备课素材：引物的特点及应用-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

引物的特点及应用 先看一道试题： （2024.潍坊三模）镉(Cd)作为一种重金属元素，会严重威胁人体健康。科研人员将Cd 响应启动子CadR 与绿色荧光蛋白基因(EGFP)组合在一起导入大肠杆菌，构建能够检测环境中Cd 污染的生物传感器。已知LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解 X-gal 产生蓝 色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。相关信息如图所示，其中 P1 、P2 、P3 表 示引物。 (1)构建重组质粒的过程中需要用到 E.coliDNA 连接酶，该酶的作用是        。据图分析，应选用        酶切割质粒，以保证质粒与目的基因高效重组。 (2)已知 EGFP 基因转录得到的 RNA 中缺乏起始密码子 AUG。利用 PCR 技术获取 EGFP 基因时，为保证 EGFP 基因能正确插入载体且可以正常表达，除选择引物 P1 外，还需要选择引物        ,并在其 5'端增加碱基序列 5'               3'。 (3)通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的 DNA 片段区分开来，该技术所依据的原理是       。对 PCR 产物进行电泳检测，结果显示除 EGFP 基因条带外，还有多条非特异性条带(引  物和模板不完全配对导致)。为减少非特异性条带的产生，可适当        (填“提高”或“ 降  低”)PCR 中复性过程的温度。 (4)为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将转化后的大肠杆菌接种到含有四环素和 X-gal 的培养基上，结果发现长出了蓝色和白色两种菌落。若需进一步鉴定该生物传感 器是否制备成功，需要进行的操作是       。 【参考答案】 (1)将具有互补黏性末端的DNA 片段连接起来    Mun I 和Xhol I (2)P2      GAATTCATG(3)不同 DNA 分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同     提高 (4)选取白色菌落，接种到含Cd 的培养基上，观察是否有绿色荧光出现 题例涉及到引物的用途之一即通过在其5’端插入特异的核苷酸序列实现在目的基因两端插入特定核苷酸序列的目的。 1、什么是引物？ 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。是PCR的必需组分和基因工程常用的分子工具。凡DNA复制必需一段引物，因为DNA复制所需的DNA聚合酶只能在有引物的3’－OH上聚合核苷酸来延伸DNA链。在新链的延伸过程中，只有新添加的碱基与模板链形成双螺旋才能继续链的延伸，否则延伸终止，启动切除修复机制，直至添加正确的碱基，也即是在DNA聚合酶的上游位置一定要互补形成双链（可以是RNA－DNA）才能继续下游DNA的合成，这是它的忠实性和高保真系统决定的。（参考：百度搜索。 DNA的自然复制所需引物一般为RNA单链，而PCR过程提供的引物一般为DNA单链。体内DNA复制引物为RNA，体外PCR引物却为DNA，系由RNA的特性决定即RNA比DNA容易降解或被切除。体内DNA复制以RNA为引物，一方面有利于复制起始位点纠错（注：复制起始容易出错）；二是有利于复制结束后的引物切除。体外PCR以DNA为引物，一方面避免引物分解，另一方面也省却对扩增后目的基因引物的切除环节。 2、引物有哪些特征？ （1）具有特异性。可理解为：引物是一段单链核酸，具有特定的碱基序列且能与目标DNA模板碱基序列互补。在PCR过程中，增强引物的特异性是必须的，具体技术要领为：适当延长引物的长度；适当增加C—G碱基对的比值（将目的基因两侧富含C—G碱基对区作为引物设计区）。 （2）具有启动性。可理解为：DNA（基因）的复制起始于引物的延伸，没有引物和模板的结合，DNA聚合酶就不能发挥作用。 （3）具有数量的成对性和结合位置的对称性。可理解为：每一个DNA（基因）的PCR同时需要两个引物，一个为前向引物，结合在DNA分子的一端，另一个为反向引物，结合在DNA分子的另一端（注：前向、反向相对而言）。 （4）具有方向性。可理解为：引物只能从5’向3’端延伸。 3、引物及PCR有哪些应用？ 3.1 基因定位 （1）原理：引物具有和DNA模板碱基互补配对的特异性。从理论上讲，只要特异的引物能扩增出相应的DNA，说明未知对象必然存在对应的特异性基因。 （2）应用方向：在基因工程的最初环节，用于从供体基因组中筛取目的基因；基因工程的最后环节用于目的基因是否整合到受体基因组的检测；免疫学中用于病原体的检测（实时荧光PCR等）。 （3）引物设计要领：先获知目的基因两侧的部分核苷酸序列，据此设计出该基因的特异性引物。引物的核苷酸序列天然存在。 3.2 基因扩增 以引物的启动性为原理，增加特定基因的数量。基因的确定性决定了引物核苷酸序列的确定性，对引物一般不用创新设计。 3.3 基因改造 （1）原理：引物具有从5’向3’端延伸的方向性，在保持引物3’端与模板互补配对的前提下，可以围绕5’端对其改造借以改造目的基因。 （2）诱导目的基因定点突变（见下图） 观察上图可知，诱导基因定点突变，引物被设计为三类：第一类是常规引物（图中引物A和引物D），第二类是诱变引物（图中引物B和引物C），第三类是大引物（图中引物E和F）。相较于普通PCR，技术的创新之处在于：a.设计了诱变引物；b.常规引物分散到不同体系使用且和诱变引物组合使用；c.大引物既是前两轮PCR的产物，又是PCR3的引物；d.PCR先后进行三个大轮次即PCR1、PCR2、PCR3，前两大轮次和普通的PCR无异，第三大轮次被称之为重叠PCR，在重叠PCR中两种大引物互为模板和引物。 （3）将两个目的基因融合（见下图） 观察上图可知，引物P1和P2用于扩增A片段，引物P4和和P3用于扩增B片段。和常规PCR不同，引物P2和P3可称为融合引物：引物P2插入B片段的一部分，引物P3插入A片段的一部分，且引物P2和P3可以碱基互补配对。类似诱导目的基因定点突变，不妨将诱导两个目的基因融合的PCR划分三个大轮次：前两大轮次分别获得改造后的A片段和B片段，第三大轮次让改造后的A片段和B片段互为模板和引物进行重叠PCR收获A、B片段的融合基因。 （4）在目的基因两端插入特定的核苷酸序列 插入的该特定核苷酸序列一般为某种限制酶识别的序列，意在经酶切后和载体能够正确拼接。技术要领是：直接的改造对象为引物，而且对引物的5’端改造；改造确保不破坏编码链的遗传信息即不能改变mRNA中的遗传密码。（参考笔者2024年5月29日发表的《基于基因表达载体构建的引物设计》） 结语： 引物的应用取决于引物的类型。当引物为自然状态时，引物和PCR用于基因定位（获取目的基因、检测目的基因等）；当引物改变了个别碱基时，引物和PCR用于诱导基因定点突变；当引物互有不同基因且互补的碱基序列时，引物和PCR用于基因的融合；当引物5’端插入特定碱基序列时，引物和PCR用于在目的基因两侧插入限制酶识别的序列。两个碱基互补配对的DNA单链，若出现某条链3’端短于同一端另一条链5’端时，就可以将3’端较短的那条链视为引物，不排除文章讨论内容之外的其他应用。 学科网（北京）股份有限公司 $