热点命题12 PCR原理技术与应用(专题微讲Word)-【赢在微点·考前顶层设计】2026年高考生物大二轮专题复习（单选）

该高中生物学高考复习讲义聚焦PCR原理与技术应用热点，涵盖基本PCR条件、引物设计原则、RT-PCR、反向PCR及琼脂糖凝胶电泳等核心考点，按“原理-技术-应用-鉴定”逻辑层次构建知识体系。通过考点梳理、方法指导、真题训练等环节，帮助学生突破非特异条带成因分析、引物设计等难点，体现复习的系统性与针对性。 资料以科学思维培养为核心，创新采用“原理解析-真题案例-实验应用”教学模式，如通过荧光定量PCR探针水解与荧光信号关系分析引导证据推理，结合反向PCR技术流程设计探究活动。设置分层练习配合即时解析，确保学生高效掌握考点，为教师把控复习节奏、提升学生应考能力提供有力支持。

热点命题12　PCR原理技术与应用 1.试题中常用的PCR原理 不同扩增技术的本质和原理都是基本PCR,掌握基本PCR是理解和解答这类问题的前提和基础。 (1)PCR所需条件。 包括模板、原料(4种脱氧核苷酸)、引物(2种)和耐高温的DNA聚合酶。其实质是在体外对目的基因进行大量复制。 (2)PCR引物的设计原则。 ①引物长度要适宜,一般引物的长度为20~30个核苷酸。过长会导致其延伸温度大于72 ℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应;引物过短特异性差,可导致引物与模板链随机结合。 ②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补,以免形成发夹状结构(如图),这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 ③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补,尤其应避免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体(如图所示)。 (3)引物的特异性和修饰。 ①引物的特异性是指针对目标DNA片段设计出来的引物只能扩增出此目标DNA片段,而不能扩增出其他DNA片段。 ②引物的修饰。 ⅰ.引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的,不能进行任何修饰。 ⅱ.引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括:添加酶切位点;引入启动子序列、插入突变序列等。 (4)PCR循环时与引物相关的计算。 经过n次循环,需要的引物总个数是2n+1-2。 1.某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示,除了目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是(D) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 解析　增加模板DNA的量可以提高反应速度,但不能有效减少非特异性条带,A项错误;延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程,但对于延伸中的配对影响不大,故不能有效减少反应非特异性条带,B、C两项错误;非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低造成引物与模板的结合位点增加,故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生,D项正确。 2.(2025·黄冈模拟)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增,设计了引物Ⅰ、Ⅱ,其连接部位如图所示,X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是(D) 解析　在第一次PCR循环结束后,得到以引物Ⅱ延长得到的单链。在以后的PCR循环中,以引物Ⅱ所形成的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA时,引物Ⅱ上的X片段也被作为模板合成子链。因为两条引物间的片段以指数倍数扩增,实验结束得到的绝大部分DNA片段是D,D项正确。 3.(2023·山东卷,T25节选)科研人员构建了可表达J⁃V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。回答下列问题: (1)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 F1和R2(或F2和R1) 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 a链 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (2)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 J⁃V5融合蛋白 ,条带2所检出的蛋白 不是 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 解析　(1)据题图甲可知,引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列,因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择题图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链,而根据题图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应该是3'→5',非模板链(a链)是5'→3';考虑到DNA复制的方向是子链的5'→3',引物延伸的方向也是5'→3',所以引物结合的单链延伸方向是3'→5';题图中F1是前引物,在左侧,所以其配对的单链是3'→5'的b链,故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(2)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图可知,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后,均有条带1,说明细胞内表达了J⁃V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后,出现条带2,而用抗V5抗体检测后,没有出现条带2,说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 4.(2025·大连模拟)研究人员对a基因的mRNA进行逆转录获得cDNA,已知mRNA的序列为5'—UGAACG…(中间序列)…GACUCG—3',再将cDNA与质粒连接。限制酶在质粒中的位置和识别序列如图和表所示,为准确连接质粒和目的基因,应选择 MfeⅠ、HindⅢ (填限制酶名称)对质粒进行酶切。为使cDNA与质粒连接,应用PCR技术在cDNA两端加上限制酶的识别序列,请写出其中一个引物5'端的9个碱基序列:5'— CAATTGTGA或AAGCTTCGA ……。 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ 识别序列和切割位点 ↓ 5'—GGATTC—3' ↓ 5'—GAATTC—3' 限制酶 MfeⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点 ↓ 5'—CAATTG—3' ↓ 5'—AAGCTT—3' 解析　因EcoRⅠ在质粒上有两处酶切位点会切坏质粒,所以排除。为避免单酶切引起的反向连接,所以选择MfeⅠ、HindⅢ酶切。已知mRNA的序列为5'—UGAACG…(中间序列)…GACUCG—3',则cDNA序列为 模板链:3'—ACTTGC…(中间序列)…CTGAGC—5' 非模板链:5'—TGAACG…(中间序列)…GACTCG—3' 为使cDNA与质粒连接,应在其模板链3'端与启动子之间插入MfeⅠ的识别序列,在其模板链5'端与终止子之间插入HindⅢ的识别序列,改造后即为 3'—GTTAACACTTGC…(中间序列)…CTGAGCTTCGAA—5' 5'—CAATTGTGAACG…(中间序列)…GACTCGAAGCTT—3' 因为引物应与模板链的3'端碱基互补配对,所以引物序列为5'—CAATTGTGA……或5'—AAGCTTCGA……。 2.RT⁃PCR技术 (1)过程:逆转录PCR(RT⁃PCR)一般分为两步:先以mRNA为模板,在逆转录酶的催化下合成cDNA的第1条链,再以第1条链为模板做常规PCR,从而获得双链cDNA分子。 (2)应用:逆转录RCR可从mRNA出发获取目的基因,也可以研究基因的表达情况,实时荧光定量RT⁃PCR还可用于病毒定量检测。 5.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量,其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针,当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处时,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成,过程如图所示。下列相关叙述错误的是(D) A.引物与探针均具有特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则 B.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关 C.若用cDNA作模板,上述技术也可检测某基因的转录水平 D.耐高温的DNA聚合酶催化DNA的合成总是从子链的3'端向5'端延伸 解析　引物与探针均具有特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则,A项正确;题干中提出“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针”,并且“每扩增一次,就有一个荧光分子生成”,因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关,B项正确;由于cDNA是以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成的,所以若用cDNA作模板,题述技术也可检测某基因的转录水平,C项正确;由题图可知,耐高温的DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸,D项错误。 3.反向PCR技术 反向PCR技术是根据DNA片段中间的已知序列设计引物,扩增已知序列两侧的未知序列的思路是:先从未知序列的两侧把DNA切成片段,然后通过DNA连接酶将DNA片段环化;再利用已知序列的两端设计引物,只不过引物相对于已知序列是反向配置的,所以子链反向延伸(如图)。PCR反向扩增后,经测序可以确定未知序列。反向PCR可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。 6.(2025·唐山模拟)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)。 请据图回答下列问题: (1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的引物必须是 ②④ (从表格引物①②③④中选择,填序号)。 名称 DNA序列(省略了部分核苷酸序列) 已知序列 引物 ①5'—AACTATGCGCTCATGA—3' ②5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3' ③5'—AGAGGCTACGCATTGC—3' ④5'—TCATGAGCGCATAGTT—3' (2)对产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 B (填选项字母)。 A.5'—AACTATGCG……AGCCCTT—3' B.5'—AATTCCATG……CTGAATT—3' C.5'—GCAATGCGT……TCGGGAA—3' D.5'—TTGATACGC……CGAGTAC—3' 解析　由于已知序列的外侧是未知序列(如题图中待扩增的未知序列),因此无法设计引物。若要分析出已知序列两侧的未知序列,设计引物是关键,可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环,即用限制酶切割DNA,用DNA连接酶将其连接成环,即图中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。第二步是反向扩增,即根据已知序列设计一对引物,以环状DNA两条链为模板,从已知序列向未知序列方向进行反向扩增,利用Taq DNA聚合酶无法将DNA连接成环的特点,得到链状DNA,即图中Ⅲ扩增过程。(1)采用反向PCR扩增未知序列,又因子链的延伸方向从5'→3',可根据已知序列3'—AGTACTCGCGTATCAA—5'和3'—CGTTACGCATCGGAGA—5',设计对应PCR引物是5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'和5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3',故选②④。(2)对产物测序,得到片段F的完整序列,因为片段F是被限制酶EcoR Ⅰ剪切的两端,所以5'端应该是AATTC,对应F片段的开头,故选B。 4.PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳 (1)DNA电泳鉴定中的“两液两剂”。 两液:电泳缓冲液与凝胶载样缓冲液。电泳缓冲液能维持整个电泳体系的pH稳定,提供导电介质;凝胶载样缓冲液可影响物质的电泳迁移速率,主要用于样品的稀释和保护,同时通过指示剂指示样品在凝胶中的位置。 两剂:核酸染料与指示剂。核酸染料是用来染色DNA或RNA分子的一种化学物质,以便在紫外灯下观察和检测核酸条带,最常用的核酸染料是溴化乙锭。最常用的指示剂是溴酚蓝,它在电泳凝胶中的迁移速度与DNA或RNA分子的迁移速度相近。在电泳过程中,溴酚蓝通常位于样品的前沿,形成一个明显的蓝色条带,这有助于实验者判断电泳是否完成,以及何时停止电泳。 (2)DNA迁移速率的影响因素。 ①凝胶浓度:凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高,孔隙越小,DNA迁移受到的阻力越大,速率越慢。 ②DNA分子的大小:DNA的分子量越大,迁移速率越慢。 ③DNA分子的构象:三种构象的质粒在琼脂糖凝胶电泳的前后顺序为环形超螺旋(DNA两条链都是完整的质粒)>线形>开环(DNA双链断了一条成为松弛的环)。 7.(2024·黑吉辽卷,T7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(A) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 解析　琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的,以提供更好的分辨率和分离效果,A项正确;凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度,当指示剂前沿接近凝胶边缘时,则停止电泳,它不能指示DNA分子的具体位置,B项错误;DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越长,迁移速率越慢,DNA迁移方向为从负极向正极,C项错误;琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后,可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D项错误。 8.(2025·重庆模拟)党的二十大报告提出“种业振兴行动”。水稻是重要的粮食作物,培育转基因水稻,对创制高产优质新品种意义重大。为检测转基因水稻中的抗除草剂基因d是否会扩散到其他物种导致基因污染,令该转基因水稻与杂草A、B一起种植。取各种植物细胞的DNA经酶切、PCR后进行电泳,结果如图所示,下列有关说法错误的是(B) 注:A1、B1为对应植株的子一代。 A.由图可知,转基因水稻中的抗除草剂基因d通过基因交流转移到了杂草B1中 B.电泳时,点样孔位于乙侧,电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关 C.抗除草剂基因有可能通过花粉传播进入杂草,从而产生“超级杂草” D.为避免培育过程中的基因污染,可将外源α⁃淀粉酶基因与目的基因一起转入水稻中 解析　结合题图可知,杂草A和B中不含有基因d,而B1细胞中出现基因d,所以基因d通过基因交流转移到了杂草B1中,A项正确;小型的DNA移动速度要比大型DNA快,因此在电泳图上,小型的DNA距离电泳点样孔最远,因此点样孔位于甲侧,B项错误;抗除草剂基因有可能通过花粉传播进入杂草,使杂草成为用除草剂除不掉的“超级杂草”,C项正确;将α⁃淀粉酶基因与抗除草剂基因导入细胞核的同一DNA分子后,含有抗除草剂基因的花粉会同时含有α⁃淀粉酶基因,该类型的花粉会失去活性,从而避免基因污染,D项正确。 学科网（北京）股份有限公司 $