专题06 PCR技术的原理与实践应用（5大题型突破）（重难点训练）生物人教版选择性必修3

专题06 PCR技术的原理与实践应用 （5大常考题型+通关测试） 1．（多选）（2025·河北·高考真题）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（    ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 2．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 3．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 题型突破01 PCR技术中的引物 1．PCR引物设计是分子生物学实验中的关键环节，其质量直接影响到PCR的特异性和效率。下列相关说法错误的是（　　） A．GC含量会影响引物与模板结合的稳定性 B．引物的3'端可以添加限制酶识别序列，而5'端不可以 C．长度过短的引物，与模板链的结合力弱 D．引物自身及引物之间不可以存在互补序列 2．目的基因A含有100对碱基，其中腺嘌呤占30%，现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物I、引物Ⅱ，用PCR技术扩增该目的基因，结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是（    ） A．PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代 B．含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，需要两种引物共250个 C．PCR过程与体内DNA复制的方式相同，都需要DNA聚合酶的参与 D．若只考虑目的基因A，经PCR循环50次需要鸟嘌呤（250-1）×40个 3．下列关于PCR扩增DNA的叙述，错误的是（    ） A．用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列 B．DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸 C．复性是在72℃左右使两种引物与模板链结合 D．引物序列过短，使PCR产物特异性较差 题型突破02 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 4．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正、反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（　　）    A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关 C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度的片段时，可以说明目的基因正接 D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度的片段时，可以说明目的基因反接 5．人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值，现可以用基因工程技术获取重组HSA（rHSA）。下图甲为获取的含有目的基因（HSA基因）的DNA片段，Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。请回答下列问题： (1)三种限制酶中能产生相同黏性末端的是 ；为了使目的基因与质粒定向连接，切割图甲所示DNA片段的最佳方案是选用 酶，所得重组质粒 （填“能”、“不能”或“不一定能”）被BamHⅠ切割。 (2)获取ISA基因还可以通过下列方式：首先采集人的血液，从中提取 合成总cDNA，然后以cDNA为模板用PCR扩增ISA基因。与基因组文库获取的目的基因相比，利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其基因结构的特点是不含 。 (3)生物技术的发展和应用使利用动物生产人的血清蛋白成为可能，下图是上海某研究所培育生产出血清蛋白奶牛的流程，请据图回答。 ①为了获得大量早期胚胎，可对囊胚进行分割，此时要注意将 均等分割。胚胎移植的实质是 。 ②在进行性别鉴定时，需要取囊胚的 细胞做DNA分析。据图分析，小牛1、2、3的性别是 性。 题型突破03 PCR技术引导基因定点突变 6．蛋白质工程中可以利用引物引导的方法对DNA进行定点突变，进而改变蛋白质的特定氨基酸。图为这种定点突变方法的实验流程。(在细菌体内合成的DNA分子有甲基化修饰，通过PCR扩增的DNA链无甲基化修饰)，下列叙述错误的是（    ） A．要改造蛋白质应首先从设计控制该蛋白质的基因的脱氧核苷酸序列出发 B．蛋白质工程的实质是通过改造或合成基因来改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质 C．图中用于突变的两条引物之间能发生碱基互补配对 D．限制酶能识别质粒中发生甲基化的位点，待突变质粒的甲基化修饰不会影响PCR扩增 7．利用重叠延伸PCR技术可对基因进行定点突变，如图为相关过程，下列叙述错误的是（    ） A．为获得产物甲，过程②至少循环2次 B．过程②和过程③不可以在同一体系中进行 C．过程④中，杂交延伸无需添加引物 D．若突变后基因扩增30轮，则消耗引物231个 题型突破04 利用重叠延伸PCR技术构造融合基因 8．（多选）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，再通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。图示为利用融合PCR技术构建CMP—GFP融合基因的基本过程（CMP为黄瓜花叶病毒运动蛋白基因，表达产物参与病毒在细胞间的转移；GFP为绿色荧光蛋白基因）。相关叙述正确的是（    ） A．除图示外，融合PCR还需dNTP、解旋酶以及含Mg2+的缓冲液等 B．引物1需添加限制酶识别序列，引物2需添加与引物3部分互补的序列 C．重叠延伸时，两条链分别为a、d或b、c，两者互作模板和引物 D．CMP—GFP融合基因在受体细胞中表达可追踪病毒在细胞间的转移途径 9．金黄色葡萄球菌类肠毒素K(SEIK)可促进人体免疫应答，诱导淋巴细胞释放细胞因子。为研究SEIK作用机制，科研人员利用重叠延伸PCR和无缝克隆技术构建了携带SEIK和GFP（绿色荧光蛋白）融合基因的工程菌，部分过程如下图。请回答下列问题。        (1)PCR的原理是 。PCR时，复性温度过高会影响 ，从而导致目标产物减少。 (2)研究发现，SEIK基因和GFP基因的编码链（非模板链）碱基序列分别为： 5'-AAGGTGATATAGGAA……AGAGCCACCTCCGCC-3' 5´-TGAACCGCCTCCACC……GGCATCGACGAGCTG-3ˊ 则在PCR1反应体系中加入的引物F1、R1分别为 、 （从①~④中选填）。 序号 引物碱基序列 ① 5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3' ② 5'-ACGAGTGGATCACTCAAGGTGATATAGGAA-3' ③ 5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT-3' ④ 5'-AACATAGACATGTGCAAGGTGATATAGGAA-3' (3)无缝克隆时，T5核酸外切酶作用的化学键是 。过程①中，T5核酸外切酶水解脱氧核苷酸链的长度应大于同源序列长度，目的是 。过程③所需的酶有 。 (4)构建的表达载体通常经 （方法）进行鉴定与验证。将转化后的大肠杆菌接种于含 的选择培养基中培养，一段时间后再挑取 的菌落纯化培养。 (5)为检测SEIK-GFP融合蛋白的生物活性，科研人员分别对小鼠注射缓冲液、SEIK溶液、GFP溶液和SEIK-GFP溶液，定时测定小鼠体内干扰素-γ(IFN-γ)含量，结果如图。    ①实验中设置GFP溶液组作为对照的目的是 。 ②研究表明，可利用SEIK-CFP融合蛋白研究SEIK作用机制，依据是 ，且能对SEIK的作用进行定位追踪。 10．重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到了LTB基因和STI基因片段，并用重叠延伸PCR技术构建了LTB—STI融合基因，其过程如图1所示。    (1)利用PCR技术扩增LTB基因和STI基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链﹐还需要加入 、 。PCR过程中，使DNA解旋的方法是 。 (2)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列 （填“能”或“不能”）互补；引物P2与引物P3的碱基序列 （填“能”或“不能”）部分互补。从引物P2和引物P3的角度分析，LTB基因的PCR过程与STI基因的PCR过程不能在同一个反应体系中同时进行，原因是 。 (3)DNA子链是从其5′端向3′端延伸的。为了使重叠链顺利延伸，LTB基因与STI基因的PCR过程至少需要进行 次循环才能得到目的链L、S。目的链L、S构成了杂交链。在杂交链延伸生成LTB-STI融合基因的过程中， （填“需要”或“不需要”）加入引物。在下图中的小方框内标出杂交链两条母链各自的3′端和5′端 。    (4)科研小组为了检测是否成功构建出LTB—STI融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如图2所示。则LTB—STI融合基因最可能是 （填“1”或“2”或“3”），判断依据是 。 (5)获得LTB—STI融合基因后，若要大量扩增该序列，可选择图中引物 继续进行PCR。 题型突破05 电泳鉴定 11．琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列说法错误的是（    ） A．配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离 B．PCR扩增时，引物特异性较弱会使电泳出现多条条带 C．配制琼脂糖溶液时加入的指示剂可用于监测电泳进程 D．向两个加样孔内加相同分子大小的DNA样品，得到的电泳条带位置可能不同 12．PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列相关叙述错误的是（    ） A．DNA迁移的方向主要取决于电场，而与缓冲液的酸碱度基本无关 B．待分离的DNA片段较小时，实验所用琼脂糖凝胶的浓度宜稍高些 C．DNA电泳鉴定时需预先将染料加入凝胶中以使待测DNA充分染色 D．对PCR产物电泳，结果符合预期的DNA片段通常还需进行基因测序 13．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（　　） A．DNA粗提取时，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 B．提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后即可变为蓝色 C．凝胶电泳时，DNA分子越大，迁移速率越快 D．电泳鉴定时，如果扩增结果不止一条条带可能是因为引物设计过短、退火温度过低等原因 建议时间：30分钟 一、单选题 1．PCR可看作生物体外特殊的DNA复制过程。如图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链延伸的基础。下列叙述正确的是（　　） A．①为逆转录，核酸酶H可将杂交双链中的DNA水解，为PCR提供原料 B．PCR扩增时反应体系需加入模板、RNA引物、含Mg²⁺的缓冲液等成分 C．③为变性，使用90-95℃的高温处理是为断开引物与模板间形成的氢键 D．⑤为延伸，温度控制在70-75℃之间以提高相关酶活性，缩短延伸时间 2．引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是（　　） A．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 B．适当提高退火温度会增加PCR产生非特异性产物的可能性 C．想在目的基因两端增加限制酶切位点，相应碱基序列应加在引物的3端 D．经过30次PCR循环，消耗引物和原料，合成了230个目的基因 3．甲植物因细胞核中具有特异性DNA序列(a)而具有耐盐碱效应；乙植物因细胞质中具有特异性DNA序列(b)而具有高产效应。科研人员将甲、乙两种植物体细胞杂交，获得了耐盐碱、高产再生植株，并通过PCR技术来鉴定。已知M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。下列有关叙述错误的是（　　） A．植物体细胞杂交技术打破了生殖隔离，实现了远缘杂交育种 B．鉴定时，提取、纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板 C．总DNA加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；同理扩增序列b D．产物电泳后，若分别在凝胶中均出现预期的2个条带，可确定再生植株来自杂种细胞 4．关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验I）和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验II）的实验，下列相关叙述正确的是（    ） A．粗提取的DNA产物以及PCR产物均可通过电泳检测 B．实验Ⅰ鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 C．实验Ⅰ中，将白色丝状物加入二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA D．实验Ⅱ中，先在加样口加入PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液，再将电泳缓冲液加入电泳槽并没过凝胶1mm后，电泳、观察 5．实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术，可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA，然后进行PCR，反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。 下列推测不合理的是（    ） A．探针与cDNA单链的结合具有特异性 B．淬灭基团与荧光基团间距离影响荧光强度 C．CT值越小则提取到的病毒RNA含量越低 D．病毒发生单个碱基的突变可能不影响检测结果 6．下列无法通过PCR实现的是（　　） A．以环状DNA为模板直接扩增出大量环状DNA B．从一个双链DNA分子中扩增出某个特定片段 C．在人胰岛素基因上游加上大肠杆菌RNA聚合酶的识别序列 D．将基因上决定异亮氨酸的核苷酸序列替换为决定半胱氨酸的核苷酸序列 7．科研人员欲将某目的基因导入大肠杆菌质粒中保存，该质粒上有EcoRI、XhoI、MunI、SalI和NheI限制酶识别序列，质粒和目的基因的结构图示如下。下列相关叙述错误的是（　　） A．构建的重组质粒中PO位于目的基因的上游，转录方向为顺时针 B．在设计PCR引物时，应在两种引物上添加XhoI和MunI限制酶识别序列 C．在添加氨苄青霉素和X-gaI的培养基上，导入重组质粒的大肠杆菌形成白色菌落 D．图中质粒还应有终止密码子序列，使目的基因翻译终止 8．通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点。有关叙述正确的是（　　） A．两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入 B．在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等 C．第2轮PCR,引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因 D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8 9．乙肝疫苗是通过基因工程将乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的基因导入酵母菌中表达，再利用发酵工程大规模生产获得的。已知HBsAg不能被酵母菌分泌到细胞外。下列相关叙述错误的是（　　） A．为了提高转基因的成功率，可以通过PCR技术扩增基因 B．可以利用抗HBsAg抗体在分子水平上检测基因的表达产物 C．可利用酵母菌大量生产乙肝疫苗，在发酵之前需要对菌种进行扩大培养 D．发酵结束后从培养液中提取HBsAg，并对提取的HBsAg进行纯化、灭活 10．反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如图所示。下列说法正确的是（    ） A．应选择引物2和引物3进行PCR扩增 B．复性的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关 C．PCR产物不含EcoRI的酶切位点 D．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 二、多选题 11．实时荧光定量 PCR 简称 qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的 Taqman 探针与待测样本 DNA 混合，当探针完整时，不产生荧光。在 PCR 过程中， 与目的基因结合的探针被 TaqDNA 聚合酶水解，R 与 Q 分离后，R 发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光（如图所示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得 Ct 值（该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述错误的是（    ） A．每个模板 DNA 分子含有 4 个游离的磷酸基团 B．在反应过程中，需要 ATP 为新链的合成提供能量 C．做 qPCR 之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和 Taqman 探针 D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小 12．不对称PCR是一种大量制备单链DNA的手段，PCR的两种引物添加的量不同，一种引物添加较多，称非限制性引物，另一种引物添加较少，称限制性引物，在PCR的前10个循环中，两条链的扩增均正常进行，第11～30个循环中，限制性引物耗尽，仅通过非限制性引物扩增其中一条链，下列相关叙述正确的有（    ） 单链DNA 5'-AACCGCTCATCTAAG……CCTAGCTAGTCAACC-3' 引物1 5'-AACCGCTCATCTAAG-3' 引物2 5'-GGTTGACTAGCTAGG-3' A．若要大量制备表格中的单链DNA，引物2是限制性引物，引物1是非限制性引物 B．在PCR的第11～30个循环，延伸时间应当明显短于前10个循环 C．若PCR开始之前有a个模板DNA分子，限制性引物至少需要（210-1）a个分子 D．若PCR开始之前有a个模板DNA分子，非限制性引物至少需要（20×210-1）a个分子 三、解答题 13．同源重组技术结合tet-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。如图是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tet'是四环素抗性基因，sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。回答下列问题。    (1)过程①PCR除需要加入耐高温的DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、Mg2+、引物外，还需加入 ，其中引物的作用是 。 (2)为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P1、P2时，需分别在引物5'端添加限制酶 的识别序列；若sacB基因扩增5代，则需要引物P1 个。 (3)过程③中，需先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种 的生理状态。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加 。 (4)如图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，根据已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度可推测PCR产物的长度，因此可判断泳道 对应的菌株可能转化成功。过程⑤PCR中设计引物P3、P4时，需在引物5'端分别添加 基因两端的同源序列。    (5)过程⑦中，在含有四环素和X-gal的培养基中出现了 色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tet'-sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加 。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题06 PCR技术的原理与实践应用 （5大常考题型+通关测试） 1．（多选） 【答案】AB 2． 【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 (3) 细胞表面发出黄色荧光 高 (4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 (5) ① ③ 3． 【答案】(1) 序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 题型突破01 PCR技术中的引物 1． 【答案】B 2． 【答案】B 3． 【答案】C 题型突破02 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 4．   【答案】C 5． 【答案】(1) BamHⅠ和Sau3AⅠ BamHⅠ和EcoRⅠ 不一定能 (2) mRNA 非编码区（启动子、终止子）、内含子 (3) 内细胞团 早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移 滋养层 雌 题型突破03 PCR技术引导基因定点突变 6． 【答案】A 7． 【答案】D 题型突破04 利用重叠延伸PCR技术构造融合基因 8．（多选） 【答案】BD 9． 【答案】(1) DNA半保留复制 引物与模板链结合 (2) ② ③ (3) 磷酸二酯键 使同源序列间能完全互补配对 DNA聚合酶和DNA连接酶 (4) （酶切或 PCR、）电泳 卡那霉素 绿色荧光强度高 (5) 证明GFP对小鼠体内干扰素-γ的释放量无影响 SEIK-GFP 融合蛋白生物活性并未明显改变 10． 【答案】(1) 耐高温的TaqDNA聚合酶 4种脱氧核苷三磷酸（dNTP） 高温（或90—95℃）处理 (2) 不能 能 引物P2和引物P3之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程 (3) 2 不需要    (4) 3 LTB—STI融合基因包含2个不同的基因，其分子量较大，3表示的DNA分子量最大（或1和2与M中碱基对数为1000bp和2500bp的对照基因的电泳结果相同，3的碱基对数大约是1和2的碱基对数之和） (5)引物P1和引物P4 题型突破05 电泳鉴定 11． 【答案】C 12． 【答案】A 13． 【答案】D 建议时间：30分钟 一、单选题 1． 【答案】D 2． 【答案】A 3． 【答案】D 4． 【答案】A 5． 【答案】C 6． 【答案】A 7． 【答案】D 8． 【答案】A 9． 【答案】D 10． 【答案】B 【详解】A、DNA子链合成的方向为5'端到3'端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A错误； B、GC碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，复性的温度也越高；DNA 聚合酶的延伸速度相对固定，扩增片段越长，所需延伸时间越长，B正确； C、对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，PCR产物包含位置序列末端的EcoRI的酶切位点，C错误； D、PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，D错误。 故选B。 二、多选题 11． 【答案】ABD 12． 【答案】AC 三、解答题 13． 【答案】(1) 模板DNA（或质粒1） 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) BamHI、EcoRI 31 (3) 能吸收周围环境中DNA分子 四环素 (4) 4、5、7 LacZ (5) 白 蔗糖和X-gal / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题06 PCR技术的原理与实践应用 （5大常考题型+通关测试） 1．（多选）（2025·河北·高考真题）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（    ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 【答案】AB 【分析】分析题意可知，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接，故出现染色体倒位。 【详解】A、某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男性中发病率为1/3500，则该致病基因d频率为1/3500，正常基因D基因频率为3499/3500，女性中携带者的占比为2×1/3500×3499/3500，A错误； B、该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd，该男孩基因型为XdY，该男孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增出产物来，母亲有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果不同，B错误； C、该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变，C正确； D、利用S1和S2进行PCR检测，有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。 故选AB。 2．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 (3) 细胞表面发出黄色荧光 高 (4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 (5) ① ③ 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 （2）观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 （3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。 （4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 3．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】(1) 序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 题型突破01 PCR技术中的引物 1．PCR引物设计是分子生物学实验中的关键环节，其质量直接影响到PCR的特异性和效率。下列相关说法错误的是（　　） A．GC含量会影响引物与模板结合的稳定性 B．引物的3'端可以添加限制酶识别序列，而5'端不可以 C．长度过短的引物，与模板链的结合力弱 D．引物自身及引物之间不可以存在互补序列 【答案】B 【详解】A、GC碱基对含3个氢键，比AT碱基对更稳定，GC含量高的引物与模板结合更牢固，A正确； B、引物的3'端必须严格与模板配对以确保DNA聚合酶延伸，而5'端可添加限制酶识别序列等额外序列，B错误； C、引物过短会减少与模板的结合位点，降低结合特异性及稳定性，C正确； D、引物自身互补会形成二级结构，影响PCR效率，D正确。 故选B。 2．目的基因A含有100对碱基，其中腺嘌呤占30%，现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物I、引物Ⅱ，用PCR技术扩增该目的基因，结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是（    ） A．PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代 B．含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，需要两种引物共250个 C．PCR过程与体内DNA复制的方式相同，都需要DNA聚合酶的参与 D．若只考虑目的基因A，经PCR循环50次需要鸟嘌呤（250-1）×40个 【答案】B 【详解】A、PCR的实质是DNA的半保留复制，该过程需经过高温变性、低温复性、中温延伸，PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代，A正确； B、含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，产生250个子代DNA，每个DNA分子需要2个引物，亲本DNA除外，故需要两种引物共（251-2）个，B错误； C、PCR过程与体内DNA复制的方式相同，都是半保留复制，都需要DNA聚合酶的参与，C正确； D、由题意可知，目的基因A含有100对碱基，其中腺嘌呤占30%，则G占20%，为40个，若只考虑目的基因A，经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个，D正确。 故选B。 3．下列关于PCR扩增DNA的叙述，错误的是（    ） A．用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列 B．DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸 C．复性是在72℃左右使两种引物与模板链结合 D．引物序列过短，使PCR产物特异性较差 【答案】C 【详解】A、PCR扩增需要设计引物，引物需根据目的基因两端的已知序列设计，因此，用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列，A正确； B、DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链，因该酶需结合到双链区并沿模板合成，B正确； C、复性的温度通常为50℃左右，此时引物与模板结合；72℃是延伸阶段的温度，此时DNA聚合酶催化合成新链，C错误； D、引物过短会导致与模板结合的特异性降低，易与非目标序列结合，使产物中出现非特异性扩增，D正确。 故选C。 题型突破02 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 4．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正、反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（　　）    A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关 C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度的片段时，可以说明目的基因正接 D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度的片段时，可以说明目的基因反接 【答案】C 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按 碱基互补配对的原则结合，再调 温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确； B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确； C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，扩增片段的长度均为450bp，C错误； D、选取引物甲、乙，扩增出400bp长度的片段时，可以说明目的基因反接，D正确。 故选C。 5．人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值，现可以用基因工程技术获取重组HSA（rHSA）。下图甲为获取的含有目的基因（HSA基因）的DNA片段，Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。请回答下列问题： (1)三种限制酶中能产生相同黏性末端的是 ；为了使目的基因与质粒定向连接，切割图甲所示DNA片段的最佳方案是选用 酶，所得重组质粒 （填“能”、“不能”或“不一定能”）被BamHⅠ切割。 (2)获取ISA基因还可以通过下列方式：首先采集人的血液，从中提取 合成总cDNA，然后以cDNA为模板用PCR扩增ISA基因。与基因组文库获取的目的基因相比，利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其基因结构的特点是不含 。 (3)生物技术的发展和应用使利用动物生产人的血清蛋白成为可能，下图是上海某研究所培育生产出血清蛋白奶牛的流程，请据图回答。 ①为了获得大量早期胚胎，可对囊胚进行分割，此时要注意将 均等分割。胚胎移植的实质是 。 ②在进行性别鉴定时，需要取囊胚的 细胞做DNA分析。据图分析，小牛1、2、3的性别是 性。 【答案】(1) BamHⅠ和Sau3AⅠ BamHⅠ和EcoRⅠ 不一定能 (2) mRNA 非编码区（启动子、终止子）、内含子 (3) 内细胞团 早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移 滋养层 雌 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定： （1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。 （2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）根据图乙分析可知，Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ三种限制酶，产生相同黏性末端的是BamHⅠ和Sau3AⅠ，其黏性末端为(-GATC-)；结合图甲分析可知，Sau3AⅠ会破坏目的基因，应该选择EcoRⅠ和BamHⅠ切割图甲所示DNA片段。质粒上含有EcoRⅠ、Sau3AⅠ的识别位点，Sau3AⅠ与BamHⅠ酶的识别序列不一定相同，故所得重组质粒后，不一定含有BamHⅠ的识别位点，所得重组质粒不一定能被BamHⅠ切割。 （2）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。首先采集人的血液，从中提取mRNA合成总cDNA，然后以cDNA为模板用PCR扩增HSA基因。利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其特点是不含启动子（和终止子）、内含子等。 （3）①对囊胚分割时，要注意将内细胞团 均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。 胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移 ，供体和受体需处于相同生理状态，便于胚胎存活发育。 ②进行性别鉴定时，可取囊胚的滋养层 细胞做DNA分析，因为滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，取其细胞不影响内细胞团发育成个体。分析流程可知，小牛1、2、3来自同一早期胚胎，遗传物质相同，而提供核的是雌性奶牛胚胎细胞（含XX性染色体 ），所以它们的性别是雌性。 题型突破03 PCR技术引导基因定点突变 6．蛋白质工程中可以利用引物引导的方法对DNA进行定点突变，进而改变蛋白质的特定氨基酸。图为这种定点突变方法的实验流程。(在细菌体内合成的DNA分子有甲基化修饰，通过PCR扩增的DNA链无甲基化修饰)，下列叙述错误的是（    ） A．要改造蛋白质应首先从设计控制该蛋白质的基因的脱氧核苷酸序列出发 B．蛋白质工程的实质是通过改造或合成基因来改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质 C．图中用于突变的两条引物之间能发生碱基互补配对 D．限制酶能识别质粒中发生甲基化的位点，待突变质粒的甲基化修饰不会影响PCR扩增 【答案】A 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或合成一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、要改造蛋白质应首先从预期蛋白质的功能出发，设计预期蛋白质的结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因，最终获得所需要的蛋白质，A错误。 B、蛋白质工程的目标是按照人们对蛋白质功能的特定需求对蛋白质的结构进行分子设计，由于基因决定蛋白质，因此对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成，B正确； C、由图可以看出，用于突变的两条引物之间在第三、四幅图（从左往右）中都进行了碱基互补配对（成环、且挨得很近），C正确； D、甲基化修饰属于表观遗传的一种，并不改变基因的碱基序列，只会影响基因的表达过程，不会影响基因的复制，由图可以看出，经限制酶切割后，被甲基化修饰的待突变质粒模板被切割（第四幅图虚线的环），所以图中所示限制酶能够识别质粒中发生甲基化的位点；PCR扩增的实质就是DNA在体外进行的复制，所以待突变质粒的甲基化修饰不会影响PCR扩增，D正确。 故选A。 7．利用重叠延伸PCR技术可对基因进行定点突变，如图为相关过程，下列叙述错误的是（    ） A．为获得产物甲，过程②至少循环2次 B．过程②和过程③不可以在同一体系中进行 C．过程④中，杂交延伸无需添加引物 D．若突变后基因扩增30轮，则消耗引物231个 【答案】D 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（耐高温的DNA聚合酶）。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】A、获得产物甲需要用引物1和2扩增，扩增一次时，引物1延伸的子链与亲代模板链等长，该DNA不符合要求，且该DNA经过第二次复制后得到的两个DNA也不符合要求，扩增一次时，引物2延伸的子链比亲代模板链短，该DNA不符合要求，但该DNA中引物2所在的子链在第二次复制后可形成产物甲，因此为获得产物甲，过程②至少循环2次，A正确； B、过程②和过程③需要扩增的产物不同，且引物2和引物3存在互补的碱基，因此过程②和过程③不可以在同一体系中进行，B正确； C、过程④中两条DNA链部分碱基互补，每条链都可以为另一条链的延伸提供模板，且每条链的3’端都可以向后延伸，因此杂交延伸无需添加引物，C正确； D、DNA复制为半保留复制，每条新形成的子链中都含有引物，若突变后基因扩增30轮，则新形成的子链为230×2－2=231－2，D错误。 故选D。 题型突破04 利用重叠延伸PCR技术构造融合基因 8．（多选）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，再通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。图示为利用融合PCR技术构建CMP—GFP融合基因的基本过程（CMP为黄瓜花叶病毒运动蛋白基因，表达产物参与病毒在细胞间的转移；GFP为绿色荧光蛋白基因）。相关叙述正确的是（    ） A．除图示外，融合PCR还需dNTP、解旋酶以及含Mg2+的缓冲液等 B．引物1需添加限制酶识别序列，引物2需添加与引物3部分互补的序列 C．重叠延伸时，两条链分别为a、d或b、c，两者互作模板和引物 D．CMP—GFP融合基因在受体细胞中表达可追踪病毒在细胞间的转移途径 【答案】BD 【分析】重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术。 【详解】A、除图示外，融合PCR还需dNTP、以及含Mg2+的缓冲液等，但不需要解旋酶，A错误； B、引物1需添加限制酶识别序列，引物2需添加与引物3部分互补的序列，从而为融合基因基因的形成提供引物，B正确； C、重叠延伸时，两条链分别为a、d，两者互作模板和引物，实现融合基因的扩增过程，C错误； D、CMP—GFP融合基因中含有绿色荧光蛋白基因，其在受体细胞中表达可追踪病毒在细胞间的转移途径，D正确。 故选BD。 9．金黄色葡萄球菌类肠毒素K(SEIK)可促进人体免疫应答，诱导淋巴细胞释放细胞因子。为研究SEIK作用机制，科研人员利用重叠延伸PCR和无缝克隆技术构建了携带SEIK和GFP（绿色荧光蛋白）融合基因的工程菌，部分过程如下图。请回答下列问题。        (1)PCR的原理是 。PCR时，复性温度过高会影响 ，从而导致目标产物减少。 (2)研究发现，SEIK基因和GFP基因的编码链（非模板链）碱基序列分别为： 5'-AAGGTGATATAGGAA……AGAGCCACCTCCGCC-3' 5´-TGAACCGCCTCCACC……GGCATCGACGAGCTG-3ˊ 则在PCR1反应体系中加入的引物F1、R1分别为 、 （从①~④中选填）。 序号 引物碱基序列 ① 5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3' ② 5'-ACGAGTGGATCACTCAAGGTGATATAGGAA-3' ③ 5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT-3' ④ 5'-AACATAGACATGTGCAAGGTGATATAGGAA-3' (3)无缝克隆时，T5核酸外切酶作用的化学键是 。过程①中，T5核酸外切酶水解脱氧核苷酸链的长度应大于同源序列长度，目的是 。过程③所需的酶有 。 (4)构建的表达载体通常经 （方法）进行鉴定与验证。将转化后的大肠杆菌接种于含 的选择培养基中培养，一段时间后再挑取 的菌落纯化培养。 (5)为检测SEIK-GFP融合蛋白的生物活性，科研人员分别对小鼠注射缓冲液、SEIK溶液、GFP溶液和SEIK-GFP溶液，定时测定小鼠体内干扰素-γ(IFN-γ)含量，结果如图。    ①实验中设置GFP溶液组作为对照的目的是 。 ②研究表明，可利用SEIK-CFP融合蛋白研究SEIK作用机制，依据是 ，且能对SEIK的作用进行定位追踪。 【答案】(1) DNA半保留复制 引物与模板链结合 (2) ② ③ (3) 磷酸二酯键 使同源序列间能完全互补配对 DNA聚合酶和DNA连接酶 (4) （酶切或 PCR、）电泳 卡那霉素 绿色荧光强度高 (5) 证明GFP对小鼠体内干扰素-γ的释放量无影响 SEIK-GFP 融合蛋白生物活性并未明显改变 【分析】PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： （1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至90℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下一轮反应作准备。 （2）模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 （3）延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。 【详解】（1）PCR的原理是DNA半保留复制。PCR时，复性温度过高会影响引物与模板链的结合，复性是指在一定温度下，引物与模板DNA单链通过碱基互补配对结合的过程，若温度过高，引物与模板链无法有效结合，就会导致后续的延伸过程无法正常进行，从而使目标产物减少。 （2）在PCR1反应体系中，是对SEIK基因进行扩增，引物的作用是与编码链的3'端互补配对，引导DNA聚合酶进行子链的合成，已知SEIK基因的编码链碱基序列为5'-AAGGTGATATAGGAA……AGAGCCACCTCCGCC-3'，对应的互补链为3'-TTCCACTATATCCTT……TCTCGGTGGAGGCGG-5'，引物F1是用于扩增SEIK基因的编码链的引物，应与SEIK基因编码链的互补链的3'端结合，所以与编码链的5'端部分序列相同且添加了同源序列1（5'-ACGAGTGGATCACTC-3'），所以F1为5'-ACGAGTGGATCACTCAAGGTGATATAGGAA -3'，即②，引物R1是用于扩增SEIK基因的非模板链的引物，应与SEIK基因非模板链3'端部分序列互补，而非模板链的序列为5´-TGAACCGCCTCCACC……GGCATCGACGAGCTG-3ˊ，所以R1为5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT -3'，即③。 （3）无缝克隆时，T5核酸外切酶作用的化学键是磷酸二酯键。过程①中，T5核酸外切酶水解脱氧核苷酸链的长度应大于同源序列长度，目的是使融合基因两端露出足够长度的同源序列，以便在后续过程中能够使同源序列间能完全互补配对。过程③是将线性化载体和目的基因连接形成重组质粒的过程，所需的酶有DNA连接酶和DNA聚合酶，DNA连接酶可以连接DNA片段之间的磷酸二酯键，DNA聚合酶可以填补可能存在的缺口。 （4）构建的表达载体通常经（酶切或 PCR）电泳进行鉴定与验证，PCR可以检测目的基因是否存在，酶切可以验证载体和目的基因的连接情况，电泳可以检测目的基因的条带大小是否正确。由图可知，表达载体中含有卡那霉素抗性基因，所以将转化后的大肠杆菌接种于含卡那霉素的选择培养基中培养，只有成功导入表达载体的大肠杆菌才能在该培养基上生长，一段时间后再挑取绿色荧光强度高的菌落纯化培养，因为构建的是携带SEIK和GFP融合基因的工程菌，绿色荧光强度高说明成功表达了融合蛋白，即成功导入了目的基因。 （5）①实验中设置GFP溶液组作为对照，因为SEIK-GFP融合蛋白中有GFP部分，设置GFP溶液组可以排除GFP本身对小鼠体内干扰素-γ（IFN-γ）含量的影响 ，即证明GFP对小鼠体内干扰素-γ的释放量无影响。 ②观察可知，注射SEIK-GFP溶液组与注射SEIK溶液组小鼠体内干扰素-γ（IFN-γ）含量变化基本一致 ，这表明SEIK-GFP融合蛋白能发挥与SEIK相同的作用，即SEIK-GFP 融合蛋白生物活性并未明显改变，可利用SEIK-CFP融合蛋白研究SEIK作用机制，且由于GFP具有荧光特性，能对SEIK的作用进行定位追踪。 10．重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到了LTB基因和STI基因片段，并用重叠延伸PCR技术构建了LTB—STI融合基因，其过程如图1所示。    (1)利用PCR技术扩增LTB基因和STI基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链﹐还需要加入 、 。PCR过程中，使DNA解旋的方法是 。 (2)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列 （填“能”或“不能”）互补；引物P2与引物P3的碱基序列 （填“能”或“不能”）部分互补。从引物P2和引物P3的角度分析，LTB基因的PCR过程与STI基因的PCR过程不能在同一个反应体系中同时进行，原因是 。 (3)DNA子链是从其5′端向3′端延伸的。为了使重叠链顺利延伸，LTB基因与STI基因的PCR过程至少需要进行 次循环才能得到目的链L、S。目的链L、S构成了杂交链。在杂交链延伸生成LTB-STI融合基因的过程中， （填“需要”或“不需要”）加入引物。在下图中的小方框内标出杂交链两条母链各自的3′端和5′端 。    (4)科研小组为了检测是否成功构建出LTB—STI融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如图2所示。则LTB—STI融合基因最可能是 （填“1”或“2”或“3”），判断依据是 。 (5)获得LTB—STI融合基因后，若要大量扩增该序列，可选择图中引物 继续进行PCR。 【答案】(1) 耐高温的TaqDNA聚合酶 4种脱氧核苷三磷酸（dNTP） 高温（或90—95℃）处理 (2) 不能 能 引物P2和引物P3之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程 (3) 2 不需要    (4) 3 LTB—STI融合基因包含2个不同的基因，其分子量较大，3表示的DNA分子量最大（或1和2与M中碱基对数为1000bp和2500bp的对照基因的电泳结果相同，3的碱基对数大约是1和2的碱基对数之和） (5)引物P1和引物P4 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】（1） PCR体系中需要加入的物质有引物﹑模板链、耐高温的DNA聚合酶和dNTP（作为原料）等；PCR是一项体外扩增DNA的技术，利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是DNA双链复制，该过程中DNA双链解开是通过高温（或90—95℃）处理实现的。 （2） LTB和ST1基因能够融合的关键是P2和P3两种引物的部分区域能发生碱基互补配对，碱基互补配对区域的碱基之间能够结合在一起，从而将两个基因融合在一起；由于P2和P3两种引物能结合，因此PCR1和PCR2不能在同一个体系中进行，因为引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程，据此可知，引物P1与引物P2的碱基序列“不能”互补，引物P2与引物P3的碱基序列“能”部分互补，否则无法实现两个基因的融合。 （3）DNA子链是从其5′端向3′端延伸的。为了使重叠链顺利延伸，LTB基因与STI基因的PCR过程至少需要进行2次循环才能得到目的链L、S，即经过两次循环即可获得所需要的目的链，且目标链L、S构成了杂交链。在杂交链延伸生成LTB-STI融合基因的过程中，不需要加入引物，子链的延伸方向为5’→3’，因此，图中的小方框内标出杂交链两条母链各自的3′端和5′端可表示如下：      （4）科研小组为了检测是否成功构建出LTB—STI融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如图2所示。则LTB—STI融合基因最可能是“3”，这是因为LTB—STI融合基因包含2个不同的基因，其分子量较大，3表示的DNA分子量最大，且3的碱基对数大约是1和2的碱基对数之和。 （5）获得LTB—STI融合基因后，若要大量扩增该序列，可选择图中引物引物P1和引物P4继续进行PCR，因为这两种引物可分别与融合基因两端的碱基序列发生碱基互补配对，进而可引导PCR扩增过程。 题型突破05 电泳鉴定 11．琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列说法错误的是（    ） A．配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离 B．PCR扩增时，引物特异性较弱会使电泳出现多条条带 C．配制琼脂糖溶液时加入的指示剂可用于监测电泳进程 D．向两个加样孔内加相同分子大小的DNA样品，得到的电泳条带位置可能不同 【答案】C 【详解】A、琼脂糖凝胶浓度较高时，凝胶孔径较小，大分子DNA片段迁移阻力大，难以分离，A正确； B、PCR引物特异性弱会导致非特异性扩增，产生不同长度的DNA片段，电泳时出现多条条带，B正确； C、配制琼脂糖溶液时加入的是核酸染料（如EB），用于染色DNA；而指示剂（如溴酚蓝）通常存在于上样缓冲液中，用于监测电泳进程，C错误； D、相同大小的DNA若构象不同（如线状、环状），迁移速率可能不同，导致条带位置差异，D正确。 故选C。 12．PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列相关叙述错误的是（    ） A．DNA迁移的方向主要取决于电场，而与缓冲液的酸碱度基本无关 B．待分离的DNA片段较小时，实验所用琼脂糖凝胶的浓度宜稍高些 C．DNA电泳鉴定时需预先将染料加入凝胶中以使待测DNA充分染色 D．对PCR产物电泳，结果符合预期的DNA片段通常还需进行基因测序 【答案】A 【详解】A、DNA 迁移方向主要取决于电场， 但缓冲液酸碱度会影响 DNA 所带电荷等，进而影响迁移，A错误； B、DNA 片段小，琼脂糖凝胶浓度高些（孔径小 ），便于分离，B正确； C、DNA 电泳染色，可将染料加入凝胶，使 DNA 充分染色，C正确； D、PCR 产物电泳符合预期后，测序可确定序列准确性，D正确。 故选A。 13．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（　　） A．DNA粗提取时，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 B．提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后即可变为蓝色 C．凝胶电泳时，DNA分子越大，迁移速率越快 D．电泳鉴定时，如果扩增结果不止一条条带可能是因为引物设计过短、退火温度过低等原因 【答案】D 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色；耐高温的DNA聚合酶在延伸环节时进行子链的合成。 【详解】A、离心研磨液的目的是通过离心力分离细胞碎片和杂质，使DNA保留在上清液中，而非直接加速DNA沉淀。DNA沉淀需后续加入预冷酒精完成，A错误； B、二苯胺试剂与DNA需在沸水浴条件下（约100℃）反应才会显蓝色，仅混匀无法直接显色，B错误； C、凝胶电泳中，DNA分子量越大，通过凝胶孔隙的阻力越大，迁移速率越慢，C错误； D、引物过短或退火温度过低会导致非特异性结合，扩增出非目标DNA片段，电泳时出现多条带，D正确。 故选D。 建议时间：30分钟 一、单选题 1．PCR可看作生物体外特殊的DNA复制过程。如图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链延伸的基础。下列叙述正确的是（　　） A．①为逆转录，核酸酶H可将杂交双链中的DNA水解，为PCR提供原料 B．PCR扩增时反应体系需加入模板、RNA引物、含Mg²⁺的缓冲液等成分 C．③为变性，使用90-95℃的高温处理是为断开引物与模板间形成的氢键 D．⑤为延伸，温度控制在70-75℃之间以提高相关酶活性，缩短延伸时间 【答案】D 【详解】A、①为逆转录，核酸酶H可将杂交双链中的RNA单链水解，留下DNA单链为模板合成双链DNA，A错误； B、PCR扩增时需在试管内加入模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶以及含Mg²⁺的缓冲液等成分，B错误； C、③过程为变性，变性过程使用90~95℃的高温处理是为了让双链DNA的氢键断裂，获得单链DNA，C错误； D、⑤为延伸，温度控制在70-75℃之间以提高相关酶活性，缩短延伸时间，D正确。 故选D。 2．引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是（　　） A．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 B．适当提高退火温度会增加PCR产生非特异性产物的可能性 C．想在目的基因两端增加限制酶切位点，相应碱基序列应加在引物的3端 D．经过30次PCR循环，消耗引物和原料，合成了230个目的基因 【答案】A 【详解】A、引物是短单链结构，能与DNA母链上一段碱基序列互补配对，为DNA聚合酶提供3'端，A正确； B、提高退火温度可增强引物与模板结合的特异性，减少非特异性产物，B错误； C、若需在目的基因两端添加限制酶切位点，应将该序列设计在引物的5'端（因DNA聚合酶从引物的3'端延伸），C错误； D、若只有一个模板DNA分子，PCR扩增30次循环后，目的基因数量为230个，且该过程消耗引物和原料（四种脱氧核苷酸），D错误。 故选A。 3．甲植物因细胞核中具有特异性DNA序列(a)而具有耐盐碱效应；乙植物因细胞质中具有特异性DNA序列(b)而具有高产效应。科研人员将甲、乙两种植物体细胞杂交，获得了耐盐碱、高产再生植株，并通过PCR技术来鉴定。已知M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。下列有关叙述错误的是（　　） A．植物体细胞杂交技术打破了生殖隔离，实现了远缘杂交育种 B．鉴定时，提取、纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板 C．总DNA加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；同理扩增序列b D．产物电泳后，若分别在凝胶中均出现预期的2个条带，可确定再生植株来自杂种细胞 【答案】D 【详解】A、植物体细胞杂交技术可以将不同种的植物细胞融合，打破了生殖隔离，实现了远缘杂交育种，A正确； B、PCR需以总DNA为模板，总DNA包含核DNA和细胞质DNA，B正确； C、序列a（核DNA）和b（质DNA）需分别用M1/M2和N1/N2引物扩增，需分两次PCR反应，C正确； D、每个PCR反应仅扩增一个目标序列，应各出现1个条带，而非2个条带，若两次PCR均成功，总条带数为2，D错误。 故选D。 4．关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验I）和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验II）的实验，下列相关叙述正确的是（    ） A．粗提取的DNA产物以及PCR产物均可通过电泳检测 B．实验Ⅰ鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 C．实验Ⅰ中，将白色丝状物加入二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA D．实验Ⅱ中，先在加样口加入PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液，再将电泳缓冲液加入电泳槽并没过凝胶1mm后，电泳、观察 【答案】A 【详解】A、电泳法可用于检测DNA的存在及片段大小。实验Ⅰ中粗提取的DNA可能含有杂质，但电泳仍可显示DNA条带；实验Ⅱ的PCR产物为特定DNA片段，需通过电泳分离并鉴定，A正确； B、实验Ⅰ的DNA鉴定使用二苯胺试剂，需在沸水浴条件下显色。高温会导致DNA双螺旋结构解旋（变性），B错误； C、实验Ⅰ的正确操作是将二苯胺试剂加入DNA溶液中，再沸水浴显色，C错误； D、实验Ⅱ中，电泳前需先在电泳槽中加入缓冲液并没过凝胶，随后在加样孔中注入PCR产物与载样缓冲液的混合液，D错误。 故选A。 5．实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术，可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA，然后进行PCR，反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。 下列推测不合理的是（    ） A．探针与cDNA单链的结合具有特异性 B．淬灭基团与荧光基团间距离影响荧光强度 C．CT值越小则提取到的病毒RNA含量越低 D．病毒发生单个碱基的突变可能不影响检测结果 【答案】C 【详解】A、探针中携带荧光基因，因而探针与CDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则具有特异性，A正确 B、根据题意，通过病毒的RNA进行逆转录产生CDNA，CDNA在PCR过程中解旋后可以和引物一起 与模板结合，探针两侧有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，延申过程DNA酶破坏了探针使淬灭基团分离后发出荧光而检测到是否有CDNA来判断是否有病毒，因此淬灭基团与荧光基团间距离会影响荧光强度，B正确； C、由题可知C值越小，该反应管内的荧光信号到达设定阈值经历的循环数越小，即每次循环出现的荧光信号越多。每次循环出现的荧光信号越多，代表被检测样本中的病毒数目越多，C错误； D、若病毒发生单个碱基的突变，可能不会影响检测结果，因为单个碱基没有发生配对不会影响PCR 进程，D正确。 故选C。 6．下列无法通过PCR实现的是（　　） A．以环状DNA为模板直接扩增出大量环状DNA B．从一个双链DNA分子中扩增出某个特定片段 C．在人胰岛素基因上游加上大肠杆菌RNA聚合酶的识别序列 D．将基因上决定异亮氨酸的核苷酸序列替换为决定半胱氨酸的核苷酸序列 【答案】A 【详解】A、PCR扩增需要引物结合到单链DNA的3'端，而环状DNA为闭合双链结构，无法直接提供游离的3'端供引物结合，因此无法直接扩增出环状DNA。扩增产物通常为线性DNA，A错误； B、PCR可通过设计特异性引物扩增双链DNA中的特定片段，B正确； C、在引物5'端添加大肠杆菌RNA聚合酶识别序列（如启动子），通过PCR可将该序列整合到扩增产物中，C正确； D、通过定点诱变技术，设计含突变位点的引物，PCR可改变基因的核苷酸序列，可以将基因上决定异亮氨酸的核苷酸序列替换为决定半胱氨酸的核苷酸序列，D正确。 故选A。 7．科研人员欲将某目的基因导入大肠杆菌质粒中保存，该质粒上有EcoRI、XhoI、MunI、SalI和NheI限制酶识别序列，质粒和目的基因的结构图示如下。下列相关叙述错误的是（　　） A．构建的重组质粒中PO位于目的基因的上游，转录方向为顺时针 B．在设计PCR引物时，应在两种引物上添加XhoI和MunI限制酶识别序列 C．在添加氨苄青霉素和X-gaI的培养基上，导入重组质粒的大肠杆菌形成白色菌落 D．图中质粒还应有终止密码子序列，使目的基因翻译终止 【答案】D 【详解】A、PO启动子位于目的基因的上游，为保留启动子基因序列，不能选用EcoRI，故转录的方向为顺时针，A正确； B、限制酶SalI和NheI会破坏目的基因结构的完整性，EcoRI会破坏标记基因，只能选择限制酶XhoI和MunI，但目的基因没有这两种酶的识别序列，则在设计PCR引物时，应在引物上添加限制酶XhoI和MunI的识别序列，B正确； C、目的基因的插入位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解。所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了氨苄青霉素的培养基上生长。又因为目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，底物X-gal不会被分解，故在添加了氨苄青霉素和X-gaI的培养基上生长的白色菌落为导入重组质粒的大肠杆菌，C正确； D、图中质粒还应具有终止子序列，终止转录过程，终止密码子位于mRNA上，D错误。 故选D。 8．通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点。有关叙述正确的是（　　） A．两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入 B．在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等 C．第2轮PCR,引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因 D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8 【答案】A 【详解】A、引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入运载体，避免发生自身环化，A正确； B、在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、Taq酶等，但不需要加入解旋酶和核糖核苷酸，B错误； C、在第3轮PCR中，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因，C错误； D、在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，D错误。 故选A。 9．乙肝疫苗是通过基因工程将乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的基因导入酵母菌中表达，再利用发酵工程大规模生产获得的。已知HBsAg不能被酵母菌分泌到细胞外。下列相关叙述错误的是（　　） A．为了提高转基因的成功率，可以通过PCR技术扩增基因 B．可以利用抗HBsAg抗体在分子水平上检测基因的表达产物 C．可利用酵母菌大量生产乙肝疫苗，在发酵之前需要对菌种进行扩大培养 D．发酵结束后从培养液中提取HBsAg，并对提取的HBsAg进行纯化、灭活 【答案】D 【详解】A、PCR技术可在体外大量扩增目的基因（HBsAg基因），从而增加导入的成功率，A正确； B、HBsAg基因的表达产物是蛋白质，利用抗原-抗体特异性结合的原理，可用抗HBsAg抗体进行检测，B正确； C、发酵工程中需先对菌种进行扩大培养以增加菌体数量，再转入发酵罐进行大规模生产，C正确； D、题干明确HBsAg不能被酵母菌分泌到细胞外，说明其存在于细胞内，需通过破碎细胞提取，而非直接从培养液中获取，D错误。 故选D。 10．反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如图所示。下列说法正确的是（    ） A．应选择引物2和引物3进行PCR扩增 B．复性的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关 C．PCR产物不含EcoRI的酶切位点 D．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 【答案】B 【详解】A、DNA子链合成的方向为5'端到3'端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A错误； B、GC碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，复性的温度也越高；DNA 聚合酶的延伸速度相对固定，扩增片段越长，所需延伸时间越长，B正确； C、对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，PCR产物包含位置序列末端的EcoRI的酶切位点，C错误； D、PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，D错误。 故选B。 二、多选题 11．实时荧光定量 PCR 简称 qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的 Taqman 探针与待测样本 DNA 混合，当探针完整时，不产生荧光。在 PCR 过程中， 与目的基因结合的探针被 TaqDNA 聚合酶水解，R 与 Q 分离后，R 发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光（如图所示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得 Ct 值（该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述错误的是（    ） A．每个模板 DNA 分子含有 4 个游离的磷酸基团 B．在反应过程中，需要 ATP 为新链的合成提供能量 C．做 qPCR 之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和 Taqman 探针 D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小 【答案】ABD 【详解】A、DNA分子为两条反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A错误； B、在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，无需ATP，B错误； C、做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，C正确； D、若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。 故选ABD。 12．不对称PCR是一种大量制备单链DNA的手段，PCR的两种引物添加的量不同，一种引物添加较多，称非限制性引物，另一种引物添加较少，称限制性引物，在PCR的前10个循环中，两条链的扩增均正常进行，第11～30个循环中，限制性引物耗尽，仅通过非限制性引物扩增其中一条链，下列相关叙述正确的有（    ） 单链DNA 5'-AACCGCTCATCTAAG……CCTAGCTAGTCAACC-3' 引物1 5'-AACCGCTCATCTAAG-3' 引物2 5'-GGTTGACTAGCTAGG-3' A．若要大量制备表格中的单链DNA，引物2是限制性引物，引物1是非限制性引物 B．在PCR的第11～30个循环，延伸时间应当明显短于前10个循环 C．若PCR开始之前有a个模板DNA分子，限制性引物至少需要（210-1）a个分子 D．若PCR开始之前有a个模板DNA分子，非限制性引物至少需要（20×210-1）a个分子 【答案】AC 【详解】A、要制备表格中的单链DNA，引物2为限制性引物，引物1为非限制性引物，应为它可以与表格中的单链DNA的互补链结合，从而扩增单链DNA，A正确； B、扩增形成的产物是一样的，所以延伸时间不变，B错误； C、模板链不需要引物，所以限制性引物至少需（210-1）a个，C正确； D、前10次循环的产物为双链DNA，DNA进行半保留复制，10次循环结束后产生a·210个双链DNA分子，最初需要添加非限制性引物（引物C）的数量为（210-1）a，后20次循环以前10次循环的DNA产物的一条链为模板（前10次扩增后该链共有n·210），所以此过程需要非限制性引物（引物C）个数为n·210·20个，因此此过程需要非限制性引物个数为（210-1）a+a·210·20=（210×21－1）a，D错误。 故选AC。 三、解答题 13．同源重组技术结合tet-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。如图是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tet'是四环素抗性基因，sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。回答下列问题。    (1)过程①PCR除需要加入耐高温的DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、Mg2+、引物外，还需加入 ，其中引物的作用是 。 (2)为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P1、P2时，需分别在引物5'端添加限制酶 的识别序列；若sacB基因扩增5代，则需要引物P1 个。 (3)过程③中，需先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种 的生理状态。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加 。 (4)如图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，根据已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度可推测PCR产物的长度，因此可判断泳道 对应的菌株可能转化成功。过程⑤PCR中设计引物P3、P4时，需在引物5'端分别添加 基因两端的同源序列。    (5)过程⑦中，在含有四环素和X-gal的培养基中出现了 色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tet'-sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加 。 【答案】(1) 模板DNA（或质粒1） 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) BamHI、EcoRI 31 (3) 能吸收周围环境中DNA分子 四环素 (4) 4、5、7 LacZ (5) 白 蔗糖和X-gal 【分析】PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 （4）条件：Mg2+、模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）过程①PCR除需要加入耐高温的DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、Mg2+、引物外，还需加入模板DNA，其中引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （2）HindⅢ会破坏tetr基因，XmaⅠ会破坏复制原点，为保证sacB基因和质粒2定向连接，应用限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ切割目的基因和质粒，引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，因此设计引物P1、P2时，需在引物5'端添加限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，若sacB基因扩增5代，则需要引物P1的个数为：25-1=31。 （3）过程③为将目的基因导入受体细胞，导入目的基因时，首先用Ca2+处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。重组质粒的标记基因为tetr（四环素抗性基因），筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加四环素。 （4）sacB基因是目的基因，sacB基因中含有2071bp，4、5、7的电泳结果接近（或大于）2071bp，说明4、5、7对应的菌株中含有目的基因，说明泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功。引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，目的基因（tetr-sacB）两端均为LacZ基因，因此需在引物5′端分别添加LacZ基因两端的同源序列。 （5）LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物，过程⑦为筛选LacZ基因敲除菌株，因此，若LacZ基因被敲除，则在含有四环素和X-gal培养基中出现白色菌落。sacB基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物，则添加X-gal起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X-gal可筛选LacZ基因回补菌株。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $