-25高三上·北京丰台·期末）分生孢子是真菌产生的一种无性繁殖体。科研人员对麦根腐平脐蠕孢中与分生孢子形成相关的Bsb基因进行研究，构建了Bsb基因缺失突变体Bsb-n和在此基础上重新导入Bsb基因的回补实验株Bsb-c，检测相关指标，结果如图。下列叙述不正确的是（    ） A．麦根腐平脐蠕孢通过减数分裂产生分生孢子 B．Bsb基因可调控分生孢子的产生量使其降低 C．获得Bsb-n和Bsb-c都需构建基因表达载体 D．Bsb-c组是为了进一步验证Bsb基因的功能 【答案】A 【详解】A、分生孢子是真菌产生的一种无性繁殖体，而减数分裂产生的是生殖细胞，不属于无性生殖，A错误； B、与野生型相比，Bsb-n组（Bsb基因缺失突变体）的分生孢子产生量升高，说明Bsb基因可调控分生孢子的产生量使其降低，B正确； C、基因表达载体可使目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，获得Bsb-n和Bsb-c都需构建基因表达载体，C正确； D、Bsb-c组是重新导入Bsb基因的回补实验株Bsb-c，是为了进一步验证Bsb基因的功能，D正确。 故选A。 7．（24-25高三上·北京·期中）科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，Ti质粒如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．农杆菌的拟核基因与番木瓜基因发生重组 B．构建重组质粒均需使用限制酶和DNA聚合酶 C．含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D．转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 【答案】D 【详解】A、农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是其质粒上的基因，A错误； B、构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误； C、含重组Ti质粒的农杆菌具有卡那霉素抗性，而不具有四环素抗性，基因C插入破坏了四环素抗性基因，C错误； D、因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T-DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D正确。 故选D。 8．（24-25高三上·北京朝阳·期中）我国科学家开发了一种利用自体肝细胞治疗遗传性肝病的新技术（如图）。用基因编辑技术对体外培养的患者肝细胞进行基因修复后，将细胞移植给人酪氨酸血症模型小鼠，小鼠肝功能得到有效改善。相关叙述错误的是（    ） A．用胶原蛋白酶或胰蛋白酶处理可分散肝组织细胞 B．基因编辑工具使肝细胞内致病基因修复为正常基因 C．此过程利用显微注射技术将正常基因导入肝细胞 D．使用免疫缺陷小鼠可避免异种移植引发的免疫排斥 【答案】C 【详解】A、动物细胞培养过程中，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理部分组织使细胞分散获得单个细胞，A正确； B、分析图可知，将携带正常基因的重组腺病毒并利用CRISPR/Cas9基因编辑工具，可以使肝细胞内致病基因修复为正常基因，B正确； C、分析图可知，该过程是利用载体——重组腺病毒将正常基因导入肝细胞，并不是利用显微注射技术将正常基因导入肝细胞，C错误； D、免疫缺陷小鼠免疫功能受损，所以使用免疫缺陷小鼠可避免异种移植引发的免疫排斥，D正确。 故选C。 9．（2024·北京·模拟预测）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建重组质粒，并转化到受体菌中。下列叙述不正确的是（    ） A．若用HindⅢ酶切，通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒 B．若用PvuⅠ酶切，在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因 C．若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得正确的重组质粒 D．若用ScaⅠ酶切，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建是否成功 【答案】C 【详解】A、若用HindⅢ酶切，由于形成的黏性末端相同，因此目的基因可正向连接到质粒中，也可反向连接到质粒中，即通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒，A正确； B、氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有ScaI和PvuI的酶切位点，若用PvuⅠ酶切，目的基因的插入会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因，B正确； C、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），而导入空质粒的含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，故若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得含有正确的重组质粒的菌体，而非获得正确的重组质粒，C错误； D、若用SalⅠ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，D正确。 故选C。 10．（2024·北京海淀·一模）双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 【答案】B 【详解】A、将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确； B、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选B。 11．（25-26高三上·北京房山·期末）水稻杂交后代具有高产等杂种优势，科研人员欲利用花药发育不良、花粉败育的雄性不育系培育杂交种。 (1)研究人员在野外发现一株稳定遗传的细胞核雄性不育突变体，基因型记作rr，将该突变体与野生型可育水稻杂交，F1均表现可育，F1自交得到的F2中雄性不育株占_____，F2可育植株中，自交后代不会出现性状分离的个体占_____。 (2)传统育种时，用三系法保持水稻的雄性不育系。下表为三系水稻的基因型及育性。 三系水稻 保持系 不育系 恢复系 基因型 N（rr） S（rr） N（RR）、S（RR） 育性 可育 不育 可育 注：N-质可育基因，R-核可育基因，S-质不育基因 ①三系法杂交稻育种中，雄性不育株作为_____（填“父本”或“母本”）与恢复系水稻杂交得到可育的杂种F1用于大田生产。 ②写出繁育雄性不育系的杂交过程。_____ (3)现有可育的优良品系甲和乙，可用于生产杂交水稻。为简化育种过程，研发了Bn-Bs核基因雄性不育系统。其中核糖核酸酶基因（Bn）表达产物可以水解RNA，Bs基因表达的产物能特异性抑制Bn蛋白的活性。为利用Bn-Bs系统制备转基因的甲品系植株，设计出图1所示的表达载体。 注：启动子1在植物体所有细胞中都能持续、稳定地启动连接基因表达。 ①结合转基因植株表型分析，启动子2应为_____启动子，从而获得雄性不育株。 ②T-DNA在染色体上是随机插入的，研究人员使用NcoⅠ酶对转基因植株的基因组DNA进行酶切、电泳，以Bn基因作探针进行DNA分子杂交，结果如图2。由此判断，_____号植株为单基因插入，是育种的理想品系（甲-Bn）。 ③利用表达载体2将Bs基因定点整合到乙品系（与甲品系Bn基因位点相同）中，获得纯合的乙-Bs。研究人员利用Bn-Bs系统制备具有杂种优势的杂合种子，如下表所示。 阶段一 阶段二 阶段三 方法一 方法二 甲-Bn×甲 ↓ F1 将F1种成母本行，将乙-Bs种成父本行 F1与乙-Bs混种 将获得的种子用于大田生产 幼苗长出后喷洒除草剂 分行收取种子 从所有植株上收取种子 科研人员选择_____中的种子用于阶段三大田生产，理由是_____。 【答案】(1) 1/4 1/3 (2) 母本 用保持系N（rr）作父本，雄性不育系S（rr）作母本进行杂交，得到雄性不育系S（rr） (3) 花药特异性（或雄性组织特异性） 7 方法一母本行 方法一幼苗长出后喷洒除草剂，F1母本行中只有含Bn的个体存活，且雄性不育只能作为母本，接受乙-Bs的花粉结的种子全部为杂合子Bn-Bs且可育，所以可用于阶段三大田生产，而方法一父本行可以自花传粉，所结种子全部为乙-Bs纯合子，方法二由于是混种且从所有植株上收取种子，种子中既有Bn-Bs也有乙-Bs纯合子 【详解】（1）野生型（RR）和突变体（rr）杂交，F1为Rr，自交F2中RR：Rr：rr=1：2：1，所以雄性不育植株占1/4，F2可育植株基因型为RR和Rr，其中RR自交后代不会出现性状分离，RR在可育植株中占比为1/3。 （2）雄性不育株不能产生可育花粉，所以作为母本与恢复系水稻杂交得到可育的杂种F1用于大田生产。培育雄性不育系的杂交过程：用保持系N(rr)作父本，雄性不育系S(rr)作母本进行杂交，后代基因型为S(rr)，即得到雄性不育系。 （3）①要获得雄性不育株，需要Bn基因在特定部位（雄性生殖细胞相关部位）表达，水解RNA，而不是在植物体所有细胞中持续、稳定表达（否则会导致植株表现异常或死亡），所以启动子应为花药特异性（或雄性组织特异性）启动子，这样Bn基因只在花粉中表达，使花粉败育，从而获得雄性不育株。 ②T-DNA是随机插入基因组的。若为单拷贝插入，经NcoI酶切后，产生较短的Bn基因，电泳后位置靠前；若为多拷贝插入，则可能产生多条带。图2中具有一个条带的有7、9、20，而7号的条带靠前，所以7号为Bn单基因插入。 ③由于方法一幼苗长出后喷洒除草剂，F1母本行中只有含Bn的个体存活，且雄性不育只能作为母本，接受乙-Bs的花粉结的种子全部为杂合子Bn-Bs且可育，所以可用于阶段三大田生产，而方法一父本行可以自花传粉，所结种子全部为乙-Bs纯合子，方法二由于是混种且从所有植株上收取种子，种子中既有Bn-Bs也有乙-Bs纯合子。所以科研人员选择方法一母本行中的种子用于阶段三大田生产。 12．（25-26高三上·北京通州·期末）经典的孟德尔遗传规律和自然选择限制了对野生植物种群进行基因改造，因为某些对人类有利的性状对植物自身是不利的，研究者开发了CAIN技术解决这一难题。 (1)Cas9-gRNA系统是基因编辑的重要工具，如图1所示，gRNA通过______原则识别并结合DNA上靶序列，同时招募Cas9蛋白对该靶序列进行切割，造成DNA损伤。 (2)基于Cas9-gRNA系统，研究者构建了CAIN技术，其载体结构如图2所示。DMC1启动子可以驱动Cas9基因和gRNA序列的转录，进而特异性地破坏花粉萌发的必需基因NPG1；同时需要引入“基于同义密码子替换靶序列的NPG1基因”（简称NPG1-ty基因），NPG1-ty基因的具体功能是______。为了将NPG1-ty基因重组到C载体中，需要用到的限制酶是_______，重组后的载体称为CAIN载体。 注：同义密码子是指同一氨基酸被多个不同密码子编码。DMC1是雄蕊花粉母细胞特异启动子。TPD1是花粉细胞特异启动子。 (3)科学家用______方法，将1个CAIN载体导入到植物拟南芥染色体中，且转入的CAIN载体稳定存在并表达。以该转基因植株作为父本，以野生型为母本进行人工授粉，F1中携带CAIN载体的比例为________。 (4)结合所学知识，有关本研究的表述中正确的是_______。 A．Cas9-gRNA功能类似“解药”，NPG1-ty功能类似“毒药” B．通过特异性抗体，能够区分NPG1和NPGI-ty基因表达的蛋白质 C．CAIN技术可用于破坏外来入侵植物的育性相关基因，控制入侵植物数量 D．CAIN技术被不当使用会影响生物安全，因此需要进行严格的监管和论证 【答案】(1)碱基互补配对 (2) 恢复花粉萌发正常所需的NPGI基因功能，避免NPGI基因被Cas9-gRNA切割 KpnI和SalI (3) 农杆菌转化 100% (4)CD 【详解】（1）结合图1分析，gRNA通过碱基互补配对原则识别并结合DNA上靶序列，同时招募Cas9蛋白对该靶序列进行切割，造成DNA损伤。 （2）特异性地破坏花粉萌发的必需基因NPG1；同时需要引入“基于同义密码子替换靶序列的NPG1基因”（简称NPG1-ty基因），说明NPG1-ty基因的具体功能是恢复花粉萌发正常所需的NPGI基因功能，避免NPGI基因被Cas9-gRNA切割。在构建重组DNA分子时需要保证NPG1-ty基因转录的方向和质粒上基因的转录方向是一致的，目的基因的左侧有两种限制酶识别序列，分别是KpnI和SpeI，左侧是转录的终点，而在质粒上SpeI最靠近TPD1启动子，因此选择KpnI，目的基因的右侧有三种限制酶识别序列，右侧是转录的起点，所选择的限制酶应该在质粒上KpnI的左侧，可以选择BamHI或SalI，但BamHI会破坏卡那霉素抗性基因，因此选择SalI。综合分析，为了将NPG1-ty基因重组到C载体中，需要用到的限制酶是KpnI和SalI。 （3）将目的基因导入植物细胞的方法通常是农杆菌转化法，因此科学家会用农杆菌转化方法，将1个CAIN载体导入到植物拟南芥染色体中，且转入的CAIN载体稳定存在并表达。父本含有一个CAIN载体，母本不含CAIN载体，DMC1启动子可以驱动Cas9基因和gRNA序列的转录，进而特异性地破坏花粉萌发的必需基因NPG1，即不含CAIN的花粉不能萌发，以该转基因植株作为父本，以野生型为母本进行人工授粉，F1中携带CAIN载体的比例为100%。 （4）A、Cas9-gRNA功能是特异性切割DNA片段，类似“毒药”，NPG1-ty功能是替换原有的基因，类似“解药”，A错误； B、引入“基于同义密码子替换靶序列的NPG1基因”，说明NPG1和NPG1-ty基因表达的蛋白质相同，因此无法通过特异性抗体区分，B错误； C、结合题干信息可知，CAIN技术可用于破坏外来入侵植物的育性相关基因，从而减少出生率，进而控制入侵植物数量，C正确； D、CAIN技术被不当使用会影响生物安全，因此需要进行严格的监管和论证，尽可能减少对生物环境的影响，D正确。 故选CD。 13．（25-26高三上·北京朝阳·期末）炎症性肠病是一种常见的肠道疾病，目前诊断主要依赖侵入性的肠镜检查。研究者利用大肠杆菌尼氏菌株（EcN），构建可响应肠道炎症标志物硫代硫酸盐的益生菌传感器，以实现该疾病的无创超声成像检查。 (1)大肠杆菌是一种常见的微生物，常被改造为基因工程菌，其原因包括_________（写出2点）。 (2)为实现超声成像，研究者将声学报告基因（ARG）导入EcN。ARG编码的蛋白组装成气囊能产生超声信号。图1为硫代硫酸盐感应及ARG表达调控的示意图。 S和R基因的启动子是________（填“组成型”或“硫代硫酸盐诱导型”）。硫代硫酸盐作为________与膜传感器激酶S结合，进而磷酸化响应调节蛋白R，磷酸化的R蛋白形成________后结合P启动子激活ARG基因表达。 (3)为进一步提高传感器的灵敏度，研究者引入了Bxb1重组酶系统（如图2）。该系统在感应硫代硫酸盐后，表达Bxb1重组酶，催化attB与attP位点之间的不可逆重组。 ①与图1相比，Bxb1重组酶系统的引入使传感器的信号强度“不可逆放大”，其机制是________。 ②温度响应型终止子TR在37℃（体温）条件下失活。Bxb1上游加入TR的作用是________。 (4)将优化后的传感器应用于肠道炎症诊断，采用“先定植-后检测”的模式（先口服工程益生菌，24小时后超声检查），检测效果显著优于“口服后立即检查”。推测“先定植-后检查”模式效果好的原因________。 (5)在ARG基因后添加attB-P7-attP-抗炎蛋白基因模块可实现________。 【答案】(1)繁殖速度，能快速获得大量工程菌； 遗传物质相对简单，易于进行基因操作。 (2) 组成型 信号分子 同源二聚体 (3) Bxb1重组酶催化attB与attP位点不可逆重组，使ARG基因与组成型启动子P7永久连接，ARG基因持续高效表达，信号被不可逆放大 在体温（37℃）外的环境中，TR发挥终止作用，避免Bxb1重组酶提前表达导致重组发生，保证传感器仅在肠道（体温）环境中实现信号放大，提高检测的特异性。 (4)先定植 - 后检查模式效果好的原因： 口服的工程益生菌需要一定时间在肠道内定植、增殖，达到足够的数量，才能产生足够的气囊，使超声信号强度达到可检测水平； 减少口服后未定植的益生菌随消化道排出，避免信号被稀释，提高检测灵敏度 (5)实现肠道炎症的无创超声诊断与抗炎治疗的双重效果（工程菌既能通过ARG基因表达产生超声信号实现诊断，又能表达抗炎蛋白发挥治疗作用） 【详解】（1）繁殖速度快：大肠杆菌为原核生物，二分裂增殖，短时间内可获得大量工程菌，便于快速生产目的产物； -遗传物质简单：只有拟核中的环状DNA和质粒，无核膜阻隔，外源基因易导入且易进行基因编辑； - 培养条件简单：异养兼性厌氧，培养基成分易配置，培养成本低 （2）① S和R基因的启动子类型： 从图1可知，无论是否存在硫代硫酸盐，S、R基因都能表达出S蛋白和R蛋白（是后续响应硫代硫酸盐的基础），因此其启动子为组成型（组成型启动子不受外界信号诱导，持续驱动基因表达；诱导型启动子仅在特定信号下启动表达）。 ②硫代硫酸盐的作用： 硫代硫酸盐是肠道炎症标志物，作为信号分子（配体）与膜上的S蛋白（膜传感器激酶）结合，触发后续的磷酸化信号通路。 ③磷酸化R蛋白的变化： 磷酸化的R蛋白会形成二聚体（同源二聚体），该二聚体能特异性结合P启动子，进而激活ARG基因的转录和翻译，最终表达出组装气囊的蛋白。 （3）① 信号不可逆放大的机制： 图1中ARG基因仅受硫代硫酸盐诱导的P启动子调控，撤去诱导后表达停止；而图2中，硫代硫酸盐诱导Bxb1重组酶表达后，该酶催化attB与attP位点不可逆重组，使ARG基因与组成型启动子P7永久连接，ARG基因不再依赖诱导，持续高效表达，因此信号被不可逆放大。 ② 温度响应型终止子TR的作用： TR在37℃（体温）下失活，在体外非体温环境中能发挥终止作用，抑制Bxb1重组酶的表达，避免工程菌在体外提前发生重组；仅在肠道（体温）环境中，TR失活，Bxb1重组酶表达并启动重组，保证传感器仅在肠道内实现信号放大，提高检测的特异性，防止体外重组导致的信号误触发。 （4）口服的工程益生菌需要24小时在肠道内定植、增殖，达到足够的数量后，才能表达足量的ARG蛋白组装气囊，产生可被检测到的超声信号；若立即检查，菌量过少，信号强度不足，无法检测。 减少未定植的益生菌随消化道排出，避免超声信号被稀释，进一步提升检测的灵敏度。 （5）在ARG基因后添加attB-P7-attP-抗炎蛋白基因 模块，结合图2的重组酶系统可知： ARG基因表达产生气囊，实现无创超声诊断； - 重组酶催化位点重组后，抗炎蛋白基因也会与组成型启动子P7连接，表达抗炎蛋白，实现抗炎治疗； 因此该设计实现了肠道炎症的无创超声诊断与抗炎治疗的双重功能。 14．（25-26高三上·北京东城·期末）已有研究发现，N蛋白(一种RNA甲基转移酶)在多种癌细胞中表达上调，具有促进癌细胞增殖和转移的作用，对其机制展开研究。 (1)N蛋白可以结合靶基因的相应RNA片段，使其胞嘧啶发生甲基化(修饰)，导致RNA稳定性提高，相应蛋白含量增加，此时RNA的碱基序列___________(填“改变”或“不改变”)。 (2)为寻找N蛋白调控肝癌发生的靶基因，研究者对肝癌细胞进行mRNA相关水平的检测，筛选出11个候选基因。写出图1中的筛选指标___________。 (3)进一步研究确定了P基因为N蛋白的靶基因。培养过表达N蛋白的肝癌细胞，收集细胞裂解液，利用图2技术进行验证。对照组加入无关抗体和磁珠组成的复合物，实验组应加入___________，一段时间后，用磁力架吸取磁珠并提取磁珠复合物上的RNA，逆转录后利用PCR技术检测___________。 (4)细胞呼吸中葡萄糖分解为丙酮酸的过程称为糖酵解，P基因编码该过程中的一种关键酶。糖酵解产生的某些物质会向细胞外释放，利用癌细胞进行实验，结果如图3. ①加入2-DG后，阶段三数值恢复至初始水平，该操作的目的是___________。 ②该实验为“N蛋白促进癌细胞的增殖和转移是通过调控P基因实现”提供了证据，请解释说明__________。 【答案】(1)不改变 (2)①mRNA的含量比正常细胞高；②mRNA含量下降 (3) N蛋白的抗体和磁珠组成的复合物 是否存在P基因 (4) 确认阶段二流出速率的变化是由糖酵解引起的 此实验证实N蛋白促进了肝癌细胞的糖酵解。已知N蛋白促进P基因的表达，P基因编码糖酵解过程中的关键酶。说明N蛋白通过促进P基因表达以促进糖酵解，从而使癌细胞获得能量进行增殖和转移 【详解】（1）N 蛋白使 RNA 的胞嘧啶发生甲基化，仅对 RNA 进行修饰，不改变其碱基序列，因此 RNA 的碱基序列不改变。 （2）N 蛋白具有促进癌细胞增殖和转移的作用，其靶基因的表达应被 N 蛋白上调。因此筛选指标为：①候选基因在肝癌细胞中的mRNA 含量比正常细胞高；②沉默 N 蛋白后，候选基因的mRNA 含量下降。 （3）实验目的是验证 N 蛋白与 P 基因 RNA 的结合，对照组加入无关抗体 - 磁珠复合物，实验组应加入N 蛋白的抗体和磁珠组成的复合物（特异性结合细胞裂解液中的 N 蛋白及其结合的 RNA）。提取磁珠复合物上的 RNA 后，逆转录为 cDNA，利用 PCR 技术检测是否存在 P 基因的 cDNA（若存在，说明 N 蛋白与 P 基因 RNA 结合）。 （4）2-DG 是糖酵解抑制剂，加入后阶段三数值恢复至初始水平，说明阶段二H+流出速率的变化是由糖酵解引起的，该操作的目的是确认阶段二H+流出速率的变化是由糖酵解引起的（排除其他代谢途径的干扰）。 实验中，N 蛋白过表达组的H+流出速率高于对照组，加入 2-DG 后恢复；且 P 基因编码糖酵解关键酶，N 蛋白促进 P 基因表达。由此说明：N 蛋白通过促进 P 基因表达，提高糖酵解速率，为癌细胞增殖和转移提供能量和物质，从而促进癌细胞的增殖和转移。 1．（2022·北京·高考真题）下列高中生物学实验中，对实验结果不要求精确定量的是（　　） A．探究光照强度对光合作用强度的影响 B．DNA的粗提取与鉴定 C．探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度 D．模拟生物体维持pH的稳定 【答案】B 【详解】A、探究光照强度对光合作用强度的影响，需要测定不同光照强度下光合作用强度，要求精确定量，A错误； B、DNA的粗提取与鉴定属于物质提取与鉴定类的实验，只需观察是否有相关现象，不需要定量，故对实验结果不要求精确定量，B正确； C、探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度，需要明确不同生长素类调节剂浓度下根的生长情况，要求定量，C错误； D、模拟生物体维持pH的稳定，需要用pH试纸测定溶液pH值，需要定量，D错误。 故选B。 2．（2020·北京·高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 【答案】B 【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。 故选B。 3．（2025·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）~（4）题。 野生动物个体识别的新方法 识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年，人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA，PCR扩增特定的DNA片段，测定产物的长度或序列，据此可识别个体，在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。 微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段，广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列，每个重复单位长度为2~6bp（碱基对），重复数可以达到几十个（图1）．基因组中有很多个微卫星DNA，分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”，能组成多种“基因型”．分析多个微卫星“基因”，可得到个体特异的“基因型”组合，由此区分开不同的个体。 依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列（图1），设计并合成特异性引物，PCR扩增后，检测扩增片段长度，即可得知所测个体的“等位基因”（以片段长度命名），进而获得该个体的“基因型”。例如，图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图，个体A的“基因型”为177/183。 有一个远离大陆的孤岛，陆生哺乳动物几乎无法到达，人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便，提取DNA，扩增并分析了10个微卫星“基因”，结果在30份样品中成功鉴定出个体（如表）。几个月后再次采集貉的新鲜粪便，进行同样的分析，在40份样品中成功鉴定出个体（如表）。据此，科学家估算出该岛上貉的种群数量。 两次采样所鉴定出的貉的个体编号 第一次采集的30份粪便样品所对应的个体编号 N01 N02 N03 N04 N05 N06 N07 N08 N08 N09 N10 N11 N12 N12 N13 N14 N14 N15 N16 N17 N18 N18 N19 N20 N21 N22 N22 N23 N24 N24 第二次采集的40份粪便样品所对应的个体编号 N03 N04 N05 N08 N09 N09 N12 N14 N18 N23 N24 N25 N26 N26 N26 N27 N28 N29 N30 N30 N31 N32 N32 N33 N33 N33 N34 N35 N36 N37 N38 N39 N40 N41 N42 N43 N44 N44 N45 N46 (1)图2中个体B的“基因型”为______。 (2)使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和______的数目决定的。 (3)科学家根据表1信息，使用了______法的原理来估算这个岛上貉的种群数量，计算过程及结果为______。 (4)在上述研究基础上，利用现有DNA样品，设计一个实验方案，了解该岛貉种群的性别比例______。 【答案】(1)174/174 (2)每个微卫星“基因”的“等位基因” (3) 标记重捕 根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。 (4)选取X和Y染色体上长度不同的DNA片段，设计貉的特异性引物，对现有DNA样品进行扩增。产物中只有X片段为雌性，同时有X和Y片段的为雄性。计数46个个体中的雌雄数目，可得性别比例 【详解】（1）从图 2 中可知，个体 B 扩增后的电泳条带对应的片段只有长度为 174 ，根据 “以片段长度命名” 等位基因进而确定基因型的规则，个体 B 的 “基因型” 为 174/174。 （2）根据题干信息 “每个位置的微卫星 DNA 可视为一个‘基因’，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星‘基因’可以有多个‘等位基因’，能组成多种‘基因型’，分析多个微卫星‘基因’，可得到个体特异的‘基因型’组合，由此区分开不同的个体” 可知，使用微卫星 DNA 鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星 “基因” 的数目和重复单位的数目决定的。 （3）科学家采用了标记重捕法的原理来估算种群数量。第一次采集 30 份粪便样品鉴定出 24 个不同个体（相当于标记数M=24），第二次采集 40 份粪便样品鉴定出 32 个不同个体（相当于重捕数n=32），其中两次都有的个体数为 10 个（相当于重捕中被标记的个体数m=10）。根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上貉的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。 （4）选取X和Y染色体上长度不同的DNA片段，设计貉的特异性引物，对现有DNA样 品进行扩增。产物中只有X片段为雌性，同时有X和Y片段的为雄性。计数46个个体中的雌雄数目，可得性别比例。 4．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生___________的过程称为细胞分化，分化是基因___________的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测___________。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称_____（略）。 【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达 (2)C (3)各组织器官中G和H的mRNA (4) 【详解】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。 （2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB正确； C、由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误； C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选C。 （3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的 mRNA。 （4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，可将图B所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如下： 。 5．（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。 (1)嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生___________，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的___________将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。 (2)初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于___________序列所编码的蛋白区段。 (3)为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由___________组成。 (4)在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。 如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因______。 【答案】(1) 兴奋/动作电位/神经冲动 突触 (2)非保守 (3)长度相同但非保守序列不同的DNA片段 (4)少量的气体分子通过活化的G蛋白、活化的C酶，在C酶的催化下合成大量的cAMP使Na+通道打开，Na+内流，神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知 【详解】（1）气味分子刺激感受器产生兴奋。嗅觉神经元轴突末端、神经元间隙与下一个神经元组成突触，包括突触前膜、突触间隙和突触后膜。 （2）不同气味受体能特异性识别相应气味分子的关键在于蛋白质中结构不同的部分，由非保守序列编码。 （3）由图可知，PCR产物含保守序列和非保守序列，若非保守序列不同，酶切产物的长度可能不同，导致酶切片段长度之和大于PCR产物长度，因此PCR产物由长度相同但非保守序列不同的DNA片段组成。 （4）由图丙可知，少量的气体分子通过活化G蛋白使得C酶活化，在C酶的催化下，由ATP合成大量的cAMP ，促使Na+通道打开，Na+内流，导致神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知。 6．（2022·北京·高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 (1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是_______。 (2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是_______，因而被用于制备监测鱼（MO）。 (3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子：____。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因：______ A．GFP    B．Gal4    C．雌激素受体基因（ER）  D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） (4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后_______造成不育。 (5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是_______。 【答案】(1)显微注射 (2)监测灵敏度更高 (3) ② D (4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 (5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。 （2）由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2 E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。 （3）MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。 （4）成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。 （5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。 7．（2020·北京·高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 （1）纤维素属于__________糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是__________。 （2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为____________________。 （3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是__________。 （4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为____________________。 （5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用__________。（举一例） 【答案】 多 葡萄糖 密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 BamHI、SmaI（顺序不能调换） 向培养基中接种降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌B菌 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染 【详解】（1）纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。 （2）由于密码子具有简并性，所以即使克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。 （3）根据题干信息“以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”，所以B链的方向是从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B链3'应该用BamH I进行切割，而其5'端应该用SmaI进行切割。 （4）本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1不作处理，组3是添加工程菌，组2的处理是向培养基中接种降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌B菌。 （5）该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。 / 学科网（北京）股份有限公司 $