第3章 微专题 PCR技术相关问题-【金版新学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程同步课堂高效讲义配套课件PPT（人教版，不定项）

该高中生物学课件聚焦基因工程中的PCR技术，涵盖扩增计算、循环规律、实时荧光RT-PCR及定点突变等核心内容，通过从基础数量关系到实际检测应用的知识脉络，搭建学习支架帮助学生逐步深入理解。 其亮点在于运用表格对比、流程图解等科学思维方法，结合病毒检测、蓝白斑筛选等探究实践案例，强化结构与功能观。例题解析与技术应用结合，既提升学生分析解决问题能力，也为教师提供系统教学资源，提高教学效率。

微专题　PCR技术相关问题 　 第3章 基因工程 一、PCR技术的相关计算 1.PCR扩增过程中的循环图示与规律 2.PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n (2025·河北石家庄统考)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是 A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针 B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增 C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒 D.病毒的检测还可以检测病毒引发产生的抗体，其原理是抗原—抗体杂交 √ 典例 1 PCR需要根据cDNA的核苷酸序列合成引物，同时RT-PCR还需要探针与待测样本DNA混合，故需要根据cDNA的核苷酸序列合成探针，A正确。PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确。若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。RNA病毒的检测方法有：①RNA检测，即检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒具有抗原性的结构蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体，后两种方法的原理是抗原—抗体杂交，D正确。 二、PCR定点突变技术——重叠延伸PCR 1.图解 2.四种引物 引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 3.流程 (1)分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起。 (2)再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。 (3)用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 (4)通过测序可以检验定点突变是否成功。 (2025·山东淄博模拟)定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题： 典例 2 (1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要____个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的_____(填“①”或“②”)。 2 ② 由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到的DNA有一个不含突变位点，另一个DNA有一条链含有突变位点，进行第二轮循环，即可得到DNA有两个不含突变位点、一个含一个突变位点和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物，所以至少需要经过2个循环才能获得相应的大引物模板；在PCR2中，由于DNA聚合酶只能从子链的3'端连接单个脱氧核苷酸，因此从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。 (2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________________________________ ______。为将改良基因构建在质粒上，还需要__________________等酶。 SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接 BglⅡ、DNA连接酶　 根据SmaⅠ的酶切位点，如果选择SmaⅠ，则获得的是平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接；从各种限制酶的酶切位点分析，除使用XmaⅠ外，还需使用BglⅡ切出相应黏性末端与改良基因CTAG一侧进行连接，同时需要用DNA连接酶构建基因表达载体。 (3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述组件的溶液加入大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是________________________________________________________ _________________________________________。 X-gal　 构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解X-gal产生蓝色物质，菌落为白色 因LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶能分解X-gal产生蓝色物质，如果没有分解，则菌落为白色，因此可以将菌液涂布在含氨苄青霉素和X-gal的平板上，由于重组质粒的LacZ基因在重组过程中被切断，不能编码相应的酶分解X-gal，呈现白色，因此白色菌落含有重组质粒。 微专题专练　PCR技术相关问题 返回 1.(2025·厦门高三质检)如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是 A.②链从L到R的方向为3'→5'，①②链均可作为子链合成的模板 B.PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③ D.物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5'→3'，A错误；PCR过程是通过高温将双链DNA之间的氢键断开，并且是全部解旋之后才进行复制，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23＝8，需消耗7个引物③，C错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2.(2025·重庆高三质检)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是 A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列 B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量 C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致 D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物是与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 3.(2025·广东佛山高三期中)PCR扩增仪的温度、时间和循环次数等参数设定不当会影响到基因的扩增结果。下图是PCR扩增目的基因时的参数设定，图中线上、线下分别为温度和时间设定。下列叙述错误的是 A.步骤2的温度及时间设定主要依据目的基因的G、C含量 B.步骤3的温度及时间设定主要依据引物的长度及G、C含量 C.步骤4延伸时间的设定主要依据目的基因的碱基数目 D.步骤5除设定循环次数(25次)外，还应将“GOTO”设定为步骤3 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 步骤2是变性过程，是在高温条件下使DNA分子解旋的过程，由于G和C之间有3个氢键，热稳定性高，故步骤2的温度及时间设定主要依据目的基因的G、C含量，A正确；步骤3是复性过程，一般情况下，引物的长度越长，G和C比例越高，则复性步骤中的复性温度设定就越高，B正确；步骤4是延伸过程，时长的设置依据目的基因的长度，即主要依据目的基因的碱基数目，C正确；“GOTO”是设置返回的步骤序号，参数应设置为步骤2，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 4.反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述不正确的是 A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割 B.过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键 C.过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶和解旋酶 D.该技术可检测T—DNA整合到植物染色体DNA的位置 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 过程③即PCR扩增，PCR技术中双链DNA解聚为单链是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 5.IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，如图所示。下列说法错误的是 A.PCR1中使用的引物有引物A、引物C B.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b链 C.PCR1过程需要扩增3轮才能获得目标产物 D.PCR2过程中，为减少错误DNA片段的产生 可适当升高复性温度 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，在基因的左侧需要用限制酶HindⅢ来切割，在基因的右侧用限制酶SacⅠ切割，因此在PCR1中结合到基因右端的引物选择引物C，从题图中看，另一个引物应含有突变碱基C，所以选择引物A，A正确；在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，应含有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5'端到3'端的序列中开始部位应含有SacⅠ识别的序列，从图中看，它是大引物的b链， B正确； 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 PCR1过程主要是为了获得大引物，则扩增2轮即可获得目标产物，C错误；由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目的基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高温度，便于引物与模板链的结合，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 √ 6.(2025·安顺高三调研)荧光定量PCR技术可定量 检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理是 在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条 模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶 催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测 系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是 A.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段 B.耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键 C.最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关 D.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 Ct值越小，说明所需循环的次数越少，被检测样本中病毒数目越多，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 7.(2025·辽宁本溪模拟)图1表示的是细胞内DNA复制的过程，图2表示图1中RNA引物去除并修复的过程，下列叙述错误的是 A.DNA体内复制和PCR过程所需的引物不同，且PCR反应引物不需要去除 B.细胞内核酸形成过程中都存在A—U碱基对 C.酶3为DNA聚合酶，其在“被修复链”上的移动方向是5'端→3'端，DNA聚合酶还能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 D.酶4能催化磷酸二酯键的形成，PCR反应也需要酶4的参与 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 结合题意可知，DNA体内复制需要的引物 是短单链RNA，PCR过程所需的引物为短 单链DNA，因此PCR过程的引物不需要去 除，A正确；细胞中DNA复制过程中存在 A—U碱基对，逆转录过程、转录、RNA复 制也都存在A—U碱基对，B正确；酶3为DNA聚合酶，在“被修复链”上的移动方向是5'端→3'端，DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C正确；酶4是DNA连接酶，DNA连接酶能催化磷酸二酯键的形成，PCR过程不需要酶4的参与，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 8.(2025·高三5月考试生物试题)研究人员用琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定时，出现了“拖尾”现象，即产物在凝胶上呈弥散状态，条带模糊不清。已知蛋白质会阻碍分子在琼脂糖凝胶中的迁移，对其产生拖拽作用。下列对出现“拖尾”现象原因的分析，不合理的是 A.提取基因组时蛋白质等杂质过多 B.目标存在多种变异，PCR模板不纯 C.复性温度太低，引物与模板出现错配 D.配制琼脂糖溶液时没有添加核酸染料 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 已知蛋白质会阻碍DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移，对其产生拖拽作用，若提取基因组DNA时蛋白质等杂质过多，会使DNA在凝胶上呈弥散状态，出现“拖尾”现象，A不符合题意；若目标DNA存在多种变异，PCR模板不纯，会出现过多的非特异性扩增产物，导致出现“拖尾”现象，B不符合题意；若PCR的复性温度太低，引物与模板出现错配，也会出现过多的非特异性扩增产物，导致出现“拖尾”现象，C不符合题意；若配制琼脂糖溶液时没有添加核酸染料，会导致观察不到条带，D符合题意。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 9.实时荧光定量RT-PCR技术需要在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，荧光染料能特异性掺入DNA双链中，从而发出荧光信号。在流感流行季节，对怀疑流感病毒感染的患者，可以通过实时荧光定量RT-PCR技术进行核酸检测。下列相关叙述不正确的是 A.图中的探针可能是利用荧光分子标记的流感病毒独特的基因序列 B.核酸检测是通过检测荧光信号来确定样本中是否有病毒核酸的 C.PCR技术利用了DNA半保留复制的原理，需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶的催化 D.用荧光RT-PCR技术测定病毒的核酸具有特异性 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 PCR技术利用了DNA半保留复制的原理，不需要解旋酶，可通过高温使DNA双链解开，但需要耐高温的DNA聚合酶的催化，C错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 10.(2025·广东茂名调研)PCR又称聚合酶链式反应，在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基因。下列有关PCR的叙述错误的是 A.以DNA半保留复制为原理，反应需要在缓冲液中进行 B.耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 C.反应过程中的每一轮循环依次包括变性、复性、延伸三步 D.常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 √ 耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，B错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 11．(2025·河北唐山质检)如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T-DNA，要想对T-DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是 A．用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序 B．用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序 C．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序 D．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 直接选用引物①④组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误；用引物②和引物③可实现对已知的T-DNA序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D错误；用DNA连接酶连接成环状后，用引物①④PCR扩增后测序，恰好可扩增出T-DNA两侧的未知序列，C正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 12．(不定项)(2023·浙江6月选考，改编)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。     2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 下列叙述正确的是 A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，无法更好地区分杂合子和纯合子 √ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知，两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′端→3′端，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3-GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 13．(不定项)(2025·山东临沂高三测试)重叠延伸 PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR 产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通 过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科 研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的 特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突 变，原理如图。下列说法正确的是 A．过程②需要含Mg2+的缓冲液、DNA模板、 引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等 B．若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、 引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子 C．经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因 D．过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物 注：引物凸起处代表与模板链不能互补的突变位点。 √ √ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 过程②为PCR反应，需要在添加了Mg2+的缓冲 液中才能进行，需要提供DNA模板、分别与两 条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和耐高温 的DNA聚合酶等，A正确；两个反应系统中各自 形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成 两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物 1和引物4的DNA属于同一种DNA，故总共形成 3种DNA分子，B错误；过程④获得的杂交DNA 有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端 为单链的杂交DNA为所需DNA，C正确；过程⑤ 是延伸过程，该过程使用耐高温的DNA聚合酶进 行催化，不需要引物，D正确。 注：引物凸起处代表与模板链不能互补的突变位点。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 14.(10分)(2025·广东七校联考)H18L是宫颈癌病毒(一种DNA病毒)特有的蛋白。科研人员利用转基因技术在植物细胞中表达H18L用于研究。研究发现，不同植物翻译时会有偏好的密码子，若提高H18L基因中编码受体细胞偏好的密码子对应的碱基序列比例，将大幅度提高翻译效率。为实现上述目的，需要对H18L基因序列进行改造。原理如图所示。 步骤一： 步骤二： 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 回答下列问题： (1)步骤一：将预期的碱基序列设计在 PCR的引物中，制备出PCR“体系1” 和“体系2”，分别进行PCR扩增。 ①补全下表中的两个PCR体系的成分。 成分 PCR体系1 PCR体系2 模板 ______________  引物 a和b c和d 酶 _________________________________________  其他成分 四种脱氧核苷酸、缓冲液等 H18L基因 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 PCR反应体系由引物、4种dNTP、Taq DNA聚合酶、模板DNA和缓冲液组成。扩增的是H18L基因，模板是H18L基因。酶是耐高温的DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 ②PCR扩增时，引物b、c与体系中加入的模板__________(填“完全结合”或“部分结合”)。 部分结合 PCR反应体系由引物、4种dNTP、Taq DNA聚合酶、模板DNA和缓冲液组成。依据图中信息，与原模板相比，引物b、c替换了部分碱基，与模板无法完全结合，只能部分结合。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (2)步骤二：将体系1、2的产物(即图中的ef和gh)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到50 ℃左右时，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有___种结合的可能，其中能进行进一步延伸的有___种。 4 1 成分 PCR体系1 PCR体系2 模板 ____________  引物 a和b c和d 酶 _______________________________________________________  其他成分 四种脱氧核苷酸、缓冲液等 H18L基因 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 假定原本H18L基因中替换前的控制一个氨基酸的碱基对ACT//TGA，然后中间碱基对C//G被替换为A//T，设计引物b时该位置序列为TTA，设计引物c时该位置序列为AAT，反应体系1以引物a和引物b得到的产物有两种情况，即这三个碱基为ACT//TGA和这三个碱基为AAT//TTA；反应体系2以引物c和引物d得到的产物有两种情况，即这三个碱基为ACT//TGA和这三个碱基为AAT//TTA。 成分 PCR体系1 PCR体系2 模板 ____________  引物 a和b c和d 酶 __________________________________  其他成分 四种脱氧核苷酸、缓冲液等 H18L基因 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 将体系1、2的产物(即图中的ef和gh)混合后，继续进行下一次PCR反应，在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到50 ℃左右时，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有4种结合的可能(①这三个碱基为ACT的e与这三个碱基为TGA的h相互结合； ②这三个碱基为AAT的e与这三个碱基为TTA的h相互结合；③这三个碱基为TGA的f与这三个碱基为ACT的g相互结合；④这三个碱基为TTA的f与这三个碱基为AAT的g相互结合)。其中能进行进一步延伸的只有引物a与引物d结合的类型。 成分 PCR体系1 PCR体系2 模板 ____________  引物 a和b c和d 酶 __________________________________  其他成分 四种脱氧核苷酸、缓冲液等 H18L基因 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 步骤二的最终产物即为优化后的H18L基因序列，其包含了两个限制酶的识别序列，故其长度为500＋30＋400＋6＋6＝942 bp。该DNA两端分别含有BamHⅠ和XhoⅠ的识别序列，因此可用BamHⅠ和XhoⅠ处理该序列和载体，构建表达载体。 (3)步骤二的最终产物即为优化后的H18L基因序列，其长度为_____bp。用______________(填限制酶名称)处理该序列和载体，构建表达载体。 942 BamHⅠ和XhoⅠ　 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 在DNA片段两侧引入限制酶的切割位点、替换DNA序列中的部分碱基对、扩增目的基因 (4)上述实验中，利用引物实现了哪些实验目的？请写出两条：__________ ________________________________________________________________________。 据题图分析可知，该实验中，利用引物实现了在DNA片段两侧引入限制酶的切割位点、替换DNA序列中的部分碱基对、扩增目的基因等实验目的。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 15.(11分)(2025·北京顺义区检测)基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。下图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图，图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。请回答下列问题： 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入__________________________________________；图甲所示的基因定点突变技术需要____次PCR；获得产物A需要的引物是_______________。 Taq DNA聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等 3 引物1和引物3 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入Taq DNA聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等。从图甲可以看到，从加入引物到获得基因M1总共经历了3次PCR。与产物A的两端互补的引物是引物1和引物3。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (2)研究人员对PCR的中间产物A、B进行纯化后，利用图中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度为________，基因M1的长度为________。 项目 基因M A B 长度 3.24、2.8、0.15、0.13 2.8、0.09 3.24、0.05 0.23 kb 6.09 kb 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 基因M上有3个酶切位点(箭头处)，完全酶切产生4个片段，分别为3.24 kb、2.8 kb、0.15 kb、0.13 kb，共6.32 kb，A片段酶切后产生2个片段，分别为2.8 kb、0.09 kb，B片段酶切后产生2个片段，分别为3.24 kb、0.05 kb，图中A片段和B片段的“……”是相同的，因此“……”处为0.05 kb，则基因M1的长度为2.8＋0.05＋3.24＝6.09 kb，因此基因敲除片段的长度为6.32－6.09＝0.23 kb。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (3)通过图甲过程获得的基因M1仍需要大量扩增，此时选择的引物是_____ __________，为了与图乙中的Ti质粒相连，还需要分别在它们的_____端引入限制酶______________________________________的识别序列。 引物　 1和引物2 5'　 HindⅢ、PstⅠ(顺序应与前面的引物对应) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 获得基因M1后，与M1两条链两端互补的引物是引物1和引物2。由于质粒上有三个酶切位点，切割后会出现不同的黏性末端，而基因M1两端没有能与黏性末端互补的序列，故需要分别在基因两条链的5'端引入限制酶的识别序列，根据基因M1插入质粒的位置可知，添加的是限制酶HindⅢ、PstⅠ的识别序列。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 谢 谢 观 看 第3章 基因工程 $