第3章 第1节 重组 DNA 技术的基本工具-【成才之路·学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程同步新课程学习指导(人教版)

093 第3章基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 课标要求 学科核心素养 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物1.生命观念：运用结构与功能观，分析基因工程中 化学和分子生物学等学科基础上发展而 三种基本工具各自的作用。 来的。 2.科学思维：运用归纳与概括，分析基因工程中载 2.闻明DNA重组技术的实现需要利用限制 体需要具备的条件。 性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基 3.科学探究：依据DNA的理化性质，分析DNA的 本工具。 粗提取与鉴定的原理。 必备知识自主梳理 9基因工程的概念和工具酶 1.基因工程的概念 (1)操作场所： (2)操作技术： 等技术。 (3)操作结果：赋予生物新的 ,从而创造出更符合人们需要的新的 和生物 产品。 (4)操作水平： 水平。 2.基因工程的工具酶 (1)限制性内切核酸酶（简称限制酶）一“分子手术刀” ①来源：主要来自 ②功能：能够识别双链DNA分子的特定 ,并且使每一条链中特定部位的 断开。 ③结果：产生 或 ④应用：已知EcoR I和SmaI限制酶识别的碱基序列和酶切位点分别为GAATTC和 CCCGGG,如图为两种限制酶切割DNA后产生的末端，写出末端的种类。 5 EcoR 中轴线 中轴线 094 EcoR I限制酶和SmaI限制酶识别的 不同，切割位点 （填“相同”或“不 同”)，说明限制酶具有 0 了教材隐性知识 (选择性必修3P“图3-3”)限制酶 (填“能”或“不能”)切开RNA分子的磷酸二酯 键。限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，消耗 分子水。 〉微思考 推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？原核生物中的限制酶会切割自己的DNA分 子吗？为什么？ (2)DNA连接酶—“分子缝合针” ①作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的 ②种类 项目 E.coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 二者都能连接 ,但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的 特点 DNA片段的效率要远远低于T4DNA连接酶 》微思考 DNA连接酶和DNA聚合酶的作用有什么不同？ 合基因进入受体细胞的载体一“分子运输车” 1.种类：质粒、 、动植物病毒等。 2.常用载体一质粒 (1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具 有 能力的环状双链DNA分子。 (2)质粒适于作基因运载体的特点 ①质粒DNA分子上有一个至多个 位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。 ②携带外源DNA片段的质粒进人受体细胞后，能在细胞中 ,或 随 同步复制。 ③人工改造的质粒常有特殊的 ,便于 095 (3)作用 ①作为运输工具，将外源基因导入 ②质粒携带 在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体 DNA同步复制。 》微思考 细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？ 自DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理 (1) 不溶于酒精，但某些 溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋 白质。 (2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于 的NaCl溶液。 (3)在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现蓝色。 2.实验步骤 (1)研磨：称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL ,充分研磨。 (2)去杂：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取 ,也可以直接将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，在1500/min的转速下离心5min, 再取 放入烧杯中。 (3)提取：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3in,溶液 中出现的白色丝状物就是粗提取的 方法一：用玻璃棒沿 （填“一个”或“两个”)方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上 面的水分。 方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000/min的转速下离心5min,弃上清液，将管底的 (粗提取的DNA)晾干。 (4)鉴定 项目 A B 2mol/L的NaCl溶液5mL 丝状物或沉淀物 不加 加入 试剂4mL 加热5min 现象 无色 096 〉自我检测 1.基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种。 ( 2.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。 3.限制酶和解旋酶的作用部位相同。 ( 4.E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远高于T4DNA连接酶。 5.作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。 ( 6.重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。 ( 7.研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。 8.DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。 ( 合作探究能力提升 任务一：探究基因工程的原理和工具酶 ●情境解读 图形情境：有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SI进行切割，B片段分别用限 制酶HindⅢ、XbaI、EcoR V和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位，点如图。 Spe I HindⅢ Xba I EcoR V Xho I 5-ACTAGT-3 5'-AAGCTT-3'5-TCTAGA-35-GATATC-3 5'-CTCGAG-3 3'-TGATCA-5'3'-TTCGAA-5'3'-AGATCT-5'3'-CTATAG-5'3'-GAGCTC-5' ●合作探究 1.基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？ 2.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ 3.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ ●097 4.请写出限制酶SpeI、HindⅢ、XbaI和XhoI切割形成的黏性末端。 5.同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 6.哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SeI切割A片段产生的DNA片段相连接？ 为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？ 7.DNA连接酶的识别有无特异性？能否催化连接不同限制酶切割形成的黏性末端？ ○典例剖析 例 如图所示的三个DNA片段依次表示EcoR I、BamH I和Sau3AI三种限制酶的识别序列与切 割位点。下列有关叙述错误的是 () 5'-GAATTC-3'5-GGATCC-3'5-GATC-3 3'-CTTAAG-53'-CCTAGG-5'3'-CTAG-5 A.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 B.这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端 C.BamH I和Sau3AI切割DNA片段形成的末端不能彼此连接 D.图中的DNA片段被EcoR I切割后，会增加两个游离的磷酸基团 〉变式训练 1.DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是 A.DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子 B.DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列 C.DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成 D.T4DNA连接酶能连接具有黏性末端的DNA片段和具有平末端的DNA片段 098 ●归纳提升 1.与DNA分子相关的四种酶的比较 比较项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 识别特定核苷酸序 将双链DNA片段 将单个脱氧核苷酸 列，使特定部位的磷 将DNA两条链之 作用特点 “缝合”起来，恢复 添加到脱氧核苷酸 酸二酯键断开，切割 间的氢键打开 磷酸二酯键 链上 目的基因及载体 形成黏性末端或平 形成新的DNA分 形成单链DNA分 作用结果 形成重组DNA分子 末端 子 子 应用 基因工程 DNA复制 2.同尾酶 (1)概念：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同 尾酶。 (2)应用：同尾酶使构建载体时切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割 载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有 目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基 因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 任务二：探究载体需具备的条件和载体的选择 ●情境解读 图形情境：如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图思考： 拟核 目的基因 DNA 插入位点 氨苄青霉素 0 抗性基因 b 复制原点 质粒 大肠杆菌细胞 ●合作探究 1.将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？ e099 2.要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？ 3.载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？ 4.我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么 条件？ 5.质粒作为基因工程中的“分子运输车”，通常含有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 请举例说明标记基因的筛选原理是什么？ 6.根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是 导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。 100 7,若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为 载体，其原因是什么？ ●典例剖析 例某一质粒载体如图甲所示，加p表示氨苄青霉素抗性基因，1表示四环素抗性基因。有人将 此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行 连接反应，用得到的混合物直接转化后，得到多种大肠杆菌，并利用培养基乙和丙筛选出导入 重组质粒的大肠杆菌。下列叙述错误的是 () 影印接种 Tet 培养基乙 含四环素的培养基丙 BamH】注：影印接种指用灭菌后的“印章”在培养基中轻按一下，将培养基 图甲 乙中菌落按相同位置接种到培养基丙。 A.图甲所示的质粒中还应含有复制原点以便在受体细胞中复制 B.将经处理后的大肠杆菌菌液接种至培养基乙使用的是稀释涂布平板法 C.配制培养基乙时应加入氨苄青霉素 D.培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌 》】变式训练 2.作为基因的运输工具—载体，必须具备的条件之一及理由是 A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因 B.具有多个限制酶切割位点，以便目的基因的表达 C.具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合 D.对宿主细胞无伤害，以便重组DNA分子的鉴定和选择 ●归纳提升 1.质粒作为载体所具备的条件及原因 条件 原因 稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 有一个至多个限制酶切割位点 供外源DNA片段（基因）插入其中 具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选 无毒害作用 避免受体细胞受到损伤 101 2.标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生 素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细 胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体或 空质粒的受体细胞。如图所示： 进入受体细胞 在含有氨苄青霉素的培养基上培养 Amp' 含有氨苄青霉素 ⊙ 只有含有载体，并且载体上的基因 抗性基因的质粒 大肠杆菌中有的有载体进 表达的大肠杆菌才能存活并增殖 入，有的没有载体进人 任务三：探究DNA的粗提取与鉴定 ●情境解读 实验情境：学习教材P4-P5页“探究·实践”，完成下列问题。 ●合作探究 1.新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等都可作为实验材料提取DNA,能否利用廉价易得的猪血作为 实验材料？ 2.实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 3.上清液中加入预冷的酒精溶液有何作用？为什么要求玻璃棒沿着一个方向搅拌？ 102 4.该实验进行了几次静置或离心，目的是什么？DNA是在上清液中还是在沉淀中？ ●典例剖析 例 下表关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的表述，不正确的是 选项 试剂 操作 作用 A 研磨液 与生物材料混合 提取溶解DNA B 2mol/L NaCl溶液 与提取出的DNA混合 溶解DNA C 预冷的酒精溶液 加入离心后的上清液中 溶解DNA D 二苯胺试剂 加入溶解有DNA的NaCl溶液中 鉴定DNA 》变式训练 3.(2023·广东选择性考试)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。 下列叙述错误的是 () A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 ●归纳提升 1.DNA的粗提取与鉴定实验关键步骤分析 方法步骤 加入物质 目的 研磨洋葱 研磨液 释放DNA 粗提取DNA 预冷的酒精溶液（体积分数为95%） 有利于DNA析出 2mol/L的NaCl溶液 溶解DNA 鉴定DNA DNA遇二苯胺（沸水浴）变蓝色，可 二苯胺试剂 鉴定DNA 2.实验中进行了两次静置或离心，目的是将DNA和杂质分子分开。第1次操作后，DNA存在于上 清液中；第2次操作后DNA存在于析出的白色丝状物或离心管沉淀中。比值高时促进生根，比值低时促进生芽，A正确：培养基含大 量水分，需用高压蒸汽灭菌法灭菌(100kPa、121℃，15~20 分钟)；干热灭菌法适用于耐高温且干燥的物品（如玻璃器 皿)，不能用于培养基灭菌，B错误：芽原基细胞是分生组织的 一部分，全能性高，可作为外植体，C错误：细胞产物的工厂化 生产正是通过植物组织培养技术实现的，如大量培养红豆杉 细胞，从培养液中提取紫杉醇。因此，紫杉醇可通过此方法获 取，植物组织培养的优势（如快速增殖、大量生产细胞产物）》 在此体现，D错误。 2.B流程①中，消毒效果不仅取决于消毒剂浓度，还取决于消 毒时间和消毒剂种类，A错误；流程②不需要经过脱分化形成 愈伤组织的阶段，直接经腋芽分化为丛生苗，B正确；与流程 ②相比，流程③培养基中细胞分裂素类与生长素类物质的比 值小，C错误：与流程③相比，提高流程④培养基的BA浓度 有利于丛生苗的生根，D错误。 3.B从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后转入培养液直接 培养的细胞为原代细胞，A错误：将特定基因或特定蛋白（特 定的转录因子如Oct4、Sox2、If4和c-Myc)导人已分化的T 细胞，可将其诱导形成PS细胞，B正确：融合细胞有具有同种 核的融合细胞和杂交瘤细胞，需筛选才能获得分泌特定抗体 的杂交瘤细胞，C错误：囊胚细胞已开始分化，D错误 4.C由于MⅡ期卵母细胞的细胞更大，便于进行技术操作，细 胞质中含有激发细胞核全能性的物质，因此体细胞核移植到 去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚，A正确；细胞核来自于已 分化的体细胞，全能性容易受到影响，因此移植前胚胎发育率 低，可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态， B正确：胚胎移植到代孕母鼠后成活率低，可能是早期胚胎未 能成功在代孕母鼠子宫内着床，胚胎从透明带中伸展出来称 为孵化，C错误；胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易， 因此为提高胚胎成活率，可用胚胎细胞核移植代替体细胞核 移植，D正确。 5.C步骤①给小鼠注射L-6后，应从小鼠的脾中获取B淋巴 细胞，A错误：步骤②需要在组织中加入胰蛋白酶或胶原蛋白 酶，使其成为单个细胞，进而制成单细胞悬液，B错误；步骤③ 是诱导细胞融合过程，该过程可加人灭活病毒或PEG诱导 细胞融合的过程体现了细胞膜的流动性，C正确：步骤④是在 选择培养基上筛选得到的杂交瘤细胞，该过程得到的杂交瘤 细胞不一定能产生所需抗体，步骤⑤经过克隆化培养和抗体 检测筛选出了能分泌特定抗体的杂交瘤细胞，D错误。 6.B从题表中看出，黄酮产量随着细胞干重增加而增加，所以 黄酮产量与细胞干重呈正相关，A正确；黄酮属于次生代谢产 物，并非细胞生存和生长所必需的，B错误；氧气参与有氧呼 吸，为细胞生长、分裂和代谢提供能量，所以氧气供给对于水 母雪莲细胞生长、分裂和代谢是必需的，C正确：75r/min时相 对生长速率、细胞干重和黄酮产量均最高，所以转速为75r/mi 时既利于细胞分裂，又利于黄酮的积累，D正确。 7.D动物细胞培养时，为增大细胞与培养液的接触面积，需要 制备细胞悬液，A正确；置于5%C02等适宜条件下培养，其中 5%的CO,可维持培养液的pH,B正确：在成纤维细胞传代培 养过程中需要通过离心收集细胞，C正确；不用胰蛋白酶消化 支架，避免将上皮细胞片层分离成单独细胞，D错误。 2 第3章基因工程 第1节重组DNA技术的基本工具 必备知识自主梳理 一、1.(1)生物体外(2)转基因(3)遗传特性生物类型 (4)DNA分子 2.（1)①原核生物②核苷酸序列磷酸二酯键③黏性末 端平末端④黏性末端平末端碱基序列不同专 一性 教材隐性知识 不能222 微思考 提示：限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞 的外源DNA,以保证自身安全。不会切割自己的DNA分子。 因为它自身的DNA分子可能不具备这种酶的识别序列或者 自身DNA分子相关序列被甲基化修饰，不被识别。 (2)①磷酸二酯键②大肠杆菌T4噬菌体黏性末端和平 末端 微思考 提示：DNA连接酶连接的是DNA片段，而DNA聚合酶连接的 是单个的脱氧核苷酸。 二、1.噬菌体 2.(1)自我复制(2)①限制酶切割②进行自我复制整 合到受体DNA上受体DNA③标记基因重组DNA分 子的筛选(3)①受体细胞②外源DNA片段 微思考 提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白 质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA),也可能是 生物，如动植物病毒、噬菌体等。(2)功能不同：细胞膜上的载 体是协助细胞膜控制物质进出细胞：基因工程中的载体是一 种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。 三、1.(1)DNA蛋白质(2)2mo/L(3)二苯胺 2.(1)研磨液(2)上清液上清液(3)DNA一个沉 淀物(4)二苯胺沸水中蓝色 自我检测 1.V 2.×DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶 切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 3.×限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二 酯键，解旋酶作用于氢键。 4.×E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率 远远低于T4DNA连接酶。 5.×作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选的标 记基因。 6.×重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶和DNA连接 酶，载体不是工具酶。 7.×研磨之后，通过过滤或离心，DNA保留在上清液中。 8.×在沸水浴加热的条件下，DNA与二苯胺试剂会呈现蓝色。 7 合作探究能力提升 任务一 合作探究 1.提示：有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一生物 细胞内进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间 进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 2.提示：①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。②双链 DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。③DNA分子 都遵循碱基互补配对原则。 3.提示：①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息 的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。 4.提示： -A -A Spe I: -TGATC Hind M:TTCGA -T -C Xba I: -AGATC Xho I:_GAGCT 5.提示：同种限制酶切割产生的黏性末端相同；不同的限制酶切 割可能会产生相同的黏性末端。 6.提示：限制酶XbaI;因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏 性末端。不能再被所用的限制酶识别：因为所用的两种限制酶 均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。 7.提示：DNA连接酶的识别无特异性。对于互补的黏性末端以 及平末端都能连接，不同限制酶切割形成的黏性末端只要互 补，DNA连接酶就可催化二者连接。 典例剖析 例：C限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键，其中 限制酶能将磷酸二酯键切开，而DNA连接酶能将磷酸二酯 键连接起来，A正确：由图示三种限制酶的切割位点可知，这 三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，B正确：用BamH I 和Sau3AI切割DNA会形成相同的黏性末端，故BamH I和 Sau3AI切割DNA片段形成的末端能够彼此连接，C错误； 图中的DNA片段被EcoR I切割后，会断裂两个磷酸二酯 键，从而增加两个游离的磷酸基团，D正确。 变式训练 1.ADNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而 非任意的两个DNA片段，A错误。 任务二 合作探究 1.提示：不可行；因为如果没有载体导入受体细胞，目的基因无 法进行自我复制和稳定存在以及表达。 2.提示：能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受 体DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体 细胞中复制，不至于丢失。 3.提示：具有一个或多个限制酶切割位，点，供外源DNA片段插 入其中。 4.提示：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 5.提示：质粒上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，如四 环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，而受体细胞中不含该 种抗生素的抗性基因，因此受体细胞没有抵抗该抗生素的能 力。例如将含有四环素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性 基因在受体细胞内表达，受体细胞对四环素产生抗性。在含 有四环素的培养基上，只有导入了基因表达载体或空质粒的 受体细胞才能生存。 21 6.提示：合理：因为仅导入载体的和导入含目的基因的载体的受 体细胞均能在该培养基中存活。 7.提示：噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。 典例剖析 例：D质粒能够在受体细胞中复制应含有复制原点，A正确；据 图分析可知，培养基乙上菌落分布分散，是用稀释涂布平板 法接种的，B正确：配制培养基乙时应加入氨苄青霉素，以筛 选出含有质粒载体的大肠杆菌，C正确：培养基乙中生长的 菌落为转化质粒载体或者含有插入了目的基因的重组质粒 的大肠杆菌：培养基丙中生长的菌落为导入质粒载体的大肠 杆菌，故不能在培养基丙中生长，但能在培养基乙中生长的 菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌，D错误。 变式训练 2.A作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量 复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有 一个或多个限制酶切割位点，以便目的基因的插人，而不是表 达，B错误：作为载体必须具有标记基因，以便重组DNA分子 的筛选，C错误：作为载体必须是安全的，对受体细胞无伤害， 以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。 任务三 合作探究 1.提示：不能。因为哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，不能提取 出DNA。 2.提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的 DNA量变少，导致看不到白色丝状物，用二苯胺鉴定颜色反 应不明显 3.提示：DNA不溶于酒精，加入预冷的酒精溶液有利于DNA的 析出。预冷的酒精溶液具有以下优，点：一是抑制核酸水解酶 活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析 出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。玻璃 棒沿着一个方向搅拌可防止丝状DNA破碎，有利于丝状DNA 完整地缠在玻璃棒上。 4.提示：2次静置或离心，目的是将DNA和杂质分子分开。第1 次操作后，DNA存在于上清液中：第2次操作后DNA存在于 析出的白色丝状物或离心管沉淀中。 典例剖析 例：CDNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原 理，可以初步分离DNA与蛋白质，C错误。 变式训练 3.D将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，混合均匀后， 还需要沸水浴处理才能呈现蓝色，D错误。 课堂达标巩固训练 1.A用限制酶MnI切割A项中质粒后，不会破坏标记基因， 而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作 为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因，不适于作为 目的基因的载体。C、D项中质粒含有标记基因，但用限制酶 切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体。 2.D质粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌细胞内 也有分布，A错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切 割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误：重组质粒进 入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体染色体 DNA上后复制，C错误。 3.(1)③→②→①→④→⑤ (2)溶解DNA 8 (3)析出并获得DNA DNA不溶于酒精 (4)白二苯胺沸水浴冷却蓝色 (5)猪是哺乳动物，哺乳动物血液中成熟的红细胞没有细胞核 【解析】(1)题述图示中，该实验的正确操作顺序是③→② →①→④⑤。(2)DNA在不同浓度的Nad溶液中溶解度 不同，DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。(3)步骤①的目的 是利用DNA不溶于酒精的性质，除去细胞中溶于酒精的物 质，提取DNA。(4)提取的DNA为白色丝状物，鉴定DNA用 二苯胺试剂，沸水浴加热5min,冷却后溶液呈蓝色。(5)猪是 哺乳动物，哺乳动物血液中的成熟红细胞没有细胞核和众多 的细胞器，因此用猪血代替鸡血来进行该实验难以取得成功。 第2节基因工程的基本操作程序 第1课时目的基因的筛选与获取和 基因表达载体的构建 必备知识自主梳理 一、1.(1)筛选与获取(2)基因表达载体(3)受体细胞 (4)检测与鉴定 2.(1)①受体细胞性状预期表达产物②Bt抗虫蛋白基 因(2)①已知结构功能清晰②序列信息Bt抗虫蛋 白③测序序列序列比对(3)①DNA半保留复制 ②解旋酶模板DNA聚合酶3'③变性90℃单链 复性50℃碱基互补配对延伸72℃DNA聚合 酶4种脱氧核苷酸3'④PCR扩增仪(PCR仪) 微思考 提示：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg+激活。 二、1.(1)受体细胞(2)表达 教材隐性知识 直接分解细胞分裂不含有目的基因借助载体将其导入 棉花细胞 2.启动子上游RNA聚合酶终止子下游转录 标记 微思考 提示：启动子位于DNA分子上，启动的是转录过程；起始密码 子位于mRNA分子上，是翻译过程的起始位置。 3.(1)限制酶(2)同种(3)DNA连接酶 自我检测 1.×用PCR仪对DNA分子扩增常用耐高温的DNA聚合酶。 2.×PCR反应中温度的周期性改变是为了让DNA分子解聚 引物与DNA单链结合和子链延伸。 3./ 4.×PCR反应中DNA分子完全解旋之后再进行复制。 5.V 6.×基因表达载体中含有启动子和终止子。 7.×启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。 8.V 合作探究能力提升 任务一 合作探究 1.提示：不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定 DNA片段。 2.提示：根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 3.提示：3轮：1/4。 21 4.提示：第1组：引物I和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而 失效。第2组：引物I'自身折叠后会因出现局部碱基互补配 对而失效。 5.提示：要在两种引物的5'端分别添加上限制酶的识别序列。 6.提示：共需消耗2”-1对引物。 7.提示：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核 苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合 酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向 总是从子链的5'端向3'端延伸 典例剖析 例：D由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的 两个DNA分子中，只含有引物A或引物B,而以新合成的子 链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循 环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的分子是7个，即 占7/8，D错误。 变式训练 1.A目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有 调控作用的因子，A错误。 任务二 合作探究 1.提示：启动子下游和终止子上游；因为只有插入在启动子和终 止子之间，目的基因才可以正常表达。 2.提示：不能；因为SaI会破坏质粒的抗生素抗性基因。该基 因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进 一步筛选。 3.提示：可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与 载体的反向连接。 典例剖析 例：D切割外源DNA分子上的目的基因时，用BamH I切割会 破坏目的基因，只用PtI切割目的基因和质粒载体，会出现 目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连 接，而用PstI和HindⅢ进行酶切，能确保目的基因和质粒的 正向连接，并且质粒上可保留新霉素抗性基因作为标记基 因，A、C正确：在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基 因，至少需要保留其中的一个，B正确：用PstI切割后，质粒 上的氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导人重组质粒的大肠杆 菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。 变式训练 2.B启动子位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的 位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载 体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等组件，B 错误；人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或 抑制目的基因的表达，C正确：由于受体细胞有植物、动物以 及微生物之分，且目的基因导入受体细胞的方法不同.因此基 因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。 课堂达标巩固训练 1.A构建重组质粒时，要将目的基因插人启动子和终止子之 间，而且不能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因 等部位，故只能选用NdeI和BamH I切割质粒和含目的基因 的DNA片段，因此在PCR扩增的该基因两端需分别引入 NdeI和BamH I两种限制酶的识别序列。 29