第3章 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建-【金版新学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程同步课堂高效讲义配套课件PPT（人教版，多选）

该高中生物学课件聚焦基因工程中目的基因的筛选与获取（含PCR技术）及基因表达载体的构建，通过任务驱动导入，先回顾基因工程四步骤，再分任务细化，结合思维导图搭建知识支架，衔接前后知识点。 其亮点是通过微思考、情境化探究导思（如PCR引物设计分析）和对比归纳（如PCR与体内DNA复制表格），培养科学思维与探究实践能力，配套高考真题测评，助力学生深化理解，教师可提升教学效率。

第2节　基因工程的基本操作程序 第1课时　目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建 　 第3章 基因工程 学习目标 1.简述PCR的原理、条件及过程。　 2.简述基因表达载体的组成及构建过程。 任务一　目的基因的筛选与获取 1 任务二　基因表达载体的构建 2 课时测评 5 课堂小结 3 内容索引 课堂评价 4 目的基因的筛选与获取 任务一 返回 1.基因工程的四个步骤 (1)目的基因的___________。 (2)_____________的构建。 (3)将目的基因导入受体细胞。 (4)目的基因的检测与鉴定。 新知导学 筛选与获取 基因表达载体 3.获取目的基因的方法 PCR 基因文库 2.筛选合适的目的基因 性状 表达产物 编码蛋白质 已知结构和功能清晰 4.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据________________的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 (2)PCR反应的条件：一定的缓冲液、DNA模板、2种_______、4种脱氧核苷酸、___________DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。 DNA半保留复制 引物 耐高温的 微提醒 　　DNA复制时，DNA聚合酶不能从DNA模板链的一端直接开始合成子链，而是需要从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，形成DNA子链。因此进行PCR扩增的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列来合成引物。 (3)PCR扩增的过程 (4)PCR产物的鉴定：常采用________________来鉴定。 琼脂糖凝胶电泳 90 50 72 单链 引物 DNA 聚合酶 微思考 　　(源于教材P77“相关信息”)PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋的原因是____________________________________________________________ ________________________。 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋ 1.从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。 ( ) 2.Taq DNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。 ( ) 3.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则。 ( ) 4.PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚。 ( ) 5.DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。 ( ) 自我诊断 × √ × × √ 活动1　深入理解PCR扩增技术 情境：图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题： (1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。 探究导思 提示：不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 (2)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？ 提示：第3轮；1/4。 (3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 提示：根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 (4)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。 提示：第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ'自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。 (5)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 提示：要在两种引物的5'端分别添加上限制酶的识别序列。 (6)如果循环n次，则共需消耗多少对引物？ 提示：共需消耗2n－1对引物。 归纳总结 1.聚合酶链式反应(PCR) (1)PCR反应的过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 归纳总结 ①变性：当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 归纳总结 ③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 归纳总结 (2)PCR反应的结果 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，耐高温的DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数式扩增。 归纳总结 2.生物体内DNA复制与PCR反应的比较 比较项目 体内DNA复制 PCR反应 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段 归纳总结 比较项目 体内DNA复制 PCR反应 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的3'端开始延伸，都是连续合成 过程 归纳总结 比较项目 体内DNA复制 PCR反应 循环次数 受生物体自身控制 30多次 产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段 相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的2种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则 针对练1.(2025·山东临沂高二期末)下列关于PCR技术的叙述，错误的是 A.PCR技术的原理是DNA半保留复制 B.该反应体系缓冲液中一般要添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶 C.引物应选用图中的A、D D.引物是一小段DNA或RNA，用于PCR的引物长度通常为30～40个核苷酸 √ PCR技术的原理是DNA半保留复制，A正确；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此缓冲液中一般要添加Mg2＋，B正确；引物应选用图中的A、D，才能将目的基因片段扩增出来，C正确；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，D错误。 特别提醒 　PCR过程的四点提醒 (1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3'端，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 (3)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。 (4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。　　 针对练2.(2024·河北沧州高二期末)引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法不正确的有 A.PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA B.若引物的C—G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高 C.在PCR的退火步骤，两种引物分别结合在模板链的3'端和5'端 D.若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引物分子 √ PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，体内的DNA复制引物通常是RNA，PCR引物一般是单链DNA，A正确；G与C之间有3个氢键，稳定性高，若引物的C—G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高，B正确；在PCR的退火步骤，两种引物都结合在模板链的3'端，C错误；若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，得到10×210个＝10 240个DNA分子，共10 240×2＝20 480条链，由于初始的20条链不需要引物，故至少需要20 480－20＝20 460个引物分子，D正确。 知识拓展 引　物 (1)引物的本质：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段。 (2)引物的长度：用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。 (3)一个PCR反应所需引物的种类：2种。DNA的两条链是反向平行的，2种引物要分别与两条模板链结合。 (4)设计引物：设计的两种引物之间的碱基序列不能互补配对。 返回 基因表达载体的构建 任务二 返回 新知导学 稳定存在 表达 上 RNA 聚合酶 下 同种 末端 DNA连接酶 微提醒 1.启动子是转录的起始信号，而非转录的起始位点；终止子是转录的终止信号，而非转录的终止位点。 2.构建基因表达载体时，可以用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段；也可以用能产生相同末端的不同限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段。 微思考 (源于教材P80图3-6)观察基因表达载体构建模式图，写出结构①和②的名称：①_______，②_______；物质A和B的名称：A._______，B._______ _____。 启动子 终止子 限制酶 DNA连 接酶 1.一个完整的基因表达载体由目的基因、标记基因、起始密码子、终止密码子和复制原点等组成。 ( ) 2.启动子位于目的基因的上游，是转录的起始位点，是一段有特殊序列结构的DNA片段。 ( ) 3.构建基因表达载体时，必须使用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段。 ( ) 4.基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取。 ( ) 5.基因表达载体含有启动子和终止密码子。 ( ) 6.标记基因不一定是抗生素抗性基因。 ( ) 自我诊断 × × × × × √ 探究导思 活动2　深度分析基因表达载体的构建 情境：目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 分析回答下列问题： (1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为____________________。 限制酶和DNA连接酶 (2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因是______________________________________________________。 (3)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA，但会导致____ ___________________________________________等问题，为避免以上问题出现，应使用__________________________________两种限制酶。 (4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上________，其是__________ ____识别和结合的部位。 SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因 目的 基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接 BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ) 启动子 RNA聚合 酶 归纳总结 基因表达载体构建时有关限制酶的选择 1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 归纳总结 2.根据质粒的特点确定限制酶的种类 针对练3.(2025·黑龙江双鸭山期末)如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是 A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 B.基因表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C.图示过程是基因工程的核心步骤 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 √ 卡那霉素抗性基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，A正确；构建基因表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B错误；图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，C正确；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。 规律方法 1.“单酶切法”和“双酶分别切割法”均能成功构建基因表达载体。 2.与“单酶切法”相比，“双酶分别切割法”不要求载体和目的基因两侧具有同一种限制酶的识别序列，只要两种限制酶切割后形成的黏性末端是互补(相同)的即可，具有一定程度的灵活性。 3.“单酶切法”和“双酶分别切割法”都不能避免载体和目的基因的自身环化，也都不能避免载体与目的基因的反向连接。 针对练4.(2024·浙江金华高三期末)东南 景天中的HMA3基因能编码Cd(镉)转运 蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸 收进体内，现欲将东南景天中的HMA3 基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集 能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是 A.欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得 B.用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带 C.构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列 D.用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞 √ 欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或含Ti质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误。 规律方法 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 返回 课堂小结 返回 思维导图 要语必背 返回 1.培育转基因抗虫棉需要4个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2.苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 3.PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 4.一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。 课堂评价 返回 1.(2025·漯河四高高二期末)下列关于PCR的叙述，错误的是 A.PCR只能扩增引物之间的DNA片段而非整个完整的模板DNA分子 B.PCR过程中变性的目的是让引物与模板DNA单链结合 C.PCR的原理是DNA半保留复制 D.PCR的过程需要耐高温的DNA聚合酶但不需要解旋酶 变性的目的是通过升高温度，破坏氢键，打开模板DNA分子，为子链的延伸提供模板，B错误。 √ 2.(2025·全国课后作业)在基因表达载体的构建中，下列说法正确的是 ①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、起始密码子、终止子和标记基因 ②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA ③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止 ④所有基因表达载体的构建是完全相同的 ⑤必须在细胞外进行 A.②③⑤　 B.①④　 C.①②⑤　 D.③④ √ 基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等，起始密码子位于mRNA上，①错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，使转录在所需要的地方停止，③正确；由于受体细胞有植物细胞、动物细胞以及微生物细胞之分，目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因工程的操作环境是在生物体外，因此基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤正确。综上所述，②③⑤正确，A符合题意。 3.(2024·广东茂名高三期末)在细菌和病毒类疾病检测、遗传疾病诊断、肿瘤筛查和诊断中，都可采用PCR技术。PCR反应由变性→复性→延伸三个基本反应步骤构成，PCR完成以后常需要鉴定PCR的产物。下列叙述正确的是 A.变性：耐高温的DNA聚合酶将双链DNA解链为单链 B.复性：两种引物与两条单链DNA结合不必控制温度 C.延伸：4种脱氧核苷酸加到引物的5'端 D.鉴定：DNA聚合酶质量不好可能导致鉴定结果不仅有一条带 √ 变性过程中DNA双链解开是温度作用的结果，不是耐高温的DNA聚合酶的作用，A错误；两种引物与两条单链DNA结合需要适宜的温度，B错误；DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸的，4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，C错误；DNA聚合酶质量不好可能导致实验失败，出现不仅一条带，D正确。 4.(2025·吉林通化高二阶段考)科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是 A.为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因 B.构建基因表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达 C.启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位，可以驱动遗传信息的转录 D.基因表达载体中的标记基因可以用来鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞 √ 启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，C错误。 5．(多选)(2024·江苏苏州高二期 末)某科研小组利用质粒(图甲)和 目的基因(图乙)构建重组DNA。 下列分析正确的是 A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割 质粒，可得到2条DNA片段 B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因 C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长 √ √ √ 限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上 各有一个切割位点，用HindⅢ 和PstⅠ切割质粒，可得到2条 DNA片段，A正确；AluⅠ的切 割位点位于目的基因内部，用 AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；不宜选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，因为质粒中的两个标记基因均会被破坏，且DNA会反向连接至载体上，C错误；构建重组DNA时，选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 6.(创新情境)(2025·湖北黄冈中学调研)基因工程自20世纪70年代兴起后，得到了飞速的发展。到2015年，我国仅转基因抗虫棉就已经育成100多个品种。请回答下列相关问题： (1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的____________________的基因中进行筛选。 目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的已知结构且功能清晰的基因中去筛选，这种方法较为高效，从而能顺利获得所需要的基因。 已知结构和功能清晰 PCR技术的原理是DNA的半保留复制和碱基互补配对原则；复性的作用是使引物结合到模板链上，便于子链的延伸。 (2)目的基因可以人工合成、从基因文库中获取，还可以利用PCR技术获取和扩增。图1展示了PCR技术获取和扩增目的基因的原理。 ①PCR技术利用了DNA半保留复制原理和______________原则。PCR的一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，复性的作用是________________ _______。 碱基互补配对 使引物结合到模 板链上 ②将一个DNA分子进行扩增，理论上目的基因最早在第___次循环后获得；第5次循环后，可扩增得到目的基因____个。 3 22 以原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物1或引物2，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有。以图示来分析PCR产物： 据图分析可知，理论上目的基因最早在第3次循环后获得。第5次循环后，可扩增得到目的基因25－2×5＝22个。 (3)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如图2所示。其中链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。 ①EcoRⅠ酶切后得到的—AATT称为黏性末端，“黏性”的含义是__________________________ ________________。 两个末端互补的碱基之间可以自发形成氢键 EcoRⅠ酶切后得到的—AATT称为黏性末端，“黏性”的含义是两个末端互补的碱基之间可以自发形成氢键。 ②不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增的原因是_________ ____________________________。 DNA 两端序列未知，无法设计引物 由于DNA分子两端的脱氧核苷酸序列未知，故无法设计引物，所以不能直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增。 ③图2中环状DNA进行PCR的过程中，子链沿引物A延伸的方向是_______ (填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物_______(填“含有”或“不含”) EcoRⅠ的酶切位点。 逆时针 含有 返回 图2中环状DNA进行PCR的过程中，子链 沿引物A逆时针延伸，沿引物a顺时针延伸， 才能扩增得到未知序列。由于碱基互补配对， 环化后的DNA分子含有EcoRⅠ的切割位点，则 PCR产物也含有EcoRⅠ的酶切位点。 课时测评 返回 知识点一　目的基因的筛选与获取 1.(2025·渭南市尚德中学高二期中)下列不属于获取目的基因的方法是 A.从基因文库中提取 B.利用PCR技术合成 C.利用DNA转录合成 D.利用化学方法人工合成 √ 可以从基因组文库中获取目的基因，A正确；可以利用PCR技术扩增目的基因，B正确；利用DNA转录合成的是RNA，不是基因，C错误；可以利用化学方法人工合成目的基因，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2.(2025·北京市十一中学测试)用PCR扩增下面的DNA片段： 5'-GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG-3' 3'-CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC-5' 供选择的引物有： ①5'-GACCTGTGGAAGC-3' ②5'-CATACGGGATTG-3' ③5'-GTATGCCCTAAC-3' ④5'-CAATCCCGTATG-3'共四种，应选择 A.①② B.②③ C.③④ D.①④ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，耐高温的DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端至3'端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5'端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5'端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5'端的碱基序列是5'-GACCTGTGGAAGC和5'-CAATCCCGTATG，故对应的引物为①5'-GACCTGTGG AAGC-3'和④5'-CAATCCCGTATG-3'，D正确，A、B、C错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 3.(2025·广东卷)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的 A.1'-碱基 B.2'-氢 C.3'-羟基 D.5'-磷酸基团 √ 已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5'端→3'端，原因是脱氧核苷酸的3'-碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5'-碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5'-碳的磷酸基团，C正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 4.(2025·泉州市泉港区第一中学高二期末)下面关于聚合酶链式反应(PCR)的叙述正确的是 A.PCR过程中只需要两个引物分子 B.PCR的循环过程分为变性、复性和延伸三步 C.PCR扩增仪需保持在37 ℃以维持Taq DNA聚合酶最佳活性 D.PCR过程中边解旋边复制 √ PCR过程中需要两种引物，引物的数目需要根据扩增的次数确定，A错误；PCR的循环过程分为高温变性(DNA双链打开)、复性(模板链与引物结合)和延伸(合成子链)三步，B正确；变性阶段，PCR扩增仪的温度会达到90 ℃以上，C错误；PCR过程中，在变性阶段打开双链，延伸阶段合成子链，故先解旋再复制，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 知识点二　基因表达载体的构建 5.(2025·辽宁本溪高二期中)如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列有关叙述正确的是 注：AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。 A.可选择的限制酶组合是酶E和酶G B.所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因 C.用含氨苄青霉素的培养基就能筛选出含重组质粒的受体菌 D.同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到3个条带 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 酶E会破坏两种标记基因，为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A错误；重组质粒上的四环素抗性基因被破坏，而重组质粒上的氨苄青霉素抗性基因能表达，用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入普通质粒的受体菌，C错误；据图可知，因酶E有两个酶切位点，同时用三种限制酶处理图中质粒，能将质粒切割成4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 6.(2024·北京期中)为更有效地处理含 重金属的废水，研究人员将植物的金 属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建基 因工程菌。由于PCR扩增出的目的基 因末端为平末端，且无合适的限制酶 识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是 A.不直接选择载体P构建表达载体是因为它不含起始密码子和终止密码子 B.将目的基因插入载体P时，应选择SmaⅠ进行酶切，再用DNA连接酶连接 C.构建载体P和载体E时使用的DNA连接酶均需选用T4 DNA连接酶 D.构建表达载体时，应选择XhoⅠ和PstⅠ酶切载体E和含目的基因的载体P √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 由图可知，不直接选择载体Р构建表达 载体是因为它不含启动子与终止子，A 错误。由于载体E只有产生黏性末端的 酶切位点，要使中间载体Р接入载体E， 同时防止载体E自身环化，需要用两种 限制酶分别切割载体E和中间载体P。据图可知，中间载体Р和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ的识别序列，故可选用XhoⅠ和PstⅠ进行酶切，载体Р的这两种酶的识别位点之间含有EcoRⅤ的识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaⅠ虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ的识别位点之间，故不能选择其对中间载体Р进行切割，B错误，D正确。两种DNA连接酶均可以连接黏性末端和平末端，但E.coli DNA连接酶连接平末端效率较低，构建载体E时是连接黏性末端，两种都可以用，C错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 7.(2024·安徽徽州高三开学考试)为实现高效降解厨余垃圾中纤维素的目的，科研人员将纤维素内切葡聚糖前基因导入酵母中，获得能高效表达EGⅢ基因的基因工程菌，下图示中BamHⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ为限制酶。下列叙述错误的是 A.构建重组质粒需用到BamHⅠ、SalⅠ和DNA连接酶 B.筛选目的菌时，所用的培养基中应含有氨苄青霉素 C.培育该基因工程菌与培育三倍体无子西瓜所运用的原理相同 D.质粒中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 据图可知，EcoRⅠ会破坏目的基因，因此构建重组质粒需用到BamHⅠ、SalⅠ，然后用DNA连接酶进行拼接，A正确；SalⅠ会破坏卡那霉素抗性基因，筛选目的菌时，所用培养基中应含有氨苄青霉素，B正确；培育该基因工程菌运用的原理是基因重组，培育三倍体无子西瓜所运用的原理是染色体数目变异，C错误；质粒中的启动子是一段特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 8.(2025·浙江期中)CD20蛋白是B淋巴细胞表面特异性抗原，可作为治疗B细胞淋巴瘤的靶点。为实时追踪CD20蛋白的合成与运输过程，将绿色荧光蛋白(GFP)基因与CD20基因首尾拼接(如图)，使其表达为一条连续的多肽链。该拼接过程中需去除的关键序列是 A.CD20基因中编码起始密码子的序列 B.CD20基因中编码终止密码子的序列 C.GFP基因中编码起始密码子的序列 D.GFP基因中编码终止密码子的序列 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 为实时监控CD20蛋白的合成和运输过程，则拼接在一起的绿色荧光蛋白(GFP)基因与CD20基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽链，因此拼接在一起的CD20基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则绿色荧光蛋白(GFP)基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成绿色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD20基因中编码终止密码子的序列，B正确，A、C、D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 9.(2024·山西太原高三期末)下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是 A.①过程所需的原料是核糖核苷酸 B.②过程所需的酶必须耐高温 C.③过程需要解旋酶破坏氢键 D.④过程的引物碱基对之间不能互补配对 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 ①为逆转录，所需原料是脱氧核苷酸，A错误；②过程由DNA单链合成DNA双链，所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；③过程为变性，温度上升到超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链，不需要解旋酶破坏氢键，C错误；④过程为复性，温度降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，但引物碱基对之间不能互补配对，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 10.(2024·江苏南通高二期中)下列关于PCR过程及结果的叙述，错误的是 A.相比细胞内DNA复制，PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等 B.复性的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关 C.若酶和引物都正常，但是未出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底 D.理论上推测，经n轮循环后的产物中只含1种引物的DNA片段占比为1/(2n－1) √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 PCR与细胞内DNA复制破坏氢键的原理不同，其中PCR通过高温破坏氢键，PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等，A正确；复性的温度设定与引物有关，当其中G—C碱基对多时，温度较高，而延伸时间的设定与扩增片段的长度有关，长度越大，则时间越长，B正确；PCR扩增的过程包括变性—复性—延伸，其中变性是在高温条件下将DNA双链解开，作为模板，若是酶和引物都正常工作，但是不出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底，C正确；DNA进行半保留复制，每次复制都需要两种引物结合在DNA的两端，经过n轮循环产物共2n个DNA分子，仅含有其中一种引物的DNA片段为2个，故理论上推测，经过n轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占比例为2/2n＝1/2n－1，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 11.(2025·北京海淀二模)为合成出局部为双链的RNA用于沉默特定基因，先将目的基因X从重组质粒pHIBS切割出来，再巧妙地连接到质粒载体pUAST中，如下图，其中质粒只展示了局部。 下列叙述正确的是 A.该操作过程中还需要DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 B.利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与pUAST连接 C.基因X的DNA片段需要完整保留启动子和终止子区域 D.可以用E和Bg，或者Xh和K双酶切重组pUAST √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 基因工程中，切割目的基因和载体 需要限制酶，连接二者需要DNA连 接酶；耐高温的DNA聚合酶用于 PCR技术，而本题操作是切割和连 接，无需PCR，A错误。B和Bg均 产生—GATC—的黏性末端(同尾酶)，可互补连接。S 和Xh为另一对同尾酶，均产生—TCGA—的黏性末端，切割后也能连接，利用B和Bg、S和Xh黏性末端相同，实现基因X与载体pUAST反向连接，B正确。启动子是驱动基因表达的调控序列，终止子使转录在所需要的地方停下来，应存在于载体pUAST中，而非目的基因片段中，C错误。重组质粒pUAST-基因X中，已不存在限制酶Bg和Xh的酶切位点，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 12．(多选)(2025·内蒙古赤峰测试)如 图是利用基因工程技术生产疫苗的部 分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、 ApaⅠ为四种限制酶，且它们切割DNA 分子形成的末端均不同。下列有关说法 正确的是 A．图示中构建基因表达载体时无法用限制酶SmaⅠ B．利用PCR扩增抗原基因是利用基因工程技术生产疫苗的核心工作 C．限制酶切割DNA分子时，氢键断裂，结果是形成两条DNA单链 D．卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 √ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 从图中可以看出，限制酶SmaⅠ的切 割位点位于抗原基因内部，如果用限 制酶SmaⅠ会破坏抗原基因，无法获 得完整的目的基因，也就不能构建正 确的基因表达载体，A正确。基因工 程的核心工作是基因表达载体的构建，而不是利用PCR扩增抗原基因。PCR技术主要用于扩增目的基因，以获得大量的目的基因片段，B错误。限制酶切割DNA分子时，作用于磷酸二酯键，将DNA分子切割 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 成不同的片段，而不是使氢键断裂形 成两条DNA单链，C错误。卡那霉素 抗性基因是一种标记基因，在基因工 程中，标记基因的作用是便于筛选含 有重组质粒的受体细胞。当将重组质 粒导入受体细胞后，可以在含有卡那霉素的培养基上培养细胞，含有卡那霉素抗性基因(即含有重组质粒)的细胞能存活，从而将含有抗原基因的细胞筛选出来，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 13．(多选)(2025·山东烟台高三模拟) 限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识 别序列及其切割位点分别如下： —C↓AATTG—和—G↓AATTC—， 如图表示某目的基因片段与质粒拼接 形成重组质粒过程，下列叙述正确的是 A．用限制酶EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶MunⅠ切割质粒 B．构建重组质粒时，会形成不止一种脱氧核苷酸序列(最多考虑DNA片段两两连接) C．将重组质粒同时用以上2种限制酶切割则会再形成1种长度的 DNA 片段 D．标记基因一般是抗生素基因或荧光标记基因，便于目的基因的筛选 √ √ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 由图可知，目的基因两侧都是限制 酶EcoRⅠ的切割位点，因此应选用 限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的 外源DNA分子，质粒中含有限制酶 MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位点， 但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒，A正确；DNA拼接且最多考虑DNA片段两两连接时，可能形成不同的核苷酸序列，目的基因与目的基因同方向拼接和不同方向拼接， 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 质粒与质粒同方向拼接和不同方向 拼接两种，质粒与目的基因同方向 拼接和不同方向拼接，B正确；限 制酶MunⅠ切割质粒后与目的基因 连接形成重组质粒，连接处形成 —CAATTC—和—GAATTG—的新序列，都不能被2种限制酶识别、切割，但EcoRⅠ能识别标记基因的相应序列并切割， 使环状重组质粒断裂形成1种长度的DNA片段，C正确；标记基因一般是抗生素抗性基因或荧光标记基因，便于目的基因的筛选，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 14.(10分)(2025·浙江杭州高二月考)下面几幅图与基因工程有关。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题： (1)获得图2中目的基因的方法除PCR技术外，还有_____________________ ________。 从基因文库中获取、人 工合成 获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5'到3'，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。 (2)采用PCR扩增目的基因的原理是_________________，图2中A、B、C、D 4种单链DNA片段中，有_______两种引物(DNA复制方向由5'→3')。 DNA半保留复制 B、C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (3)图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述错误的是______(填下列字母，不定项)。 a.该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成 b.该片段含A—T碱基对比较多，故其结构比较稳定 c.若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开 d.若该目的基因复制6次，则需要碱基A的数量是252个 bcd　 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，a正确；其结构中G—C碱基对越多，分子结构越稳定，b错误；PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，c错误；由图3可知，目的基因碱基A有2个，复制6次需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，d错误。故选b、c、d。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (4)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生_______________________现象，从图2切割下目的基因需要消耗___个水分子。不选用限制酶PstⅠ和HindⅢ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是____________________________ __________________。 目的基因与载体反向连接 4 会破坏所有的标记基因，不利于重组DNA的筛选 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因与载体反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图可知，不选用限制酶PstⅠ和HindⅢ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏所有的标记基因，不利于重组DNA的筛选。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 15.(14分)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ 4种限制性内切核酸酶识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题： (1)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，其产物长度为_______________ _______。 537 bp、790 bp、 661 bp 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 SmaⅠ的识别序列和酶切位点是CCC↓GGG，可知其切割产生的末端是平末端，产物长度是534＋3＝537 bp、796－3－3＝790 bp、658＋3＝661 bp。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (2)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子分离出图1对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有____种不同DNA片段。为了提高实验成功率，需要通过_______技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝，该技术原理为________________。 2 PCR DNA半保留复制 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，则基因D就突变为基因d，且基因d只有一个SmaⅠ的酶切位点，因而基因d会被SmaⅠ切割形成两个片段(长度分别为1 327 bp、661 bp)。为了提高实验成功率，可以通过PCR技术大量扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝，该技术模拟了体内DNA复制的过程，原理为DNA半保留复制。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (3)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含质粒的大肠杆菌，一般需要用添加__________的培养基进行培养，想进一步筛选出含重组质粒的受体细胞，还需要接种到含_________的培养基中培养。 BamHⅠ 抗生素B 抗生素A 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 由图可知，目的基因D两侧及质粒中都有限制酶BamHⅠ的识别序列，因此应选用限制酶BamHⅠ切割图1中含有目的基因D的外源DNA分子和图2中的质粒。用BamHⅠ切割质粒后会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，因此一般需要用添加抗生素B的培养基进行培养；若想进一步筛选出含重组质粒的受体细胞，还需要接种到含抗生素A的培养基中培养筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (4)假设用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，能否再次用BamHⅠ________(填“可以”“不可以”或“不一定”)，原因是___ _____________________________________________________。 不一定 为目的基因和抗生素B抗性基因拼接处不一定出现GGATCC 因 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 假设用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，再次用BamHⅠ不一定能将其切割，因为目的基因和抗生素B抗性基因的黏性末端随意连接，拼接处不一定出现GGATCC。 返回 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 谢 谢 观 看 第3章 基因工程 $