专题12 基因工程（2大考点）（四川专用）2026年高考生物一模分类汇编

专题12基因工程 两大考点概览 考点01 基因工程 考点02 蛋白质工程 基因工程 考点1 1． （2026四川凉山.一模）为在大肠杆菌中表达人的胰岛素基因，将胰岛素基因（目的基因）插入质粒，构建重组质粒，并导入大肠杆菌。为鉴定大肠杆菌中是否含有正确插入胰岛素基因的重组质粒，设计引物进行PCR扩增（引物1~4结合位置如图所示，表示引物方向），所用模板、引物和结果下表。下列分析错误的是 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 模板 引物对 引物1、2 引物3、4 引物2、3 引物1、4 扩增产物 无 有 有 有 无 无 无 有 A. 图中的酶处理与PCR中的酶不同，但形成的化学键相同 B. 在PCR反应过程中，两条单链DNA与引物在复性阶段结合 C. ①与⑥离心管都没有扩增产物，但形成的原因可能不相同 D. ②④⑧离心管中的都是胰岛素基因正向插入的重组质粒 2． （2026四川广安.一模） 为获得高产脂质的硅藻用于生产生物柴油，研究人员将苹果酸酶（ME）基因（长度约800 bp）构建到含新霉素抗性基因的超表达载体上，导入硅藻细胞。为验证转化是否成功，以野生型基因组、转化后硅藻基因组以及重组质粒为模板，使用可特异性扩增完整ME基因的引物进行PCR，对产物进行琼脂糖凝胶电泳，并测定条带亮度（相对值），结果如图所示，下列分析正确的是 A. PCR过程中，引物作用是使Taq DNA聚合酶从其3'端开始连接核糖核苷酸 B. 为确保ME基因正确插入载体，需在引物3'端加入不同的限制酶识别序列 C. 转化后硅藻基因组检测到明显条带，说明ME基因已整合到其染色体DNA上 D. 为评价所获硅藻品系的生产潜力，还需检测其生长速率与胞内脂质含量 3． （2026四川内江.一模）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展栽培马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。结合下图分析，下列叙述错误的是 A. PCR扩增S基因时，需要模板、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等 B. 为保证S基因正确插入载体中，需对其上游引物的5′端添加碱基序列5′-GAATTC-3′ C. 用含重组Ti质粒的农杆菌侵染栽培马铃薯后，利用抗性基因2筛选成功转化的细胞 D. 将已转化的马铃薯与普通栽培马铃薯种植在寒冷条件下可检验S基因是否发挥作用 4． （2026四川广安.一模） 为培育富含花青素的紫色番茄，科研人员拟将金鱼草中调控花青素合成的关键转录因子基因（Del）转入番茄。选用的植物表达载体及Del基因的结构如下，请回答下列问题： （1）科研人员决定用BamHⅠ和HindⅢ对Del基因和载体进行双酶切后连接，PCR扩增Del基因时，需在目的基因两端添加这两种限制酶的识别序列的原因是______（答出两点即可）。已知Del基因转录时的模板链序列为：5-TTGGCA……AGCCAT-3。为准确连接，在扩增时，在目的基因上游引物为：5-______ATGGCT-3。（请填写6个碱基序列） （2）将重组质粒导入农杆菌，为初步筛选含有质粒的菌落，应在培养基中添加______。农杆菌导入番茄细胞，最终整合到番茄染色体DNA上的是载体的______区域。 （3）科研人员使用现有载体，会使Del基因在全植株表达造成物质和能量浪费，若要使Del基因仅在番茄果实中表达，需对载体进行的改造是______。 5． （2026四川绵阳B区.一模）棉花叶柄脱落细胞中RLF1基因编码细胞分裂素氧化酶，该酶可通过降解细胞分裂素加速叶片脱落。为了培育经脱叶剂处理可快速脱叶的棉花品种，以适宜机械化采收，科研人员设计了育种思路：先筛选脱叶剂诱导、叶柄脱落区特异表达的proPER21启动子，再构建proPER21：RLF1转基因株系，进行大田试验选育。回答下列问题。 I、筛选诱导型组织特异性启动子。 II、用选定启动子与RLF1基因构建proPER21：RLF1转基因株系，并进行田间试验。 （1）扩增目标序列，构建表达载体：通过生物信息学分析，在若干备选启动子中选定proPER21启动子（如图1）、Ti质粒pGreen II-0800-Luc（如图2）进行试验。 注：FLuc基因表达萤火虫荧光素酶，RLuc基因表达海肾荧光素酶，两种酶可以催化不同底物发出不同颜色的荧光。 ①用PCR技术对目标序列进行扩增时，需要模板、引物、原料和________（填酶名称）等条件，其中引物与模板结合发生在________阶段，酶的作用发生在________阶段。 ②为了替换常规启动子并将拟选启动子正确插入载体质粒的主报告基因上游，需在拟选启动子的上、下游引物的5'端分别加入碱基序列________、________。 （2）转染细胞，培养，检测。实验处理如下表，实验结果符合预期。 受体细胞 空Ti质粒 重组Ti质粒 脱叶剂 培养与检测 叶柄细胞 + - + 培养48小时后，鉴定相对荧光强度。+：表示有转入或加入；-：表示无转入或不加入。 - - + + - 棉铃细胞 与叶柄细胞处理相同 ①将Ti空质粒和重组Ti质粒通过________（方法）分别转入棉花叶柄细胞和棉铃细胞，并将________整合到该细胞的染色体上。 ②实验中用棉铃细胞作受体细胞，目的是验证_______。 （3）构建proPER21：RLF1转基因株系时________（“需要”或“不需要”）敲除细胞中原有RLF1基因，说明理由________。 （4）田间试验显示，该株系在70%脱叶剂用量下，脱叶效率更优于100%脱叶剂处理下的野生型，且棉铃数量与对照无显著差异。其积极意义是__________（答出2点即可）。 6． （2026四川自贡.一模）曲酸是米曲霉的次生代谢产物，为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组技术将曲酸合成有关的kojR基因导入米曲霉g-1（pyrG基因缺陷）菌株中，获得高产的g-58菌株，部分过程如图甲所示，其中kanr（卡那霉素抗性基因）、pyrG（合成尿嘧啶关键基因）均为标记基因。请回答： （1）现欲通过PCR技术构建kojR-pyrG融合基因，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是________。采用SacI和SalI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生________条电泳条带。 （2）将重组质粒导入农杆菌后仍需用PCR验证融合基因的有无，应选择图甲中的引物组合是________；现有以下培养基成分。①碳源②氮源③无机盐④水⑤卡那霉素⑥尿嘧啶，筛选g-58菌株的培养基需要添加________（填序号）。 （3）研究人员计划用甲图所示的同源重组技术敲除米曲霉g-1菌株中的基因并回补pyrG基因，来探究msn2基因对米曲霉产曲酸的影响，请根据图甲过程及原理判断图乙中A、B基因分别为________基因。 （4）已知米曲霉中的LaeA基因可促进其次级代谢产物合成酶基因的转录。科研人员对摇瓶培养相同时间的g-1和g-58菌株进行相关数据检测，结果如下表， 发酵时间（d） g-1菌株（g/L） g-58菌株（g/L） 曲酸产量（g/L） kojR基因相对表达量 LaeA基因相对表达量 曲酸产量（g/L） kojR基因相对表达量 LaeA基因相对表达量 2 2 — — 3 — — 3 6.5 1 1 9.5 130 2.2 4 7.5 — — 16 — — 6 10.5 3.5 3.8 25.5 100 3.7 据表分析，kojR基因能使米曲霉产曲酸增多的原因可能是：发酵早期________。 7．（2026四川绵阳.一模）在现代生物科学技术中，基因工程技术和蛋白质工程技术有着广泛的应用。某科研小组欲通过合成基因A来生产一种具有特殊功能的蛋白质，该蛋白质能显著提高农作物的抗逆性，从而提高粮食产量。回答下列问题。 (1)基因A合成后，可采用_________技术对基因A进行大量扩增，该过程中需要加入的酶是_________。 (2)已知质粒中位于启动子与终止子之间的酶切位点（图甲），以及限制酶的识别序列和切割位点（图乙）。在构建基因表达载体时，若用的是E.coli DNA连接酶，为了基因A能高效地与质粒连接并保证方向正确，需要在基因A的上游和下游分别添加___________（填限制酶的名称）的识别序列。 限制酶识别序列及切割位点： (3)基因表达载体构建完成后，为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用下图中的一对引物___________对待测质粒进行扩增，扩增产物一般通过___________凝胶电泳来鉴定。 (4)用含有重组质粒的农杆菌侵染某农作物的愈伤组织细胞时，___________转移到被侵染细胞并将其整合到该细胞的染色体DNA上。筛选出成功转化的愈伤组织，经诱导再分化过程，培育出转基因植株，为检测基因A是否在培育的新植株中翻译出该特殊蛋白，可用___________技术。 8． （2026四川凉山.一模）对氧磷是一种有剧毒的杀虫剂，会造成环境污染。有机磷水解酶（OPS）可催化对氧磷水解。科学家筛选出高产OPS的微生物，并利用基因工程构建环境安全型工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备有机磷农药微生物传感器（如图1），为环境污染治理提供新方法。请回答下列问题： （1）要制备如图1的有机磷农药微生物传感器，至少需要三种“分子工具”，即相应的酶和_____。在该传感器中，RNA聚合酶能识别和结合的部位是_____，该启动子属于_____型启动子。 （2）据图分析，该有机磷农药微生物传感器能检测到环境中的对氧磷的原因是_____。 （3）工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成安全隐患。科学家将ccdB自杀基因、MIR-15a基因插入重组质粒中，使工程菌在对氧磷被耗尽时菌株可启动“自杀”。ccdB自杀基因表达的毒蛋白可使工程菌致死，MIR-15a基因控制合成的miRNA能结合ccdB自杀基因的mRNA，从而抑制蛋白质的合成，则ccdB自杀基因、MIR-15a基因分别插入图2中的_____、_____（填字母）位点。当“自杀”工程菌用于被对氧磷污染的环境治理时，该菌启动“自杀”的时机和方法是_____。 9． （2026四川巴中.一模）杂草是全球农业生产的主要威胁。除草剂FCD抑制植物细胞中原卟啉原IX氧化酶的活性以达到除草效果。某科研团队利用CRISPR/Cas9技术，通过改变PPOI基因(编码原卟啉原IX氧化酶)结构来增加水稻(2N=24)对除草剂FCD的耐受性。部分技术流程如下： 注：sgRNA表达盒1和sgRNA表达盒2可在水稻细胞中分别转录出能与PPOI基因和CP12基因部分序列互补配对的sgRNA，引导Cas9基因表达的Cas9蛋白定点切割DNA。 （1）上图重组Ti质粒中的sgRNA表达盒中必须包含切割目标基因的靶序列以及驱动基因转录的___________等结构。在构建重组Ti质粒时所需的酶有___________(写出两种)，将重组Ti质粒导入农杆菌时需要用Ca2+处理农杆菌，使其处于___________的生理状态。 （2）研究人员培育FCD耐受水稻的技术思路：利用导入水稻的CRISPR/Cas9系统对其进行基因编辑，使其2号染色体上的PPOI基因与CP12基因结构改变(如下左图所示)，从而赋予水稻对FCD的耐受性，并利用PCR技术结合电泳对转基因水稻进行鉴定(结果如下右图所示)。 注：F1、F2、R1、R2代表引物；为成功表达的CRISPR/Cas9系统；强启动子能提高基因的转录水平 回答下列问题： ①利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时可选择的引物组合为___________。若基因编辑成功，PCR扩增后产物的电泳结果应该为___________号泳道，通过该泳道条带的位置能否判断出细胞中基因编辑成功的2号染色体条数？___________，你作出判断的理由是___________。 ②基因编辑成功的PPO1基因转录的模板是___________(填“A链”或“B链”)，据题意推测基因编辑成功的转基因水稻对FCD耐受性增强的原因是___________。 （3）筛选出基因编辑成功的水稻细胞可通过___________技术将其培养成FCD耐受水稻植株。与杂交育种相比，该技术在保持优良性状方面的优点是___________。 10．（2026四川成都.一模） 腐胺是重要的生物多胺，在人体许多生理过程中具有重要作用，但环境中过量的腐胺会危害人体健康。科研人员按照图示原理，利用基因工程技术构建生物传感器来实现腐胺的检测。相关限制酶的识别序列为EcoRⅠ（）、XbaⅠ（）、SpeⅠ（）、PstⅠ（）。回答下列问题： （1）启动子B是______型启动子，当有PuuR蛋白存在时，便不能与______识别结合，导致GFP基因不能表达；当环境中有腐胺时，生物传感器可以发出绿色荧光，原因是______。 （2）构建重组质粒时，用限制酶______处理质粒1、用限制酶______处理质粒2，然后再用DNA连接酶连接。导入大肠杆菌后，在含有腐胺和氨苄青霉素的培养基上能发绿色荧光的______（填“一定”或“不一定”）是含有重组质粒的工程菌，原因是______。 （3）科研人员进一步将工程菌中的重组质粒进行了如下图（局部）所示的优化处理： 与优化前相比，优化后的工程菌检测灵敏度更高、荧光现象更明显，据图推测，荧光现象更明显的原因是______。 11．（2026四川攀枝花.一模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。下图为无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程示意图。回答下列问题： （1）无缝连接时，过程③所需的酶是_________。PCR技术分别扩增PABD和GFP基因时，配制的两个反应体系中，加入的物质中不同的是_________。 （2）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是_________。 （3）在利用农杆菌转化拟南芥，并获得转基因To代植株后，为筛选出成功转化的植株，应在培养基中加入_________。将To代植株自交，收获的T1代种子在抗性培养基上培养后，若抗性幼苗与非抗性幼苗的比例约为_________，则初步判断目的基因已稳定插入一条染色体上。 （4）成功获得转基因拟南芥后，可通过观测转基因拟南芥根尖细胞中_________，从而间接反映细胞内PA的分布与动态变化。若想进一步验证该荧光信号确实由PA分子所引起，可采取的方案是_________。 12．（2026四川遂宁.一模）我国科学家从豆科植物种子中提取了一类“抑制剂胱氨酸结模式多肽（ICK模式多肽）”，研究发现该多肽能通过口服来降低血糖，但提取量极少，难以满足临床需求。某研究团队运用生物工程技术手段，利用大肠杆菌来生产ICK模式多肽。下图表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶切割位点。回答下列问题: （注:bp代表碱基对，图中数值均指相邻两限制酶切口间的碱基对数目；Kanr基因为卡那霉素抗性基因；lacZ表达的产物可将无色物质X-gal分解为蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。） （1）已知目的基因的一条链的部分碱基序列为5′-ATGCAA……CAGTCC-3′，通过 PCR 技术扩增目的基因时，选用的一对引物的碱基序列为_________（注明序列的 5′和 3′端）。 （2）构建基因表达载体时，要将目的基因准确插入质粒中，最好选用的限制酶是_________。若将构建好的重组质粒再用 EcoRⅠ充分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，将得到长度为_________bp的条带。 （3）将目的基因导入受体菌时，若要准确筛选出含重组质粒的受体菌，需要在基本培养基中添加的物质有_________，添加了这些特殊物质的培养基称为_________（填“选择”、“鉴别”或“选择和鉴别”）培养基。 （4）为便于获取目的菌株，采用的接种方法是_________。接种后在适宜的条件下培养一段时间，选择菌落为_________色的大肠杆菌作菌种，理由是__________________________。 13．（2026四川资阳.一模） 研究人员将海岛棉中抗草铵膦除草剂基因Bar导入陆地棉中，经培养筛选获得抗草铵膦除草剂的棉花。据图回答下列问题： （1）为了便于质粒和Bar基因连接构建基因表达载体，在利用PCR技术扩增Bar基因时需要设计特定的引物，结合图1分析，左边引物要包括哪些碱基序列_____（注明引物的方向）。耐高温的DNA聚合酶从引物的_____端开始连接脱氧核苷酸。与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是_____（答出1点）。 （2）图1质粒中TetR基因的作用是_____；利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，一般选择陆地棉的_____细胞作为受体细胞，最终得到的转基因棉花不具有抗四环素的特性，原因是_____。 （3）为了鉴定转基因棉培育是否成功，可提取转基因棉花的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取到的DNA样品进行检测，在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与_____有关（答出2点）；还可以从个体水平进行鉴定，方法是_____。 14．（2026四川达州.一模）我国粳稻栽培面积占水稻栽培面积的90%以上，直链淀粉合成酶合成基因D表达使粳稻直链淀粉相对含量高，米饭的粘性、柔软性和光泽度差。研究发现，若粳稻的D基因沉默不表达，则分支淀粉相对含量大大提高，水稻的糯性明显增大而更受人们喜爱。水稻科研组尝试采用不同方法来培育糯稻。回答下列问题： （1）方法I：让粳稻在问天实验舱内完成水稻全生命周期实验，返回地面后检测发现：粳稻D基因的部分碱基被替换但合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列并未改变，出现此现象的原因可能是__________。这类基因突变并不是非益即害而是中性的，人工选择对这类基因突变_________（填“能”或“不能”）起作用。 （2）方法II：让 D 基因的启动子中部分碱基发生甲基化修饰，获得了糯稻植株甲。将植株甲与纯合野生型粳稻乙杂交，F1均为粳稻，F1自交获得F2。 ①用D基因探针检测发现植株甲无D基因的mRNA，说明D基因甲基化后，___________酶不能与其结合而无法产生相应的mRNA。 ②检测发现F2植株中出现了糯稻植株，解释此现象的原因是 ___________。 （3）方法III：用反义基因技术培育糯稻，其主要流程如下图： ①粳稻D基因控制合成的直链淀粉合成酶的第一个氨基酸是甲硫氨酸（密码子为AUG）。由此可推知，D基因转录时以___________（填“a链”或“b链”）为模板链。 ②用限制酶SmaI和BamHI分别酶切质粒和D基因所在DNA片段，然后构建反义质粒，将反义质粒导入粳稻。检测到转基因植物的分支淀粉含量提高。反义基因技术能提高粳稻糯性机制是：___________转录出的mRNA与粳稻自身所含D基因转录出的mRNA结合成双链RNA，阻止了糯稻中D基因的翻译。 15．（2026四川德阳.一模）衣藻可通过光合作用等代谢途径将CO2转化为多种有机物，可用于处理工业废水、制备生物柴油，但高浓度CO2条件会使衣藻的细胞质酸化从而抑制其增殖。研究人员从烟草中提取了一种能特异性转运H+的载体蛋白基因——PMA基因（4691bp）导入衣藻细胞，以提高其对CO2的耐受度。下图展示了构建转基因衣藻的部分过程示意图。 （注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Bler表示博来霉素抗性基因，氨苄青霉素对细菌有毒性，博来霉素对藻类有毒性）。 分析回答下列问题： （1）先将重组质粒导入大肠杆菌的目的是_________，培养基1和培养基2除了加入必要的营养成分以外，还需要分别加入_________和_________。 （2）获取目的基因时，经常在引物末端引入限制酶识别序列，方便后续的DNA重组。下图所示的DNA分子经PCR扩增后应选用的限制酶为_____________________（选填编号）。 ①EcoRⅠ：5′-GAATTC-3′ ②AftⅡ：5′-CTTAAG-3′ ③XhoI：5′-CTCGAG-3′ ④BamHⅠ：5′-GGATCC-3′ ⑤BglⅡ：5′-AGATCT-3′ ⑥XbaⅠ：5′-TCTAGA-3′ （3）经筛选得到若干目标藻株后，通过电泳对其进行目的基因鉴定，下图为部分实验结果，其中A泳道的样品为野生衣藻都具有的actin基因的扩增产物，则含有目的基因PMA的藻株是_____________________。 （4）衣藻在高氮磷的污水环境中会大量繁殖，但油脂生成能力极弱；衣藻在缺乏氮磷的胁迫环境中生长受抑制，但磷饥饿诱导型启动子SQD2会驱动油脂合成的关键基因DGTT4基因的表达。为了提高衣藻油脂产量，在培养衣藻时应该_________。胁迫会抑制衣藻生长，不利于油脂的持续高效生产。研究发现，红细菌内存在一种远红光诱导型启动子，该启动子只在波长725-735nm的远红光照射下才开启。根据以上信息，利用所学的基因工程知识，为了既能提高油脂产量又不影响治理高氮磷污水，可以进行的操作是___________________________________________________。 蛋白质工程 胞的结构 考点2 1． “逆折叠AI模型”依据自然界中已知的大量“序列-结构”对应关系，学习到氨基酸序列与最终三维结构之间复杂的对应关系，使该模型能从目标蛋白质的结构出发，快速生成大量可能折叠成该结构的氨基酸序列，实现了蛋白质工程的自动化和标准化。下列说法正确的是 A. 生成目标氨基酸序列需要肽键的结构、氨基酸的性质与数目为依据 B. 从蛋白质的三维结构到氨基酸序列，AI模型依据的原理是中心法则 C. 氨基酸发生替换后，蛋白质的空间结构和功能可能不会因此而发生改变 D. 该模型预测蛋白质的结构并直接设计改造蛋白质，而不用改造基因 2． （2026四川攀枝花.一模）天然人胰岛素易形成聚合体，起效慢。科学家通过将天然人胰岛素的第28位脯氨酸与第29位赖氨酸的位置互换，研发出速效胰岛素类药物。下列说法错误的是 A. 天然人胰岛素基因转录过程中作为模板的是b链 B. 天然人胰岛素基因表达需要mRNA、tRNA及rRNA的参与 C. 天然人胰岛素中第28位氨基酸对应的反密码子为5'-CGG-3' D. 天然人胰岛素的合成分泌需要内质网、线粒体等细胞器参与 3． （2026四川内江.一模） 蛛丝蛋白因强度高和韧性大等优点，在医疗、军事防弹等领域具有较大潜力。研究人员欲将化学合成的优化蛛丝蛋白基因导入亮氨酸营养缺陷型大肠杆菌（自身无法合成亮氨酸，必须从外界环境中获取）中进行发酵生产（流程如下图）。回答下列问题： 注：标记基因为亮氨酸合成酶基因。 （1）在设计化学合成基因时，需剔除天然基因中冗余、低效和不相容的部分，如去除相应限制酶识别序列；需将编码丙氨酸的多种密码子优化成大肠杆菌偏好的CCU和GCC。 ①化学合成蛛丝蛋白基因时，其碱基序列需根据天然蛛丝蛋白中的________序列进行推测。 ②据图分析，化学合成目的基因可能去除了天然蛛丝蛋白基因内部____________限制酶（答出2种）的识别序列。 ③将编码丙氨酸的多种密码子优化成大肠杆菌偏好的密码子的意义是______________。（答出1点） （2）需将导入重组质粒的大肠杆菌接种到______的培养基上进行筛选后，再用于发酵生产。发酵生产过程中，需随时检测大肠杆菌数量、产物浓度，及时添加必要营养成分，且要严格控制_________________ ________________________（答出2点）等发酵条件。 （3）外源蛋白的过早表达会与菌体生长竞争资源，抑制菌体生长繁殖。研究人员可通过对基因表达载体上的___________________________进行设计，来调控蛛丝蛋白基因表达时期，使其与菌体生长阶段分离，以提高蛛丝蛋白产量。 （4）在大规模工业化生产中，与使用抗生素抗性基因相比，选择亮氨酸合成酶基因作为标记基因具有明显优势。试从不同角度分析其优势：______。（答出2点） / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题12基因工程 2大考点概览 考点01 基因工程 考点02 蛋白质工程 基因工程 考点1 1． 【答案】D 2．【答案】D 3．【答案】B 4．【答案】（1）①. 保证酶切后与质粒正确连接，同时可避免目的基因和质粒自连 ②. GGATCC （2）①. 潮霉素 ②. T-DNA （3）在目的基因的首端添加在果实细胞中特异性表达的启动子 5．【答案】（1） ①. 耐高温的DNA聚合酶 ②. 复性 ③. 延伸 ④. 5'-TCTAGA-3' ⑤. 5'-AAGCTT-3' （2） ①. 农杆菌转化法 ②. Ti质粒上的T-DNA ③. proPER21是在叶柄细胞以外的细胞中不表达的启动子 （3） ①. 不需要 ②. 植株生长发育需要有正常的激素调控 （4）在维持棉花产量的前提下，减少化学药剂使用量；提高脱叶效率；利于机械采收；降低成本、减少环境污染 6．【答案】（1） ①. 激活TaqDNA聚合酶 ②. 2 （2）①. 引物2和引物4 ②. ①②③④ （3）pyrG基因和msn2基因 （4）促进LaeA基因表达，促进次生代谢产物合成酶的合成，进而增加次生代谢产物的合成，有利于曲酸的产生 7．【答案】(1) PCR/聚合酶链式反应 耐高温的DNA聚合酶/TaqDNA聚合酶 (2)NheⅠ（或XbaⅠ）、EcoRⅠ (3) P1和P3 琼脂糖 (4) Ti质粒上的T-DNA 抗原-抗体杂交 8．【答案】（1） ①. 载体 ②. T7和RecA ③. 诱导 （2）对氧磷激活T7启动子，OPS基因表达合成OPS水解对氧磷，产生的4-硝基苯酚能激活RecA启动子，促进EGFP基因的表达合成EGFP，所以能通过绿色荧光检测环境中的对氧磷（有机磷农药） （3） ①. B ②. D ③. 没有绿色荧光时，用强紫外线照射 9．【答案】（1） ①. 启动子 ②. 限制酶、DNA连接酶 ③. 能吸收周围环境中DNA分子 （2） ①. 引物F1和R2或F2和R1 ②. 3 ③. 不能 ④. PCR产物的量与模板数量没有线性关系 ⑤. A链 ⑥. 强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加，增强了对FCD的耐受性 （3） ①. 植物组织培养 ②. 可以保持亲本的优良性状，不会出现性状分离 10.【答案】（1） ①. 诱导 ②. RNA聚合酶 ③. 腐胺与PuuR蛋白结合会解除PuuR蛋白对启动子B的抑制，使GFP基因表达出发荧光的GFP蛋白 （2） ①. EcoRⅠ、SpeⅠ ②. EcoRⅠ、XbaⅠ ③. 不一定 ④. 质粒2导入大肠杆菌也可以发出绿色荧光 （3）腐胺作用下，蛋白C激活的启动子比启动子B激发GFP基因表达的能力更强，使GFP蛋白含量更高 11.【答案】（1） ①. DNA 聚合酶和DNA连接酶 ②. 模板和引物 （2）限制性核酸内切酶 （3） ①. 草铵膦 ②. 3：1 （4）①. 绿色荧光点分布      ②. 加入能够特异降解或抑制 PA 合成的试剂，观察荧光信号是否随之减弱或消失 12.【答案】（1）5'-ATGCAA-3'和5'-GGACTG-3' （2） ①. BamHⅠ和 XmaⅠ ②. 1800bp和270bp （3） ①. 卡那霉素和 X-gal ②. 选择和鉴别 （4） ①. 稀释涂布平板法 ②. 白 ③. 目的基因插入到LacZ基因内部，导致不能产生分解X-gal为蓝色物质的酶，使菌落呈现白色 13.【答案】（1） ①. 5’-GAATTCATGGGC-3’ ②. 3’ ③. 能避免目的基因和载体自身环化（能避免目的基因与载体反向连接） （2） ①. 作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选（答到标记基因即可） ②. 受精卵或体细胞 ③. 只有T-DNA片段能转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，而TetR基因不在T-DNA片段上 （3）①. 凝胶浓度、分子构象（电场强度） ②. 用草铵膦处理陆地棉，观察其是否能正常生长 14.【答案】（1） ①. 密码子具有简并性（或碱基序列改变发生在基因D的非编码区，或其他合理答案） ②. 不能 （2） ①. RNA聚合 ②. F2中有部分植株含有两个甲基化的D基因，由于该D基因的表达受到抑制，这部分植株表现为糯性 （3） ①. b链 ②. 反义质粒中 D 基因 15.【答案】（1） ①. 获得大量重组质粒 ②. 氨苄青霉素 ③. 博来霉素 （2）①和⑤ （3）2和3 （4）①. 先在高氮磷的环境中，再转移到缺乏氮磷的胁迫环境中培养 ②. 将DGTT4基因的磷饥饿诱导型启动子（SQD2）替换为红细菌体内的远红光诱导型启动子，并在适宜时间用远红光照射 蛋白质工程 胞的结构 考点2 1．【答案】C 2．【答案】A 3．【答案】（1） ①． 氨基酸 ②． NdeⅠ、XhoⅠ ③． 提高蛛丝蛋白基因在大肠杆菌中的翻译效率（使翻译过程更顺畅，增加蛋白合成量） （2） ①. 不含亮氨酸 ②. 温度、pH和溶解氧 （3）启动子 （4）不使用抗生素，可降低生产成本；可避免抗生素残留；可避免抗生素抗性基因扩散的潜在风险；培养基中不补充亮氨酸，可持续淘汰质粒丢失的菌株，提高生产效率 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题12基因工程 2大考点概览 考点01 基因工程 考点02 蛋白质工程 基因工程 考点1 1． （2026四川凉山.一模）为在大肠杆菌中表达人的胰岛素基因，将胰岛素基因（目的基因）插入质粒，构建重组质粒，并导入大肠杆菌。为鉴定大肠杆菌中是否含有正确插入胰岛素基因的重组质粒，设计引物进行PCR扩增（引物1~4结合位置如图所示，表示引物方向），所用模板、引物和结果下表。下列分析错误的是 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 模板 引物对 引物1、2 引物3、4 引物2、3 引物1、4 扩增产物 无 有 有 有 无 无 无 有 A. 图中的酶处理与PCR中的酶不同，但形成的化学键相同 B. 在PCR反应过程中，两条单链DNA与引物在复性阶段结合 C. ①与⑥离心管都没有扩增产物，但形成的原因可能不相同 D. ②④⑧离心管中的都是胰岛素基因正向插入的重组质粒 【答案】D 【详解】A、图中的酶处理（DNA连接酶）与PCR中的酶（Taq酶）不同，但形成的化学键相同，均涉及磷酸二酯键，A正确； B、在PCR反应过程中，复性阶段发生引物与两条模板DNA结合，B正确； C、①无扩增产物，因质粒P0无胰岛素基因，⑥无扩增产物，可能因胰岛素基因反向插入质粒P0，故①与⑥离心管都没有扩增产物，但形成的原因可能不相同，C正确； D、引物1和引物2扩增出的是胰岛素基因，故②离心管中的PX无法确定胰岛素基因是否被正向插入。引物3和引物4含与P0互补的碱基序列，无法确定④离心管中的PX中胰岛素基因是否被正向插入。P0含与引物4互补的碱基序列，胰岛素基因含与引物1互补的碱基序列，可确定⑧离心管中的PX是胰岛素基因正向插入的重组质粒，因为反向插入应该无扩增产物出现，D错误。 故选D。 2． （2026四川广安.一模） 为获得高产脂质的硅藻用于生产生物柴油，研究人员将苹果酸酶（ME）基因（长度约800 bp）构建到含新霉素抗性基因的超表达载体上，导入硅藻细胞。为验证转化是否成功，以野生型基因组、转化后硅藻基因组以及重组质粒为模板，使用可特异性扩增完整ME基因的引物进行PCR，对产物进行琼脂糖凝胶电泳，并测定条带亮度（相对值），结果如图所示，下列分析正确的是 A. PCR过程中，引物作用是使Taq DNA聚合酶从其3'端开始连接核糖核苷酸 B. 为确保ME基因正确插入载体，需在引物3'端加入不同的限制酶识别序列 C. 转化后硅藻基因组检测到明显条带，说明ME基因已整合到其染色体DNA上 D. 为评价所获硅藻品系的生产潜力，还需检测其生长速率与胞内脂质含量 【答案】D 【详解】A、PCR使用DNA聚合酶连接脱氧核糖核苷酸（dNTP），不是核糖核苷酸。而且引物是提供 3'-OH 末端让聚合酶延伸 DNA 链，A错误； B、设计引物时，在5' 端加酶切位点（用于克隆时引入酶切位点），不是在 3' 端，3' 端必须与模板匹配以保证扩增特异性。而且“不同限制酶识别序列”不是必须的（有时只需同种两端不同酶），B错误； C、转化后硅藻基因组检测到明显条带，可能ME基因整合到质粒上，质粒进入转化后的硅藻，不能说明ME基因已整合到其染色体DNA上，C错误； D、因为实验目的是获得高产脂质的硅藻用于生物柴油，仅验证基因转入还不够，必须评估实际表现：生长速率（影响培养产量）和脂质含量（影响产油率）是关键生产指标，D正确。 故选D。 3． （2026四川内江.一模）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展栽培马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。结合下图分析，下列叙述错误的是 A. PCR扩增S基因时，需要模板、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等 B. 为保证S基因正确插入载体中，需对其上游引物的5′端添加碱基序列5′-GAATTC-3′ C. 用含重组Ti质粒的农杆菌侵染栽培马铃薯后，利用抗性基因2筛选成功转化的细胞 D. 将已转化的马铃薯与普通栽培马铃薯种植在寒冷条件下可检验S基因是否发挥作用 【答案】B 【详解】A、PCR扩增基因的必备条件是：模板（S 基因的 DNA）、引物、4 种脱氧核苷酸（dNTP）、耐高温的 DNA 聚合酶（Taq 酶），A正确； B、为保证S基因正确插入载体中，扩增目的基因时，需要在引物的5“端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BglⅡ、EcoRI和XbaⅠ的识别序列，切割载体需从这三种酶里选两种；而S基因内部含有XbaⅠ，这种酶不能用于切割S基因。再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BglⅡ、EcoRI切割载体，同时用BglⅡ和EcoRI切割S基因，才能保证S基因的正向连接(启动子一端)，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'，在下游引物添加的碱基序列是5'-GAATTC-3'，B错误； C、Ti 质粒的T-DNA区域包含抗性基因2（图中抗性基因2位于T-DNA范围内），T-DNA 会转移到植物细胞，因此可利用抗性基因2筛选转化细胞，C正确； D、检验S基因是否发挥抗寒作用，可通过表型鉴定：将已转化（含S基因）和普通马铃薯种植在寒冷条件下，对比两者的抗寒能力，即可验证S基因的功能，D正确。 故选B。 4． （2026四川广安.一模） 为培育富含花青素的紫色番茄，科研人员拟将金鱼草中调控花青素合成的关键转录因子基因（Del）转入番茄。选用的植物表达载体及Del基因的结构如下，请回答下列问题： （1）科研人员决定用BamHⅠ和HindⅢ对Del基因和载体进行双酶切后连接，PCR扩增Del基因时，需在目的基因两端添加这两种限制酶的识别序列的原因是______（答出两点即可）。已知Del基因转录时的模板链序列为：5-TTGGCA……AGCCAT-3。为准确连接，在扩增时，在目的基因上游引物为：5-______ATGGCT-3。（请填写6个碱基序列） （2）将重组质粒导入农杆菌，为初步筛选含有质粒的菌落，应在培养基中添加______。农杆菌导入番茄细胞，最终整合到番茄染色体DNA上的是载体的______区域。 （3）科研人员使用现有载体，会使Del基因在全植株表达造成物质和能量浪费，若要使Del基因仅在番茄果实中表达，需对载体进行的改造是______。 4．【答案】（1）①. 保证酶切后与质粒正确连接，同时可避免目的基因和质粒自连 ②. GGATCC （2）①. 潮霉素 ②. T-DNA （3）在目的基因的首端添加在果实细胞中特异性表达的启动子 【解析】 【分析】1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。 (1)科研人员决定用BamHⅠ和HindⅢ对Del基因和载体进行双酶切后连接，PCR扩增Del基因时，需在目的基因两端添加这两种限制酶的识别序列，这样才能保证目的基因被酶切后获得与质粒切割后相同的黏性末端，保证目的基因和质粒正确连接，同时也能避免目的基因自连。已知Del基因转录时的模板链序列为：5-TTGGCA……AGCCAT-3。为准确连接，在扩增时，在目的基因上游引物需要连接BamHⅠ的识别序列，为：5-GGATCCATGGCT-3。 (2)重组质粒中含有潮霉素抗性基因，在将重组质粒导入农杆菌时，为初步筛选含有质粒的菌落，应在培养基中添加潮霉素。农杆菌导入番茄细胞，最终整合到番茄染色体DNA上的是载体的T-DNA，因此需要将目的基因植入其中。 (3)科研人员使用现有载体，会使Del基因在全植株表达造成物质和能量浪费，若要使Del基因仅在番茄果实中表达，需对载体进行的改造是在目的基因的首端添加在果实细胞中特异性表达的启动子，这样可以实现目的基因只在果实细胞中表达。 5． （2026四川绵阳B区.一模）棉花叶柄脱落细胞中RLF1基因编码细胞分裂素氧化酶，该酶可通过降解细胞分裂素加速叶片脱落。为了培育经脱叶剂处理可快速脱叶的棉花品种，以适宜机械化采收，科研人员设计了育种思路：先筛选脱叶剂诱导、叶柄脱落区特异表达的proPER21启动子，再构建proPER21：RLF1转基因株系，进行大田试验选育。回答下列问题。 I、筛选诱导型组织特异性启动子。 II、用选定启动子与RLF1基因构建proPER21：RLF1转基因株系，并进行田间试验。 （1）扩增目标序列，构建表达载体：通过生物信息学分析，在若干备选启动子中选定proPER21启动子（如图1）、Ti质粒pGreen II-0800-Luc（如图2）进行试验。 注：FLuc基因表达萤火虫荧光素酶，RLuc基因表达海肾荧光素酶，两种酶可以催化不同底物发出不同颜色的荧光。 ①用PCR技术对目标序列进行扩增时，需要模板、引物、原料和________（填酶名称）等条件，其中引物与模板结合发生在________阶段，酶的作用发生在________阶段。 ②为了替换常规启动子并将拟选启动子正确插入载体质粒的主报告基因上游，需在拟选启动子的上、下游引物的5'端分别加入碱基序列________、________。 （2）转染细胞，培养，检测。实验处理如下表，实验结果符合预期。 受体细胞 空Ti质粒 重组Ti质粒 脱叶剂 培养与检测 叶柄细胞 + - + 培养48小时后，鉴定相对荧光强度。+：表示有转入或加入；-：表示无转入或不加入。 - - + + - 棉铃细胞 与叶柄细胞处理相同 ①将Ti空质粒和重组Ti质粒通过________（方法）分别转入棉花叶柄细胞和棉铃细胞，并将________整合到该细胞的染色体上。 ②实验中用棉铃细胞作受体细胞，目的是验证_______。 （3）构建proPER21：RLF1转基因株系时________（“需要”或“不需要”）敲除细胞中原有RLF1基因，说明理由________。 （4）田间试验显示，该株系在70%脱叶剂用量下，脱叶效率更优于100%脱叶剂处理下的野生型，且棉铃数量与对照无显著差异。其积极意义是__________（答出2点即可）。 5．【答案】（1） ①. 耐高温的DNA聚合酶 ②. 复性 ③. 延伸 ④. 5'-TCTAGA-3' ⑤. 5'-AAGCTT-3' （2） ①. 农杆菌转化法 ②. Ti质粒上的T-DNA ③. proPER21是在叶柄细胞以外的细胞中不表达的启动子 （3） ①. 不需要 ②. 植株生长发育需要有正常的激素调控 （4）在维持棉花产量的前提下，减少化学药剂使用量；提高脱叶效率；利于机械采收；降低成本、减少环境污染 【解析】 （1）①PCR（多聚酶链式反应）是体外扩增DNA的技术，需3个核心条件：模板DNA（目标序列）、一对引物（定位扩增区域）、4种脱氧核苷酸（原料）、耐高温的DNA聚合酶（催化子链合成） ；PCR分3个循环阶段：变性→复性→延伸，各阶段功能如下： 变性（90-95℃）：DNA双链解旋为单链；复性（55-60℃）：引物与模板单链的互补区域结合（定位扩增起点）； 延伸（72℃左右）：耐高温的DNA聚合酶沿引物方向合成子链。 ②构建重组载体时，需保证proPER21启动子定向插入Ti质粒的“主报告基因（FLuc）上游” ，替换原有的常规启动子（P35S）。关键是让PCR扩增的启动子两端携带与Ti质粒对应位置匹配的限制酶识别序列，实现“酶切后定向连接”。Ti质粒中主报告基因（FLuc）上游存在XbaⅠ和HindⅢ的酶切位点，引物引入这两个序列后，PCR扩增的proPER21启动子两端会带有对应酶切位点，用XbaⅠ和HindⅢ双酶切启动子与质粒后，可将启动子定向插入FLuc上游，确保启动子能驱动报告基因表达（用于后续检测启动子活性）。 （2）①双子叶植物（如棉花）常用的转基因方法是农杆菌转化法，核心依赖农杆菌的Ti质粒：Ti质粒上的T-DNA（可转移DNA） 能自主转移到植物细胞，并整合到植物细胞的染色体DNA上，是基因工程中常用的“载体骨架”。 ②题干明确proPER21是“叶柄脱落区特异表达的启动子”（仅在叶柄脱落区表达，在其他组织不表达）。实验设置“叶柄细胞”（目标组织）和“棉铃细胞”（非目标组织）作为受体，形成对照，验证启动子的“组织特异性”。实验目的是验证proPER21是在叶柄细胞以外的细胞（如棉铃细胞）中不表达的启动子。 若棉铃细胞中转入重组质粒后，即使加脱叶剂，主报告基因（FLuc）也不表达（荧光强度低），而叶柄细胞中表达（荧光强度高），则证明proPER21具有叶柄特异性，符合育种需求（避免启动子在棉铃等关键组织表达，影响产量）。 （3）RLF1基因编码细胞分裂素氧化酶，降解细胞分裂素（细胞分裂素可延缓叶片衰老、抑制脱落）。原有RLF1基因参与棉花正常的生长发育调控：如调控叶片自然脱落、维持激素平衡（若敲除，会导致细胞分裂素积累，叶片脱落异常，影响植株正常生长）。植株生长发育需要原有RLF1基因维持正常的激素调控（如自然脱落、激素平衡），敲除会导致植株生理功能紊乱，影响生长和产量。所以构建proPER21：RLF1转基因株系时不需要敲除细胞中原有RLF1基因。 （4） 70%脱叶剂用量下，转基因株系脱叶效率＞100%脱叶剂处理的野生型，且棉铃数量（产量）与对照无差异，结合育种目标（适宜机械化采收），推导意义如下： 生态与成本层面：减少脱叶剂用量（70% vs 100%），降低化学药剂对环境的污染，同时减少农药采购成本；生产效率层面：脱叶效率更高，可快速满足机械化采收的需求（避免叶片残留影响机械作业）； 经济层面：棉铃数量无差异，说明转基因株系维持了原有产量，保证棉农经济效益。 6． （2026四川自贡.一模）曲酸是米曲霉的次生代谢产物，为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组技术将曲酸合成有关的kojR基因导入米曲霉g-1（pyrG基因缺陷）菌株中，获得高产的g-58菌株，部分过程如图甲所示，其中kanr（卡那霉素抗性基因）、pyrG（合成尿嘧啶关键基因）均为标记基因。请回答： （1）现欲通过PCR技术构建kojR-pyrG融合基因，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是________。采用SacI和SalI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生________条电泳条带。 （2）将重组质粒导入农杆菌后仍需用PCR验证融合基因的有无，应选择图甲中的引物组合是________；现有以下培养基成分。①碳源②氮源③无机盐④水⑤卡那霉素⑥尿嘧啶，筛选g-58菌株的培养基需要添加________（填序号）。 （3）研究人员计划用甲图所示的同源重组技术敲除米曲霉g-1菌株中的基因并回补pyrG基因，来探究msn2基因对米曲霉产曲酸的影响，请根据图甲过程及原理判断图乙中A、B基因分别为________基因。 （4）已知米曲霉中的LaeA基因可促进其次级代谢产物合成酶基因的转录。科研人员对摇瓶培养相同时间的g-1和g-58菌株进行相关数据检测，结果如下表， 发酵时间（d） g-1菌株（g/L） g-58菌株（g/L） 曲酸产量（g/L） kojR基因相对表达量 LaeA基因相对表达量 曲酸产量（g/L） kojR基因相对表达量 LaeA基因相对表达量 2 2 — — 3 — — 3 6.5 1 1 9.5 130 2.2 4 7.5 — — 16 — — 6 10.5 3.5 3.8 25.5 100 3.7 据表分析，kojR基因能使米曲霉产曲酸增多的原因可能是：发酵早期________。 6．【答案】（1） ①. 激活TaqDNA聚合酶 ②. 2 （2）①. 引物2和引物4 ②. ①②③④ （3）pyrG基因和msn2基因 （4）促进LaeA基因表达，促进次生代谢产物合成酶的合成，进而增加次生代谢产物的合成，有利于曲酸的产生 【解析】 （1）PCR反应中，Mg2+的作用是激活TaqDNA聚合酶的活性（Taq 酶的催化依赖Mg2+）。重组质粒含kojR-pyrG基因和kanr标记基因，用Sac I和Sal I完全酶切后，会产生2个片段（kojR-pyrG片段、含kanr的质粒片段），因此电泳检测应产生2条电泳条带。 （2）PCR技术要求两种引物分别与目的基因两条链的3'端结合，从而使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。根据图甲中引物的位置，应选择的引物组合是引物2和引物4。筛选g-58 菌株的培养基需添加①碳源、②氮源、③无机盐、④水。理由是g-58 菌株含pyrG基因（可自主合成尿嘧啶，无需添加⑥尿嘧啶）。 （3）根据图甲过程及原理，要敲除米曲霉g-1菌株中的msn2基因并回补pyrG基因，图乙中A基因应为pyrG基因，B基因应为msn2基因，这样通过同源重组可以实现对msn2基因的敲除和pyrG基因的回补。 （4）由表格可知，g-58菌株含有kojR基因，其kojR基因相对表达量、LaeA基因相对表达量均比g-1菌株高，且曲酸产量也更高。 因为已知米曲霉中的LaeA基因可促进其次生代谢产物合成酶基因的转录，所以可推测kojR基因能使米曲霉产曲酸增多的原因可能是：发酵早期通过促进LaeA基因表达，促进次生代谢产物合成酶的合成，进而增加次生代谢产物的合成，有利于曲酸的产生。 7．（2026四川绵阳.一模）在现代生物科学技术中，基因工程技术和蛋白质工程技术有着广泛的应用。某科研小组欲通过合成基因A来生产一种具有特殊功能的蛋白质，该蛋白质能显著提高农作物的抗逆性，从而提高粮食产量。回答下列问题。 (1)基因A合成后，可采用_________技术对基因A进行大量扩增，该过程中需要加入的酶是_________。 (2)已知质粒中位于启动子与终止子之间的酶切位点（图甲），以及限制酶的识别序列和切割位点（图乙）。在构建基因表达载体时，若用的是E.coli DNA连接酶，为了基因A能高效地与质粒连接并保证方向正确，需要在基因A的上游和下游分别添加___________（填限制酶的名称）的识别序列。 限制酶识别序列及切割位点： (3)基因表达载体构建完成后，为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用下图中的一对引物___________对待测质粒进行扩增，扩增产物一般通过___________凝胶电泳来鉴定。 (4)用含有重组质粒的农杆菌侵染某农作物的愈伤组织细胞时，___________转移到被侵染细胞并将其整合到该细胞的染色体DNA上。筛选出成功转化的愈伤组织，经诱导再分化过程，培育出转基因植株，为检测基因A是否在培育的新植株中翻译出该特殊蛋白，可用___________技术。 7．【答案】(1) PCR/聚合酶链式反应 耐高温的DNA聚合酶/TaqDNA聚合酶 (2)NheⅠ（或XbaⅠ）、EcoRⅠ (3) P1和P3 琼脂糖 (4) Ti质粒上的T-DNA 抗原-抗体杂交 【详解】（1）PCR技术可以对基因A进行大量扩增，扩增过程需要耐高温的DNA聚合酶。 （2）E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行连接，故不能选择SmaⅠ，不能同时选择NheⅠ和XbaⅠ或只选择EcoRⅠ，因为会产生相同的黏性末端，导致质粒自身环化，因此为了基因A能高效地与质粒连接并保证方向正确，需要在基因A的上游和下游分别添加NheⅠ（或XbaⅠ）、EcoRⅠ。 （3）要确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，需选择能扩增出包含基因A部分序列和质粒部分序列的引物，故应选用引物P1和P3。PCR扩增产物一般可通过琼脂糖凝胶电泳来进行鉴定，根据不同DNA分子迁移的结果进行鉴别。 （4）T-DNA属于可转移DNA，用含有重组质粒的农杆菌侵染某农作物的愈伤组织细胞时，Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染细胞并将其整合到该细胞的染色体DNA上。为检测基因A是否在培育的新植株中翻译出该特殊蛋白，可用抗原—抗体杂交技术。 8． （2026四川凉山.一模）对氧磷是一种有剧毒的杀虫剂，会造成环境污染。有机磷水解酶（OPS）可催化对氧磷水解。科学家筛选出高产OPS的微生物，并利用基因工程构建环境安全型工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备有机磷农药微生物传感器（如图1），为环境污染治理提供新方法。请回答下列问题： （1）要制备如图1的有机磷农药微生物传感器，至少需要三种“分子工具”，即相应的酶和_____。在该传感器中，RNA聚合酶能识别和结合的部位是_____，该启动子属于_____型启动子。 （2）据图分析，该有机磷农药微生物传感器能检测到环境中的对氧磷的原因是_____。 （3）工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成安全隐患。科学家将ccdB自杀基因、MIR-15a基因插入重组质粒中，使工程菌在对氧磷被耗尽时菌株可启动“自杀”。ccdB自杀基因表达的毒蛋白可使工程菌致死，MIR-15a基因控制合成的miRNA能结合ccdB自杀基因的mRNA，从而抑制蛋白质的合成，则ccdB自杀基因、MIR-15a基因分别插入图2中的_____、_____（填字母）位点。当“自杀”工程菌用于被对氧磷污染的环境治理时，该菌启动“自杀”的时机和方法是_____。 8．【答案】（1） ①. 载体 ②. T7和RecA ③. 诱导 （2）对氧磷激活T7启动子，OPS基因表达合成OPS水解对氧磷，产生的4-硝基苯酚能激活RecA启动子，促进EGFP基因的表达合成EGFP，所以能通过绿色荧光检测环境中的对氧磷（有机磷农药） （3） ①. B ②. D ③. 没有绿色荧光时，用强紫外线照射 【解析】 （1）基因工程的 “分子工具” 包括限制酶、DNA 连接酶和载体；RNA 聚合酶能识别和结合的部位是启动子（T7和 RecA）；该启动子（T7）需要对氧磷激活，属于诱导型启动子。 （2）有机磷农药微生物传感器能检测到环境中的对氧磷的原因是：当环境中存在对氧磷时，对氧磷会激活T7启动子，OPS基因表达合成OPS水解对氧磷，产生的4-硝基苯酚能激活RecA启动子，促进EGFP基因的表达合成EGFP，所以能通过绿色荧光检测环境中的对氧磷（有机磷农药）。 （3）根据题意，ccdB自杀基因表达的毒蛋白可使工程菌致死，MIR-15a基因控制合成的miRNA能结合ccdB自杀基因的mRNA从而抑制蛋白质合成。为了实现对ccdB自杀基因表达的调控，用紫外线照射时要能让工程菌死亡，需要让毒药基因接在B位点；MIR-15a基因要在存在对氧磷时发挥抑制ccdB自杀基因表达的作用，应插入D位点。当“自杀”工程菌用于被对氧磷污染的环境治理时，因为要在对氧磷被耗尽时启动“自杀”，所以时机是当对氧磷被耗尽即没有绿色荧光时启动“自杀”；方法是用强紫外线照射使工程菌死亡。 9． （2026四川巴中.一模）杂草是全球农业生产的主要威胁。除草剂FCD抑制植物细胞中原卟啉原IX氧化酶的活性以达到除草效果。某科研团队利用CRISPR/Cas9技术，通过改变PPOI基因(编码原卟啉原IX氧化酶)结构来增加水稻(2N=24)对除草剂FCD的耐受性。部分技术流程如下： 注：sgRNA表达盒1和sgRNA表达盒2可在水稻细胞中分别转录出能与PPOI基因和CP12基因部分序列互补配对的sgRNA，引导Cas9基因表达的Cas9蛋白定点切割DNA。 （1）上图重组Ti质粒中的sgRNA表达盒中必须包含切割目标基因的靶序列以及驱动基因转录的___________等结构。在构建重组Ti质粒时所需的酶有___________(写出两种)，将重组Ti质粒导入农杆菌时需要用Ca2+处理农杆菌，使其处于___________的生理状态。 （2）研究人员培育FCD耐受水稻的技术思路：利用导入水稻的CRISPR/Cas9系统对其进行基因编辑，使其2号染色体上的PPOI基因与CP12基因结构改变(如下左图所示)，从而赋予水稻对FCD的耐受性，并利用PCR技术结合电泳对转基因水稻进行鉴定(结果如下右图所示)。 注：F1、F2、R1、R2代表引物；为成功表达的CRISPR/Cas9系统；强启动子能提高基因的转录水平 回答下列问题： ①利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时可选择的引物组合为___________。若基因编辑成功，PCR扩增后产物的电泳结果应该为___________号泳道，通过该泳道条带的位置能否判断出细胞中基因编辑成功的2号染色体条数？___________，你作出判断的理由是___________。 ②基因编辑成功的PPO1基因转录的模板是___________(填“A链”或“B链”)，据题意推测基因编辑成功的转基因水稻对FCD耐受性增强的原因是___________。 （3）筛选出基因编辑成功的水稻细胞可通过___________技术将其培养成FCD耐受水稻植株。与杂交育种相比，该技术在保持优良性状方面的优点是___________。 9．【答案】（1） ①. 启动子 ②. 限制酶、DNA连接酶 ③. 能吸收周围环境中DNA分子 （2） ①. 引物F1和R2或F2和R1 ②. 3 ③. 不能 ④. PCR产物的量与模板数量没有线性关系 ⑤. A链 ⑥. 强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加，增强了对FCD的耐受性 （3） ①. 植物组织培养 ②. 可以保持亲本的优良性状，不会出现性状分离 【解析】 (1) 在基因表达载体中，驱动基因转录的结构是启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合位点，能启动基因的转录过程。在构建重组Ti质粒时，首先需要用限制酶切割目的基因和质粒，使它们产生相同的末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体质粒连接起来， 形成重组质粒。将重组Ti质粒导入农杆菌时需要用Ca2+处理农杆菌，使其处于能吸收周围环境DNA分子的生理状态，便于农杆菌吸收重组质粒。 (2) 利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功，需要选择能扩增出基因编辑前后有差异的片段。从图中可知，选择引物F1和R2或者F2和R1。若基因编辑成功，PCR扩增后产物的电泳长度会发生变化，编辑之前F1和R2，无法扩增出产物，编辑之后F1和R2可以扩增出1211大小的片段，根据电泳图，应对应3号泳道。通过该泳道条带的位置不能判断出细胞中基因编辑成功的2号染色体条数。细胞中DNA进行PCR扩增时，是以指数形式增加的，PCR产物的量与模板（这里的2号染色体）的数量没有线性对应关系，所以无法通过条带位置判断基因编辑成功的2号染色体条数。转录的模板链：基因转录时，是以DNA的一条链为模板，转录的方向是启动子到终止子，沿模板的3'端到5'端。根据图中信息，基因编辑成功的PPO1基因转录的模板是A链。转基因水稻对FCD耐受性增强的原因：强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使得PPO1基因（编码原卟啉原IX氧化酶）的表达量增加，从而增强了水稻对除草剂FCD的耐受性（因为除草剂FCD抑制植物细胞中原卟啉原IX氧化酶的活性，更多的原卟啉原IX氧化酶可在一定程度上抵抗FCD的抑制作用）。 (3) 筛选出基因编辑成功的水稻细胞，要将其培养成完整的植株，需要利用植物组织培养技术。植物组织培养技术可以将植物细胞培养成完整的植株，其原理是植物细胞的全能性。与杂交育种相比，植物组织培养技术在保持优良性状方面的优点是可以保持亲本的优良性状，不会出现性状分离。因为杂交育种过程中，由于基因的重新组合，后代可能会出现性状分离，而植物组织培养是无性生殖，能保持亲本的遗传特性。 10．（2026四川成都.一模） 腐胺是重要的生物多胺，在人体许多生理过程中具有重要作用，但环境中过量的腐胺会危害人体健康。科研人员按照图示原理，利用基因工程技术构建生物传感器来实现腐胺的检测。相关限制酶的识别序列为EcoRⅠ（）、XbaⅠ（）、SpeⅠ（）、PstⅠ（）。回答下列问题： （1）启动子B是______型启动子，当有PuuR蛋白存在时，便不能与______识别结合，导致GFP基因不能表达；当环境中有腐胺时，生物传感器可以发出绿色荧光，原因是______。 （2）构建重组质粒时，用限制酶______处理质粒1、用限制酶______处理质粒2，然后再用DNA连接酶连接。导入大肠杆菌后，在含有腐胺和氨苄青霉素的培养基上能发绿色荧光的______（填“一定”或“不一定”）是含有重组质粒的工程菌，原因是______。 （3）科研人员进一步将工程菌中的重组质粒进行了如下图（局部）所示的优化处理： 与优化前相比，优化后的工程菌检测灵敏度更高、荧光现象更明显，据图推测，荧光现象更明显的原因是______。 10.【答案】（1） ①. 诱导 ②. RNA聚合酶 ③. 腐胺与PuuR蛋白结合会解除PuuR蛋白对启动子B的抑制，使GFP基因表达出发荧光的GFP蛋白 （2） ①. EcoRⅠ、SpeⅠ ②. EcoRⅠ、XbaⅠ ③. 不一定 ④. 质粒2导入大肠杆菌也可以发出绿色荧光 （3）腐胺作用下，蛋白C激活的启动子比启动子B激发GFP基因表达的能力更强，使GFP蛋白含量更高 【解析】 （1）分析题图可知，启动子B的表达受到特定物质（腐胺）的诱导，因此启动子B是诱导型启动子，当有PuuR蛋白存在时，它会与启动子B结合，从而阻止RNA聚合酶与启动子B结合，导致GFP基因不能表达。结合题图可知，当环境中有腐胺时，腐胺会与PuuR蛋白结合，解除PuuR蛋白对启动子B的抑制，RNA聚合酶可以结合到启动子B上，启动GFP基因的表达，合成GFP蛋白，GFP蛋白在特定波长的光激发下会发出绿色荧光。 （2）分析题图可知，重组质粒是将质粒 1 的 “启动子 A + PuuR 基因 + 终止子”插入质粒2的启动子B和氨苄青霉素抗性基因之间，若要将质粒 1 的 “启动子 A + PuuR 基因 + 终止子”切割下来，需要在启动子A的左边选择限制酶EcoRⅠ或XbaⅠ，在质粒1终止子的右边选择限制酶SpeⅠ或PstⅠ切割，为避免质粒的自身环化和反向连接，故应用双酶切较好，因此质粒2应选择EcoRⅠ、XbaⅠ切割，由于XbaⅠ切割之后形成的黏性末端与SpeⅠ切割之后形成的黏性末端相同，故质粒1应选择EcoRⅠ、SpeⅠ进行切割。结合题图可知，由于重组质粒和质粒2中均有GFP基因，表达后均会发出绿色荧光，因此导入大肠杆菌后，在含有腐胺和氨苄青霉素的培养基上能发绿色荧光的不一定是含有重组质粒的工程菌。 （3）优化前：腐胺抑制 PuuR 蛋白→解除对启动子 B 的抑制→启动子 B 直接驱动GFP 基因转录→产生 GFP 蛋白（荧光强度由启动子 B 的直接转录效率决定）；优化后：腐胺抑制 PuuR 蛋白→解除对启动子 B 的抑制→启动子 B 先驱动蛋白 C 基因转录→表达蛋白 C→蛋白 C 激活 “蛋白 C 激活的启动子”→该启动子驱动GFP 基因转录。因此与优化前相比，优化后的工程菌检测灵敏度更高、荧光现象更明显的原因是腐胺作用下，蛋白C激活的启动子比启动子B激发GFP基因表达的能力更强，使GFP蛋白含量更高。 11．（2026四川攀枝花.一模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。下图为无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程示意图。回答下列问题： （1）无缝连接时，过程③所需的酶是_________。PCR技术分别扩增PABD和GFP基因时，配制的两个反应体系中，加入的物质中不同的是_________。 （2）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是_________。 （3）在利用农杆菌转化拟南芥，并获得转基因To代植株后，为筛选出成功转化的植株，应在培养基中加入_________。将To代植株自交，收获的T1代种子在抗性培养基上培养后，若抗性幼苗与非抗性幼苗的比例约为_________，则初步判断目的基因已稳定插入一条染色体上。 （4）成功获得转基因拟南芥后，可通过观测转基因拟南芥根尖细胞中_________，从而间接反映细胞内PA的分布与动态变化。若想进一步验证该荧光信号确实由PA分子所引起，可采取的方案是_________。 11.【答案】（1） ①. DNA 聚合酶和DNA连接酶 ②. 模板和引物 （2）限制性核酸内切酶 （3） ①. 草铵膦 ②. 3：1 （4）①. 绿色荧光点分布      ②. 加入能够特异降解或抑制 PA 合成的试剂，观察荧光信号是否随之减弱或消失 【解析】 （1）无缝连接时，过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到子链3′-OH末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 PCR扩增需要模板、原料、引物和TaqDNA聚合酶，扩增PABD和GFP这两种不同的基因，分别需要两种基因的单链DNA作为模板，即所需的模板不同，引物是根据目的基因复制起始端序列人工合成的，不同种类的基因所需的引物不同，综上分析，配制的两个反应体系中不同的有模板和引物。 （2）传统重组质粒构建过程需要用特定的限制性核酸内切酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，而无缝克隆技术构建重组质粒不需要限制性核酸内切酶，使用的是核酸外切酶和DNA连接酶。 （3）由图可知，bar（草铵膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌转化拟南芥，并获得转基因T0代植株后，应在培养基中加入草铵膦，能存活的说明是成功转化的植株。若目的基因已稳定插入一条染色体上，将T0代植株自交，若T0为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性为a，则T0的基因型为Aa，T0代自交获得的T1代幼苗的基因型及比例为A_:aa= 3：1，即抗性幼苗与非抗性幼苗的比例约为3：1。 （4）由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，从而间接反映细胞内PA的分布与动态变化。若要进一步验证此荧光确由 PA 分子所致，可采取“加入能够特异降解或抑制 PA 合成的试剂，观察荧光信号是否随之减弱或消失”的方案来佐证。 12．（2026四川遂宁.一模）我国科学家从豆科植物种子中提取了一类“抑制剂胱氨酸结模式多肽（ICK模式多肽）”，研究发现该多肽能通过口服来降低血糖，但提取量极少，难以满足临床需求。某研究团队运用生物工程技术手段，利用大肠杆菌来生产ICK模式多肽。下图表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶切割位点。回答下列问题: （注:bp代表碱基对，图中数值均指相邻两限制酶切口间的碱基对数目；Kanr基因为卡那霉素抗性基因；lacZ表达的产物可将无色物质X-gal分解为蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。） （1）已知目的基因的一条链的部分碱基序列为5′-ATGCAA……CAGTCC-3′，通过 PCR 技术扩增目的基因时，选用的一对引物的碱基序列为_________（注明序列的 5′和 3′端）。 （2）构建基因表达载体时，要将目的基因准确插入质粒中，最好选用的限制酶是_________。若将构建好的重组质粒再用 EcoRⅠ充分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，将得到长度为_________bp的条带。 （3）将目的基因导入受体菌时，若要准确筛选出含重组质粒的受体菌，需要在基本培养基中添加的物质有_________，添加了这些特殊物质的培养基称为_________（填“选择”、“鉴别”或“选择和鉴别”）培养基。 （4）为便于获取目的菌株，采用的接种方法是_________。接种后在适宜的条件下培养一段时间，选择菌落为_________色的大肠杆菌作菌种，理由是__________________________。 12.【答案】（1）5'-ATGCAA-3'和5'-GGACTG-3' （2） ①. BamHⅠ和 XmaⅠ ②. 1800bp和270bp （3） ①. 卡那霉素和 X-gal ②. 选择和鉴别 （4） ①. 稀释涂布平板法 ②. 白 ③. 目的基因插入到LacZ基因内部，导致不能产生分解X-gal为蓝色物质的酶，使菌落呈现白色 【解析】 （1）PCR技术中，引物需与目的基因两条链的3'端结合。已知目的基因一条链部分碱基序列为5'-ATGCAA……CAGTCC-3'，则对应的另一条链部分序列为5'-GGACTG……TTGCAT-3'，所以选用的一对引物的碱基序列为5'-ATGCAA-3'和5'-GGACTG-3'。 （2）目的基因与质粒形成重组分子要有相同的末端，且目的基因应插入启动子和终止子之间才能在受体细胞中表达。终止子与启动子之间有三种限制酶识别序列：EcoR I、Xma I和BamH I。据图可知，EcoR I会破坏目的基因，故为将目的基因准确插入质粒中，最好选用Xma I和BamH I切割目的基因，用XmaⅠ和BamHⅠ切割后，重组质粒长度为1320-10+760=2070bp，根据质粒和目的基因中EcoRⅠ的酶切位点可知，正向连接后用EcoRⅠ切割，可以得到两个片段分别为200+60+10=270bp，2070-270=1800bp。 （3）质粒上有Kanr基因（卡那霉素抗性基因）和lacZ基因，lacZ表达产物能使菌落呈蓝色，重组质粒中lacZ基因被破坏，含重组质粒的受体菌对卡那霉素有抗性且菌落为白色。所以在基本培养基中需添加卡那霉素和X-gal，添加这些物质的培养基能筛选出含重组质粒的受体菌且能鉴别，即选择和鉴别培养基。 （4）接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，稀释涂布平板法可分离单菌落，便于获取纯菌株。 因为目的基因插入到LacZ基因内部，导致不能产生分解X-gal为蓝色物质的酶，使菌落呈现白色，应选择白色菌落作菌种。 13. （2026四川资阳.一模） 研究人员将海岛棉中抗草铵膦除草剂基因Bar导入陆地棉中，经培养筛选获得抗草铵膦除草剂的棉花。据图回答下列问题： （1）为了便于质粒和Bar基因连接构建基因表达载体，在利用PCR技术扩增Bar基因时需要设计特定的引物，结合图1分析，左边引物要包括哪些碱基序列_____（注明引物的方向）。耐高温的DNA聚合酶从引物的_____端开始连接脱氧核苷酸。与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是_____（答出1点）。 （2）图1质粒中TetR基因的作用是_____；利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，一般选择陆地棉的_____细胞作为受体细胞，最终得到的转基因棉花不具有抗四环素的特性，原因是_____。 （3）为了鉴定转基因棉培育是否成功，可提取转基因棉花的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取到的DNA样品进行检测，在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与_____有关（答出2点）；还可以从个体水平进行鉴定，方法是_____。 13.【答案】（1） ①. 5’-GAATTCATGGGC-3’ ②. 3’ ③. 能避免目的基因和载体自身环化（能避免目的基因与载体反向连接） （2） ①. 作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选（答到标记基因即可） ②. 受精卵或体细胞 ③. 只有T-DNA片段能转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，而TetR基因不在T-DNA片段上 （3） ①. 凝胶浓度、分子构象（电场强度） ②. 用草铵膦处理陆地棉，观察其是否能正常生长 【解析】 （1）扩增Bar基因，需要设计2种引物，分别与模板DNA的两条链的3’端进行配对，根据限制酶位点、转录方向和碱基互补配对原则，左边引物应该与EcoR Ⅰ和Bar基因的下面一条链配对，即左边引物为5’-GAATTCATGGGC-3’。耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是防止目的基因和质粒自身环化，防止目的基因反向接入质粒。 （2）图1质粒中TetR基因的作用是作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。一般利用农杆菌转化法将目的基因导入植物的受精卵或体细胞，随后采用植物组织培养技术将转基因植物细胞培育成转基因植株，由于只有T-DNA片段能转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，而TetR基因不在T-DNA片段上，所以最终获得的转基因棉花不含抗四环素基因，不具有抗四环素的特有。 14．（2026四川达州.一模）我国粳稻栽培面积占水稻栽培面积的90%以上，直链淀粉合成酶合成基因D表达使粳稻直链淀粉相对含量高，米饭的粘性、柔软性和光泽度差。研究发现，若粳稻的D基因沉默不表达，则分支淀粉相对含量大大提高，水稻的糯性明显增大而更受人们喜爱。水稻科研组尝试采用不同方法来培育糯稻。回答下列问题： （1）方法I：让粳稻在问天实验舱内完成水稻全生命周期实验，返回地面后检测发现：粳稻D基因的部分碱基被替换但合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列并未改变，出现此现象的原因可能是__________。这类基因突变并不是非益即害而是中性的，人工选择对这类基因突变_________（填“能”或“不能”）起作用。 （2）方法II：让 D 基因的启动子中部分碱基发生甲基化修饰，获得了糯稻植株甲。将植株甲与纯合野生型粳稻乙杂交，F1均为粳稻，F1自交获得F2。 ①用D基因探针检测发现植株甲无D基因的mRNA，说明D基因甲基化后，___________酶不能与其结合而无法产生相应的mRNA。 ②检测发现F2植株中出现了糯稻植株，解释此现象的原因是 ___________。 （3）方法III：用反义基因技术培育糯稻，其主要流程如下图： ①粳稻D基因控制合成的直链淀粉合成酶的第一个氨基酸是甲硫氨酸（密码子为AUG）。由此可推知，D基因转录时以___________（填“a链”或“b链”）为模板链。 ②用限制酶SmaI和BamHI分别酶切质粒和D基因所在DNA片段，然后构建反义质粒，将反义质粒导入粳稻。检测到转基因植物的分支淀粉含量提高。反义基因技术能提高粳稻糯性机制是：___________转录出的mRNA与粳稻自身所含D基因转录出的mRNA结合成双链RNA，阻止了糯稻中D基因的翻译。 14.【答案】（1） ①. 密码子具有简并性（或碱基序列改变发生在基因D的非编码区，或其他合理答案） ②. 不能 （2） ①. RNA聚合 ②. F2中有部分植株含有两个甲基化的D基因，由于该D基因的表达受到抑制，这部分植株表现为糯性 （3） ①. b链 ②. 反义质粒中 D 基因 【解析】 （1）粳稻D基因的部分碱基被替换但合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列并未改变，出现此现象的原因可能是密码子具有简并性，即转录形成的mRNA上的碱基序列不同，但编码的氨基酸没有发生改变。也可能是碱基序列改变发生在基因D的非编码区，因此合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列并未改变。由于该基因发生了突变，结果是相同的，因此人工选择对这类基因突变不能起作用。 （2）①D基因甲基化后会抑制RNA聚合酶和该基因的启动子结合，从而无法产生相应的mRNA。 ②D基因的启动子中部分碱基发生甲基化修饰，获得了糯稻植株甲，纯合野生型粳稻乙的D基因启动子没有发生甲基化，杂交获得的子一代一个D基因启动子甲基化，另一个没有甲基化，F1自交获得F2，F2中有部分植株含有两个甲基化的D基因，由于该D基因的表达受到抑制，这部分植株表现为糯性。 （3）①转录是从DNA模板链的3'开始的，已知第一个氨基酸是甲硫氨酸（密码子为AUG），因此说明模板链的3'是TAC，对应图示分析，D基因转录时以b链为模板链。 ②结合重组质粒和目的基因分析，反义基因技术能提高便稻糯性机制是反义质粒中D基因转录出的mRNA与粳稻自身所含D基因转录出的mRNA结合成双链RNA，阻止了糯稻中D基因的翻译。 15．（2026四川德阳.一模）衣藻可通过光合作用等代谢途径将CO2转化为多种有机物，可用于处理工业废水、制备生物柴油，但高浓度CO2条件会使衣藻的细胞质酸化从而抑制其增殖。研究人员从烟草中提取了一种能特异性转运H+的载体蛋白基因——PMA基因（4691bp）导入衣藻细胞，以提高其对CO2的耐受度。下图展示了构建转基因衣藻的部分过程示意图。 （注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Bler表示博来霉素抗性基因，氨苄青霉素对细菌有毒性，博来霉素对藻类有毒性）。 分析回答下列问题： （1）先将重组质粒导入大肠杆菌的目的是_________，培养基1和培养基2除了加入必要的营养成分以外，还需要分别加入_________和_________。 （2）获取目的基因时，经常在引物末端引入限制酶识别序列，方便后续的DNA重组。下图所示的DNA分子经PCR扩增后应选用的限制酶为_____________________（选填编号）。 ①EcoRⅠ：5′-GAATTC-3′ ②AftⅡ：5′-CTTAAG-3′ ③XhoI：5′-CTCGAG-3′ ④BamHⅠ：5′-GGATCC-3′ ⑤BglⅡ：5′-AGATCT-3′ ⑥XbaⅠ：5′-TCTAGA-3′ （3）经筛选得到若干目标藻株后，通过电泳对其进行目的基因鉴定，下图为部分实验结果，其中A泳道的样品为野生衣藻都具有的actin基因的扩增产物，则含有目的基因PMA的藻株是_____________________。 （4）衣藻在高氮磷的污水环境中会大量繁殖，但油脂生成能力极弱；衣藻在缺乏氮磷的胁迫环境中生长受抑制，但磷饥饿诱导型启动子SQD2会驱动油脂合成的关键基因DGTT4基因的表达。为了提高衣藻油脂产量，在培养衣藻时应该_________。胁迫会抑制衣藻生长，不利于油脂的持续高效生产。研究发现，红细菌内存在一种远红光诱导型启动子，该启动子只在波长725-735nm的远红光照射下才开启。根据以上信息，利用所学的基因工程知识，为了既能提高油脂产量又不影响治理高氮磷污水，可以进行的操作是___________________________________________________。 15.【答案】（1） ①. 获得大量重组质粒 ②. 氨苄青霉素 ③. 博来霉素 （2）①和⑤ （3）2和3 （4） ①. 先在高氮磷的环境中，再转移到缺乏氮磷的胁迫环境中培养 ②. 将DGTT4基因的磷饥饿诱导型启动子（SQD2）替换为红细菌体内的远红光诱导型启动子，并在适宜时间用远红光照射 【解析】 （1）将重组质粒导入大肠杆菌的目的：获得大量重组质粒（大肠杆菌繁殖快，可作为 “工程菌” 快速扩增重组质粒）。培养基 1 是培养大肠杆菌的，质粒上有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），因此培养基 1 需加入氨苄青霉素（筛选含重组质粒的大肠杆菌）。培养基 2 是培养衣藻的，质粒上有博来霉素抗性基因（Bler），因此培养基 2 需加入博来霉素（筛选含重组质粒的衣藻）。 （2）PCR扩增时从模板链的3'→5'，引物和DNA模板链复制起始端互补配对，因此扩增PMA基因时选择引物2和3，根据引物2的碱基序列可知对应的限制酶为⑤Bgl Ⅱ，根据引物3的碱基序列可知对应的限制酶是①EcoR Ⅰ。 （3）A 泳道的 “actin 基因扩增产物” 是野生型衣藻都有的条带（作为对照）；含目的基因 PMA 的藻株，除了 actin 条带，还会有 PMA 的扩增条带。 藻株 1：只有 actin 条带（无 PMA）； 藻株 2、3：既有 actin 条带，又有 PMA 条带（符合要求）； 因此含目的基因 PMA 的藻株是2 和 3。 （4）①提高衣藻油脂产量的培养策略：衣藻在高氮环境中大量繁殖，在缺氮环境中启动油脂合成；因此需先在高氮磷环境中培养（让衣藻大量繁殖），再转移到缺氮乏磷的胁迫环境中（诱导油脂合成）。 ②既提高油脂产量又不影响高氮磷污水治理的操作：原启动子（SQD2）在缺氮时启动 DGTT4 基因，但缺氮会抑制衣藻生长；而远红光诱导型启动子仅在远红光下启动。因此需将 DGTT4 基因的磷饥饿诱导型启动子（SQD2）替换为衣藻体内的远红光诱导型启动子，在衣藻高氮磷污水中繁殖到一定数量后，用远红光照射启动 DGTT4 基因表达，促进油脂合成。 蛋白质工程 胞的结构 考点2 1． “逆折叠AI模型”依据自然界中已知的大量“序列-结构”对应关系，学习到氨基酸序列与最终三维结构之间复杂的对应关系，使该模型能从目标蛋白质的结构出发，快速生成大量可能折叠成该结构的氨基酸序列，实现了蛋白质工程的自动化和标准化。下列说法正确的是 A. 生成目标氨基酸序列需要肽键的结构、氨基酸的性质与数目为依据 B. 从蛋白质的三维结构到氨基酸序列，AI模型依据的原理是中心法则 C. 氨基酸发生替换后，蛋白质的空间结构和功能可能不会因此而发生改变 D. 该模型预测蛋白质的结构并直接设计改造蛋白质，而不用改造基因 【答案】C 【详解】A、该模型依据“序列-结构”对应关系生成氨基酸序列，而非肽键结构或氨基酸数目。肽键是氨基酸间的基本连接方式，但模型的核心是学习序列与空间构象的关联，A错误； B、从蛋白质的三维结构推测氨基酸序列，AI模型依据的原理是结构与功能相适应的原理，与中心法则无关，B错误； C、氨基酸替换可能发生在非关键位点，若替换后氨基酸性质相似，蛋白质的空间构象和功能可保持不变，C正确； D、蛋白质工程需通过改造基因来实现蛋白质设计，该模型仅提供序列预测，最终仍需基因操作（如定点突变）表达目标蛋白，D错误。 故选C。 2． （2026四川攀枝花.一模）天然人胰岛素易形成聚合体，起效慢。科学家通过将天然人胰岛素的第28位脯氨酸与第29位赖氨酸的位置互换，研发出速效胰岛素类药物。下列说法错误的是 A. 天然人胰岛素基因转录过程中作为模板的是b链 B. 天然人胰岛素基因表达需要mRNA、tRNA及rRNA的参与 C. 天然人胰岛素中第28位氨基酸对应的反密码子为5'-CGG-3' D. 天然人胰岛素的合成分泌需要内质网、线粒体等细胞器参与 【答案】A 【详解】A 、mRNA 的核苷酸序列具有方向性，从 5' 端到 3' 端延伸，起始密码子位于 5' 端一侧的特定位置，是翻译的起始点，因此第28位 5' 端，可判断出天然人胰岛素基因转录过程中作为模板的是 a 链，A错误； B、基因表达包括转录和翻译两个过程，翻译过程需要 mRNA（作为模板）、tRNA（转运氨基酸）及 rRNA（构成核糖体）的参与，胰岛素基因表达也不例外， B正确； C、由图可知天然人胰岛素中第 28位氨基酸是脯氨酸，其密码子为3′−GCC−5′，根据反密码子与密码子碱基互补配对，且方向相反，可知其对应的反密码子为5′−CGG−3′，C 正确； D 、天然人胰岛素（属于分泌蛋白）的合成分泌需要核糖体、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器参与，D正确。 故选A。 3． （2026四川内江.一模） 蛛丝蛋白因强度高和韧性大等优点，在医疗、军事防弹等领域具有较大潜力。研究人员欲将化学合成的优化蛛丝蛋白基因导入亮氨酸营养缺陷型大肠杆菌（自身无法合成亮氨酸，必须从外界环境中获取）中进行发酵生产（流程如下图）。回答下列问题： 注：标记基因为亮氨酸合成酶基因。 （1）在设计化学合成基因时，需剔除天然基因中冗余、低效和不相容的部分，如去除相应限制酶识别序列；需将编码丙氨酸的多种密码子优化成大肠杆菌偏好的CCU和GCC。 ①化学合成蛛丝蛋白基因时，其碱基序列需根据天然蛛丝蛋白中的________序列进行推测。 ②据图分析，化学合成目的基因可能去除了天然蛛丝蛋白基因内部____________限制酶（答出2种）的识别序列。 ③将编码丙氨酸的多种密码子优化成大肠杆菌偏好的密码子的意义是______________。（答出1点） （2）需将导入重组质粒的大肠杆菌接种到______的培养基上进行筛选后，再用于发酵生产。发酵生产过程中，需随时检测大肠杆菌数量、产物浓度，及时添加必要营养成分，且要严格控制_________________ ________________________（答出2点）等发酵条件。 （3）外源蛋白的过早表达会与菌体生长竞争资源，抑制菌体生长繁殖。研究人员可通过对基因表达载体上的___________________________进行设计，来调控蛛丝蛋白基因表达时期，使其与菌体生长阶段分离，以提高蛛丝蛋白产量。 （4）在大规模工业化生产中，与使用抗生素抗性基因相比，选择亮氨酸合成酶基因作为标记基因具有明显优势。试从不同角度分析其优势：______。（答出2点） 3．【答案】（1） ①． 氨基酸 ②． NdeⅠ、XhoⅠ ③． 提高蛛丝蛋白基因在大肠杆菌中的翻译效率（使翻译过程更顺畅，增加蛋白合成量） （2） ①. 不含亮氨酸 ②. 温度、pH和溶解氧 （3）启动子 （4）不使用抗生素，可降低生产成本；可避免抗生素残留；可避免抗生素抗性基因扩散的潜在风险；培养基中不补充亮氨酸，可持续淘汰质粒丢失的菌株，提高生产效率 【解析】 （1）① 基因通过指导蛋白质的合成（翻译）表达性状，因此化学合成蛛丝蛋白基因时，需根据天然蛛丝蛋白的氨基酸序列，通过密码子反向推测基因的碱基序列。 ② 目的基因要插入启动子和终止子之间才能正常表达，故选择质粒上的限制酶（如NdeⅠ、XhoⅠ）用于切割载体、插入目的基因；为避免目的基因内部被这些酶切割，需去除目的基因内部对应的NdeⅠ、XhoⅠ限制酶识别序列。 ③ 不同生物对密码子的使用偏好性不同，将密码子优化为大肠杆菌偏好的类型，可提高蛛丝蛋白基因在大肠杆菌中的翻译效率（使翻译过程更顺畅，增加蛋白合成量）。 （2）① 受体菌是亮氨酸营养缺陷型大肠杆菌，而质粒的标记基因是亮氨酸合成酶基因。因此需接种到不含亮氨酸的培养基上：导入重组质粒的菌能存活，未导入的菌因无法合成亮氨酸而死亡，从而完成筛选。 ② 发酵生产过程中，需随时检测大肠杆菌数量、产物浓度，及时添加必要营养成分。发酵条件需严格控制温度、pH、溶解氧，这些因素会影响大肠杆菌的生长和蛋白合成。 （3）基因表达的启动由启动子调控（启动子是 RNA 聚合酶结合的位点，决定基因何时开始转录）。因此通过设计启动子，可调控蛛丝蛋白基因的表达时期，避免过早表达与菌体生长争夺资源。 （4）与抗生素抗性基因相比，亮氨酸合成酶基因作为标记基因的优势：不使用抗生素，可降低生产成本；可避免抗生素残留；可避免抗生素抗性基因扩散的潜在风险；培养基中不补充亮氨酸，可持续淘汰质粒丢失的菌株，提高生产效率 / 学科网（北京）股份有限公司 $