1.2纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得第2课时课件-2025-2026学年高二下学期生物浙科版选择性必修3

第二节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得 第一章 发酵工程 第2课时 本章学习目标 1.阐明使用无菌技术可获得纯净的微生物培养物。 2.概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法。 3.举例说明通过调整培养基的配方，可有目的地培养某种微生物。 4.概述测定微生物数量的稀释涂布平板法和显微镜计数法。 5.举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。 获得了目标微生物的纯种，就为深入研究这种微生物奠定了基础。接下来可能需要知道这种微生物的繁殖速度，但微生物的个体微小，很难直接观察到它们的数目变化。同时发现，平板上的菌落即使是分开的，也可能难以数清其数量。如果菌落太多，准确数出菌落数并不容易，这会导致最终的计算结果出现较大误差。而菌液稀释度过大，菌落数少，虽然容易准确计数菌落数，但可能存在较大的随机误差。要解决这个问题可以从两个方面着手：一是在保证能准确计数的前提下减小稀释度；二是将相同稀释度下的多组数值取平均值后再进行计算。 情境导入 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 1.稀释涂布平板法 2.显微镜直接计数法 ——间接计数法 ——直接计数法 1.间接计数法 — 稀释涂布平板法 选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 统计的菌落往往比活菌的实际数目低； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示； 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 计数原则: 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量 计算公式: 每g样品中的菌落数＝ (C÷V)×M M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 （234÷0.1）×106=2.34×109 答 B 例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是25、32、18，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （25+32+18）/3 0.1 × 105 =2.5 ×107个 稀释涂布平板法可测定微生物的数量 某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 请评价这两位同学的实验结果的有效性： 1.甲同学____________________________________； 原因是____________________________________。 2.乙同学____________________________________； 原因是____________________________________。 实验操作不合理 未设置重复实验组 结果计算不合理 21与另外两组数值相差太大，应舍去 稀释涂布平板法可测定微生物的数量 借助于显微镜、血细胞计数板也能在显微镜下直接对菌液中的酵母细胞进行计数。 图是一种较常用的血细胞计数板。 缺点： a.不能区分死菌和活菌→偏大。 b.不适于对运动细菌的计数。 c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。 优点： 快速、直观 血细胞计数板： 细菌计数板： 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 显微镜计数法可测定微生物的数量 血细胞计数板 容积为0.1mm3=0.1μL=1 血细胞计数板中间被一个短横槽隔为两半，每个半边上刻有一个方格网(图A)。每个方格网上有9个大方格，只有中间一个大方格为计数室，供计数用。计数室(大方格)长和宽各为1mm，深度为0.1mm 计数室 请试着计算大方格的容积是多少？并换算成微升、毫升。 （1）抽样检测法估算试管中的酵母菌总数 图A 显微镜计数法可测定微生物的数量 大方格 中方格 小方格 25(中格)×16(小格) 不管计数室是哪一种,每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。 16(中格)×25(小格) 取四角的四个中方格(100个小方格)计数 取四个角和中央的五个中方格(80个小方格)的细胞数。 计数室 （1)抽样检测法估算试管中的酵母菌总数： 显微镜计数法可测定微生物的数量 若使用的血细胞计数板(规格为1 mm×1mm ×0.1mm)每个计数室分为25个中方格，每个 中方格又分为16个小方格，将样液稀释100倍 后计数，发现计数室四个角及中央共5个中方 格内的酵母菌总数为20个， 则培养液中酵母菌的密度为_______________。 1×108个/mL （1）抽样检测法估算试管中的酵母菌总数 试着总结两种计数室估算1mL样品中酵母菌数的公式是什么？ 显微镜计数法可测定微生物的数量 = 80 ×400×104×稀释倍数 A1+A2+A3+A4+A5 1mL样品中酵母菌数= A1+A2+A3+A4+A5 80 ×400÷0.1mm3×稀释倍数 A1、A2、A3、A4、A5分别为五个中方格中的酵母菌数。 25×16型 A1 A2 A3 A4 A5 1mm3=10-3mL （1）抽样检测法估算试管中的酵母菌总数 显微镜计数法可测定微生物的数量 = 100 ×400×104×稀释倍数 A1+A2+A3+A4 16×25型 A1 A2 A4 A3 1mL样品中酵母菌数= A1、A2、A3、A4分别为四个中方格中的酵母菌数。 A1+A2+A3+A4 100 ×400÷0.1mm3×稀释倍数 1mm3=10-3mL （2）抽样检测法估算试管中的酵母菌总数 显微镜计数法可测定微生物的数量 当小方格中的酵母菌过多时，可以增大稀释倍数然后再计数，即计数前应摇匀→取样→稀释→计数。 用无菌水稀释至每小格细胞数目为5~10 个 稀释100倍 （3）如果一个小方格内酵母菌数量过多，难以数清，应当采取什么措施？ 显微镜计数法可测定微生物的数量 ①对于压在边线上的酵母菌应取相邻两边及顶角计数。 ②对于已经出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算；已死亡的酵母菌不计数。 ③每个样品一般计数三次，取其平均值。(遵循平行重复原则) （4）对于压在中方格界线上的酵母菌和酵母菌芽体，应当怎样计数？ 显微镜计数法可测定微生物的数量 选择培养基：在培养基中添加（或减去）某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。 1.概念： 2.方法： 分离得到酵母菌、霉菌等 分离固氮菌 分离自养型微生物 不加含碳有机物的培养基 不加氮源的培养基 加入青霉素的培养基 （1）在培养基中加入某种化学物质。 分离得到金黄色葡萄球菌 加入高浓度食盐的培养基 （2）改变培养基中的营养成分。 （3）改变微生物的培养条件。 耐高温微生物 高温环境下培养 厌氧型微生物 兼性厌氧型 无氧环境下培养 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 类型 条件 分离得到的菌种 （1）改变培养条件 （2）添加某种化学物质 （3）营养缺陷 70～80℃的高温 水生栖热菌 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌 高浓度食盐 金黄色葡萄球菌 不加含碳有机物 不加氮源 自养型微生物 固氮菌 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 实验原理：因为微生物分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，若在培养基中加入在酸性情况下呈黄色、碱性情况下呈红色的酚红指示剂，就可根据菌落周围是否出现红色区域，进一步鉴定尿素分解菌。 方法： 呈碱性，遇酚红指示剂呈红色。 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。 可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 液体培养基： 可以直接看液体的变色情况； 固体培养基： 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 1.利用选择培养基分离能产生脲酶的微生物。 2.观察微生物代谢改变环境pH的现象。 3.利用稀释涂布平板法对微生物进行计数。 目的要求 材料用具 土壤样品，蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1mol/LHCl，琼脂，琼脂糖，葡萄糖，KHPO4，酚红，蒸馏水，尿素溶液，三角瓶，烧杯，培养皿，有塞试管，试管架，移液器，G6玻璃砂漏斗，装有75%酒精的广口瓶，涂布器，酒精灯，火柴，高压灭菌锅，恒温培养箱等。 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 1.制备培养基。 方法步骤 葡萄糖 0.1g Nacl 0.48g KH2PO4 0.48g Na2HPO4 2.1g 酚红 1mg 琼脂 2g 蒸馏水 60ml ①提供无机盐； ②调节pH 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 2.灭菌。 3.倒平板。 方法步骤 酒精灯旁 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 4.制备土壤细菌悬液。 方法步骤 A.梯度稀释菌液 10-2 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 9 mL 无菌水 99mL无菌水 1g 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 5.接种。 方法步骤 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液器（枪）： 可精准吸取少量液体，有不同量程，配合对应规格的一次性灭菌枪头使用 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 6.培养。将培养皿倒置，置于37℃恒温培养箱中培养24~48h。 方法步骤 5.实验结果： LB培养基 尿素培养基 在估算土壤中能分泌脲酶的微生物的数量时，应统计哪个稀释度的培养皿？为什么？ 应统计稀释度为10-3的3个培养皿中的菌落数后取平均值。因为这个浓度的培养皿中菌落数比较适中，计数的结果误差较小。 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 5.实验结果： LB培养基 尿素培养基 这些微生物能够合成脲酶而将尿素分解成氨。氨可使培养基的碱性增强，使含酚红指示剂的培养基变成红色。 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 合理，因为自生固氮微生物能在固氮酶的作用下，将N2转化为可利用的氮源，故可在没有氮源的培养基上生长。 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实验结果 课堂小结 随堂小测 1.臭豆腐是中国传统美食。制作时，需要将豆腐浸入含有乳酸菌、芽孢杆菌等微生物的卤汁中发酵。为探究卤汁中细菌的种类和数量，某兴趣小组采用如图方法进行实验。下列说法正确的是(   ) A.实验前，微生物培养的器皿、接种工具、操作者的手等应进行灭菌 B.若用该方法培养了3组，菌落数分别为65、63、64，则 可以推测每毫升卤汁中所含细菌数约为6.4×106个 C.该方法测得的结果通常比实际值大 D.若使用显微镜直接计数，统计结果通常比实际值大 答案：D 解析：消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物；灭菌则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物,操作者的手应进行消毒处理,A错误。该方法培养的3组培养基上的菌落均适合计数,故每毫升卤汁中所含细菌数约为(63+64+65)÷3:0.1×105=6.4×107(个),B错误。当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,所以该方法测得的结果通常比实际值小,C错误。利用显微镜直接计数时,由于不能区分活菌和死菌,统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和,因此统计结果通常比实际数值大,D正确。 随堂小测 2.刚果红可与纤维素形成红色复合物，某同学以纤维素为唯一碳源制作的培养基中添加了刚果红，然后用如右图的方法进行接种纤维素分解菌，下列说法正确的是(   ) A.该接种方法既能分离提纯微生物，还能对微生物进行计数 B.从用途的角度分，该培养基既是选择培养基，又是鉴别培养基 C.该过程中需对接种环进行灼烧灭菌，且灭菌次数为4次 D.划线区域形成的菌落周围呈红色，且红色区域直径越大， 说明纤维素分解菌的分解能力越强 答案：B 解析：A、该接种方法是平板划线法，只能分离提纯微生物，不能对微生物进行计数，稀释涂布平板法可计数，A错误； B、该培养基以纤维素为唯一碳源，属于选择培养基；添加刚果红，可鉴别纤维素分解菌，属于鉴别培养基，B正确； C、平板划线法中，接种环需在每次划线前和划线结束后灼烧灭菌，灭菌次数多于4次，C错误； D、纤维素分解菌周围的纤维素被分解，刚果红—纤维素复合物消失，形成透明圈，透明圈直径越大，分解能力越强，D错误。 故选B。 $