3.2基因工程的基本操作程序课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 转基因抗虫棉 非转基因抗虫棉 第2节 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程 2.基因表达载体的构建 1.目的基因的筛选与获取 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 Bt基因 Ti质粒 重组DNA分子 将目的基因插入染色体DNA中 一、基因工程的基本操作程序 4 阅读教材P76-80，目的基因的筛选与获取，思考以下问题： 1、什么是目的基因？培育转基因抗虫棉时用到的目的基因是什么？ 2、如何筛选合适的目的基因？ 3、通过哪些方法可以获取目的基因？ 4、PCR（聚合酶链式反应）技术的①原理；②操作环境；③目的；④ 优点；⑤具体过程；⑥反应条件各是什么？ 5、用PCR进行目的基因的扩增时，为什么需要引物？什么是引物？ 6、用PCR可以扩增mRNA吗？ PCR反应时需要能量吗？ 一、目的基因的筛选与获取 已知结构 功能清晰 2、获取目的基因的方法 ①从基因组文库、cDNA文库中获取； ②人工合成；③利用mRNA逆转录形成； ④利用PCR技术扩增。 目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。 从相关的______ __和____ _____的基因中进行筛选。 1、筛选目的基因 资料：在培育转基因抗虫棉之前，利用苏云金杆菌制成的杀虫剂已经广泛用于棉害防治，这与苏云金杆菌体内的Bt基因有关，科学家不仅掌握了Bt基因的序列，而且也对其表达产物Bt抗虫蛋白有了深入了解，因此，Bt基因是转基因抗虫棉合适的目的基因。 根据不同的需求，目的基因不同，它可以是。。。。与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因 6 逆转录酶 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（在体外用高温代替） 打开DNA双链 DNA母链（DNA模板） 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶（体外用耐高温的DNA聚合酶） 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3`端开始连接脱氧核苷酸 DNA复制所需的基本条件: 引物是一小段能与________的一段碱基序列________的____________ DNA母链 互补配对 短单链核酸 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 ⑤缓冲溶液、控制温度 ① ② ③ ④ PCR:根据DNA半保留复制的原理，在体外对DNA片段进行大量扩增的技术 9 ②复性 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 当温度下降到50℃左右（55℃ ）时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ③延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 PCR反应过程 当温度上升到90℃以上（94 ℃）时，双链DNA解聚为单链 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 引物 DNA模板 耐高温的DNA聚合酶 4种脱氧核苷酸 条件 缓冲溶液 控制温度 ①变性 10 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物； 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； 第二轮循环的产物 第三轮的产物 完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 目的基因 条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物 和TaqDNA聚合酶(在缓冲溶液中，控制温度等) 过程：变性→复性→延伸... PCR反应过程演示 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 目的基因DNA受热变性后解为单链，___ _与单链相应互补序列结合；然后以______ _为模板在_________ _作用下进行延伸，即将4种_________ _加到_________ _，如此重复循环多次。 PCR过程归纳： 引物 单链DNA TaqDNA聚合酶 引物的3’端 脱氧核苷酸 由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，即成_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 产物 模板 一倍 指数 每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。 变性 复性 延伸 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目DNA片段进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的DNA片段 ①全称： ②原理： ③操作环境： ④目的： ⑤优点： 用PCR可以直接扩增mRNA吗？反应时需要能量吗？ 不可以，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 PCR技术扩增的是处于两个引物之间的DNA片段。 PCR技术扩增的是整个DNA分子吗？ 第1步：逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA 杂交分子； 第2步：逆转录酶（具有核酸酶H活性）降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使 之变成单链DNA； 第3步：以单链DNA为模板，在逆转录酶(具有DNA聚合酶活性）的作用下合成 另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA 15 例1．下列有关PCR技术的叙述正确的是 (　　) A．每一次扩增必须不断添加DNA序列作为模板 B．反应需要的DNA连接酶必须不断地加进反应当中 C．反应需要的DNA聚合酶必须不断地加进反应当中 D．作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断地加进每一次的扩 增当中 D 【解析】作为模板的DNA序列只要添加一次，起模板作用，A错误；PCR扩增反应过程中不需要DNA连接酶，B错误；反应需要的DNA聚合酶可以反复使用，不需要不断地加进反应当中，C错误；模板链只要加入一次，引物片段必须不断加入，D正确。 【解析】甲方法是某细菌的DNA扩增并用限制酶切割，得到该细菌的多个DNA片段，可以根据目的基因的结构和功能进行筛选，A正确、C错误；乙方法中c为转录，d为逆转录，需要逆转录酶的参与，B、D正确。 16 例2、近十年来，PCR技术成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。 （1）加热使DNA双链打开，这一步是打开_____键，称为_____。 （2）当温度降低时，引物与模板____端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是_______________，遵循的是_______。 变性 3′ 4种脱氧核苷酸 氢 碱基互补配对原则 17 例2、近十年来，PCR技术成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。 （3）PCR技术的必要条件，除了模板、原料、酶、引物、ATP以外，至少还需要三个条件，即：液体环境、适宜的______和________，前者由PCR仪自动调控，后者则靠__________来维持。 （4）DNA的复制需要引物，其主要原因是( 　　) A．可加快DNA复制速度 B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合 C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链 D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链 酸碱度 缓冲溶液 D 温度 二、基因表达载体的构建 （基因工程的核心） 二、基因表达载体的构建（基因工程核心步骤） 阅读教材P80，基因表达载体的构建，思考以下问题： 1、基因表达载体由哪些部分构成？ 2、什么是启动子、终止子？位于哪里？功能？ 3、标记基因具有什么作用？常见类型有哪些？ 4、切割载体和切割含有目的基因的DNA片段为什么要用同种限制酶 或能产生相同末端的限制酶？ 5、用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶 处理后，一定会形成符合要求的重组DNA分子吗？ 启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”有何区别？ （1）启动子：①本质：一段特殊序列的DNA片段 ②位置：位于基因的上游，紧挨转录的起点 ③功能：RNA聚合酶识别、结合的部位，驱动基因转录出mRNA （2）终止子：①本质：一段特殊序列的DNA片段 ②位置：位于基因的下游 ③功能：终止转录 （3）标记基因：①作用：便于重组DNA分子的筛选 ②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 20 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 位置 化学本质 作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录 终止基因 的转录　 蛋白质合成开始的信号　 终止蛋白质合成(终点)　　　 启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”有何区别？ 基因的上游 基因的下游 mRNA上 mRNA上 DNA序列 DNA序列 RNA序列 RNA序列 21 重组DNA分子 限制酶 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 连接酶 基因表达载体构建模式图 限制酶 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 质粒 产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接； 1、切割载体和切割含有目的基因的DNA片段为什么要用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？ 22 思考： 1、为什么不直接将目的基因导入受体细胞，而需要构建基因表达载体？ 游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解；游离的DNA片段无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞不含目的基因。 2、结合甲、乙两图分析，为了使目的基因与载体连接，应用哪种限制酶进行切割，为什么？能用限制酶SmaⅠ吗？ PstⅠ 不能 产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接； 用限制酶PstⅠ，因为目的基因和载体上都有限制酶PstⅠ的识别位点，可以产生相同的黏性末端，便于连接；不能用限制酶SmaⅠ切割目的基因和载体，因为用限制酶SmaⅠ切割目的基因，会破坏目的基因的结构，用限制酶SmaⅠ切割载体，会破坏标记基因，难以进行筛选。 23 3、获得目的基因后，用DNA连接酶构建基因表达载体时，会出现几种结果？为了防止目的基因与载体反向连接，结合上图分析，可以怎么解决？ 同时使用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ对目的基因和载体进行切割 ①目的基因与载体正常结合； ②目的基因与目的基因结合； ③载体与载体结合； ④目的基因与载体反向结合； ⑤自身环化（目的基因、载体）。 例1、下图为某种质粒表达载体的简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。 （1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有______________________、__________________、_________________________三种 （2）若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行__________ 用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是___； 若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是___。 目的基因—载体连接物 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物 分离纯化 目的基因—载体连接物、载体-载体连接物 载体—载体连接物 25 （3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是________，其合成的产物是____________。 （4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_________________。 启动子 mRNA EcoRⅠ和BamHⅠ 例1、下图为某种质粒表达载体的简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。 例2、某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶。进行连续反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因，含有质粒载体，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。请思考回答下列问题： (1)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞无法被区分，其原因是什么？ 含有载体和重组质粒的细胞也无法被区分，其原因是什么？ (2)在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有什么抗生素的固体培养基？ 二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长； 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 含四环素的培养基。 27 常用方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法（体/受精卵） 花粉管通道法（受精卵） ——显微注射法（受精卵） ——感受态细胞法 Ca2+处理法 三、将目的基因导入受体细胞 （1）花粉管通道法： 可用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液（基因表达载体）直接注子房中。 （2）农杆菌转化法 冠瘿瘤 农杆菌是一种在土壤中生存的微生物，能在自然条件下侵染双子叶和裸子植物。 当农杆菌侵染植物时，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 根据这一特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 农杆菌Ti质粒 菌体没有进入受体细胞 30 构建表 达载体 含目的基因的重组Ti质粒 表现出新性状的植株 导入植物 细胞 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 目的基因 Ti质粒 T-DNA 含重组Ti质粒的农杆菌 转入农杆菌 农杆菌转化法 农杆菌转化法示意图 31 对点练习1 、下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，以下相关叙述，正确的是 (　　) A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就一定表现出抗虫性状 D．⑤若表现出抗虫性，则该植株发生的变异是可遗传的 D 【解析】②重组质粒的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，A错误；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到④的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上含抗虫基因，说明目的基因已经成功导入，但这不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异，D正确。 32 对点练习2、科学家通过基因工程的方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示，请分析回答： （1）Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用T-DNA________ 的特点。 可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上 （2）Bt 毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为_________。 （3）将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是___________。 转化 农杆菌转化法 33 方法： 方法： 方法： 抗原-抗体杂交技术（是否显示出杂交带） PCR技术（是否扩增出目的基因）、DNA分子杂交 四、目的基因的检测与鉴定的方法 阅读教材P82，目的基因的检测与鉴定，思考以下问题： 1、目的基因的检测与鉴定包括那两种水平？ 2、分子水平的检测方法用到了什么技术？ PCR技术（是否扩增出目的基因）、分子杂交 34 PCR技术 基本原理：根据目的基因特点设计特定引物，看是否扩增出目的基因。 检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 【拓展延伸】实时定量PCR 实时定量PCR (real－time quantitative PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 实时定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 35 DNA分子杂交技术 检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因 基因探针： 放射性同位素等标记的DNA分子 36 分子杂交技术 检测目的基因是否转录出了mRNA 变性 探针 15N 15N 转基因生物 的mRNA 14N 杂交带 例、利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法不正确的是( ) A. cDNA文库的构建需要用到逆转录酶 B. 图中的菌落是通过稀释涂布平板法获得的 C. 核酸分子杂交的原理是碱基互补配对 D. 从该文库中可以筛选到胰高血糖素基因 D 个体水平的鉴定具体方法举例 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 害虫死亡 未染病 正常生长 正常生长 饲喂害虫（抗虫接种实验） 病毒（菌）接种实验 盐水浇灌 喷洒除草剂 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简单的方法是什么？ 用叶片直接饲喂棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。 目的基因的检测与鉴定的方法 类型 检测内容 方法 结果显示 分子水平 的检测　 目的基因是否插入受体细胞DNA上 目的基因是否转录出mRNA 目的基因是否翻译成蛋白质 　 个体生物学水平的检测　　 是否具有抗性及抗性程度 接种实验 是否赋予了预期抗性　 抗原－抗体杂交 PCR技术等 PCR技术等 是否扩增出目的基因　 是否显示出杂交带　 对转基因生物进行抗性 40 例1、下列有关基因工程中目的基因的检测与鉴定的说法错误的是( ) A. 检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因可用DNA分子杂交的方法 B. 检测目的基因是否转录可用分子杂交的方法 C. 检测目的基因是否表达用抗原-抗体杂交的方法 D. 目的基因的检测与鉴定是基因工程的核心步骤 D 例2、 下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答： （1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用_______限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含____________的培养基上进行。 （2）能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是________。 A．启动子 B．tetR C．复制原点 D．ampR HindⅢ 和 BamHⅠ 氨苄青霉素 A （3）过程①可采用的操作方法是________(填字母)。 A．农杆菌转化 B．大肠杆菌转化 C．显微注射 D．细胞融合 C 小结 1．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作不正确的是 (　) A．用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒 B．重组质粒的构建依赖于碱基互补配对 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．C基因导入受体细胞后，不一定能够成功表达，需要进行进一步检测与鉴定 C 练习 【解析】分析图示可知：用限制性内切核酸酶EcoRⅠ切割目的基因(花色基因C)和质粒，可使目的基因和质粒产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶将切口连起来从而构建重组质粒，A正确；重组质粒构建时，目的基因的黏性末端和质粒的黏性末端之间的碱基通过碱基互补配对形成氢键，B正确；从图中可以看出，该质粒中只有潮霉素抗性基因，被转化的菊花细胞只对潮霉素有抗性，因此在培养基中添加卡那霉素，不能筛选被转化的菊花细胞，C错误；C基因导入受体细胞后，不一定能够成功表达，需要进行进一步检测与鉴定，D正确。 44 2（江苏卷）27、下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题： （1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有_____个游离的磷酸基团 （2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越 ____ （3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SrnaⅠ切割，原因是___。 （4）与只使用EcoR I相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外 源DNA的优点在于可以防止______________________________。 0、2 高 SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、破坏外源DNA中的目的基因 质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 47 （5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 ___________酶。 （6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了___________________。 （7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧 失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在_________________的培 养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。 DNA连接 鉴别和筛选含有目的基因的细胞 以蔗糖为唯一含碳营养物质 谢谢 （1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 三种。 若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。 2、图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。 “汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。 目的基因-载体连接物 载体-载体连接物 目的基因-目的基因连接物 分离纯化 （2）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是 。 （3）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是 。 启动子 mRNA EcoRⅠ和BamHⅠ “五看法”评价实验设计小结 第3章　基因工程 生物学　选择性必修3　配人教版 课前·新知导学 课堂·素养初培 课堂·延伸提分 小练·素养达成 课后提能集训 DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理； DNA半保留复制 2.DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____； 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过_______________来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关 ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 二、材料用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑧PCR反应体系的配方 ⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 三、方法步骤 DNA片段的扩增 1、移液： 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 2、离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 3、反应： 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 预变性： DNA片段的电泳鉴定 1、配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 2、制备凝胶 ①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 ②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 3、加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 4、电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 5、观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 注意 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 四、结果分析与评价 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 1.下列属于PCR技术所需条件的是（ ） ①单链的核苷酸序列引物　②目的基因所在的DNA片段 ③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　⑥DNA聚合酶　⑦限制酶 A.①②③⑤ B.①②③⑥ C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦ 2.质粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是( ) A.使目的基因在受体细胞内易于表达 B.使受体细胞具有抗药性 C.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测 D.促进目的基因与导入的外源基因相连接，提高转基因操作的成功率 B 2026/2/25 课堂练习 C 3.科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是( ) ①该技术将导致定向变异；②DNA连接酶能把目的基因与载体黏性末端的碱基对连接起来；③将目的基因导入受体细胞时采用显微注射技术； ④受精卵是理想的受体。 A.①②④ B.①③④ C.②③④ D.①②③④ 4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（ ）①将毒素蛋白注射到棉受精卵中；②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养；④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。 A.①② B.③④ C.②③ D.①④ B 2026/2/25 课堂练习 B 5.利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法不正确的是( ) A.cDNA文库的构建需要用到逆转录酶 B.图中的菌落是通过稀释涂布平板法获得的 C.核酸分子杂交的原理是碱基互补配对 D.从该文库中可以筛选到胰高血糖素基因 6.下列有关基因工程中目的基因的检测与鉴定的说法错误的是( ) A.通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因 B.通过PCR等技术检测目的基因是否转录 C.检测目的基因是否表达用抗原——抗体杂交的方法 D.目的基因的检测与鉴定是基因工程的核心步骤 D 2026/2/25 课堂练习 D 【检测】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有(　　) A. 8个 B. 6个 C. 4个 D. 2个 A 1.基因工程的操作步骤？核心？ 2.目的基因？筛选目的基因有效的方法之一？ 3.获取目的基因的方法？常用的方法？ 4.PCR的全称？概念？原理？条件？过程（具体）？引物的作用 5.基因表达载体构建的目的？过程？ 6.基因表达载体的组成包括？ 启动子的本质、位置、功能？终止子的本质、位置、功能？ 7.转化的概念？目的基因导入动物 细胞，方法是？ 目的基因导入微生物细胞时，如何处理细胞？目的？ 目的基因导入植物细胞常用的方法？ 8.农杆菌转化法的原理？目的基因的插入位置？农杆菌转化法的过程？ 9.目的基因检测与鉴定：哪两个水平？分子水平要检测什么，各用方法？ 基础知识提问 谢谢 目的基因导入受体细胞 一、转化 指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 二、转化的受体细胞 将目的基因导入植物细胞； 将目的基因导入动物细胞； 将目的基因导入微生物细胞。 转化：联系必修二肺炎双球菌中格里菲斯的转化实验，提到的“转化因子” 温故知新提问 1.基因工程的原理？操作水平？优点？ 2.重组DNA技术的基本工具？工具酶？ 3.限制酶的来源？本质？ 作用？作用的化学键？结果？ 4.DNA连接酶的本质？作用？作用的化学键？种类？ 各种类的不同（来源，作用）？ 5.一个基因从DNA分子上切下来，需要切 处，产生 个黏性末端， 断 个磷酸二酯键，需要 个水。 6.载体的本质？种类？作为载体需要的条件？ 7.什么是质粒？ 重组载体的构建过程示意图分析 将某外源基因与质粒结合形成重组质粒的过程可以用下图来表示（注：BamHI 是一种限制酶）。请仔细看图后分析讨论下列问题： 1.质粒有哪些特点适合作为基因工程中的载体？ 2.图中切割目的基因和质粒时，用的是同一种限制酶，这样做的目的是什么？ 3.上图中重组质粒构建过程中，除了需要BamH I酶外，还需要什么酶？ 4.为什么目的基因和载体能够组合成一个DNA分子？ 1）必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去； 2）必需具备自我复制的能力，随染色体DNA的复制而同步复制； 3）必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选； 4）必需对受体细胞无害； 70 二、基因表达载体的构建（核心步骤） 1.基因表达载体的构成 一段特殊序列的____片段 ①本质： ②位置： 位于基因的____，紧挨__________ ③功能： 的部位，驱动 基因转录出mRNA （1）启动子： DNA 上游 转录的起始位点 RNA聚合酶识别、结合 当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达 诱导型启动子： 71 转录 位于基因的_____ 一段有特殊序列结构的____片段 ①本质： ②位置： ③功能： （2）终止子： 下游 便于重组DNA分子的筛选 （3）标记基因： ①作用： ②常见类型： 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 DNA 终止 启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”有何区别？ PCR技术 基本原理：根据目的基因特点设计特定引物，看是否扩增出目的基因。 $