精品解析：广西钦州市第四中学2026届高三年级上学期第二十八周考试生物试卷

广西钦州市第四中学2026届高三年级上学期第二十八周考试生物试卷 注意事项: 1.答题前,考生务必将自己的姓名、准考证号填写在答题卡上。 2.回答选择题时,选出每小题答案后,用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。如需改动,用橡皮擦干净后,再选涂其他答案标号。回答非选择题时,将答案写在答题卡上，写在本试卷上无效。 3.考试结束后,将本试卷和答题卡一并交回 一、单选题（共16小题，其中第1-12小题，每小题2分，第13-16小题，每小题4分；共40分） 1. 数字PCR技术称为第三代PCR，可对样本中的目标DNA进行精确计数。该技术通过将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含0-1个拷贝的目标DNA，在每个单元中分别对目标DNA进行PCR扩增，扩增结束后对每个单元的荧光信号进行分析，计算出稀释前初始样本中目标DNA的拷贝数。下列说法错误的是（　　） A. 数字PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制 B. 数字PCR技术更适用于样本中目标DNA含量高的材料 C. 每个反应单元中目标DNA两条子链均从5′向3′延伸 D. 每个反应单元中加入的酶是耐高温的DNA聚合酶 2. 某同学使用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术获取cDNA，结果未获得cDNA产物，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 逆转录酶失活，更换新的逆转录酶 B. 酶的用量不足，增加TaqDNA聚合酶的用量 C. RNA模板降解，使用新的RNA模板 D. 引物失效，换用新的引物 3. 单细胞凝胶电泳实验是通过检测DNA链断裂损伤评估遗传毒性的技术手段。细胞凋亡时，核DNA会被降解成大小不一的片段。将凋亡细胞和正常细胞放于琼脂糖凝胶中，裂解细胞膜后电泳，前者细胞核呈彗星状，后者细胞核保持圆球形。下列叙述正确的是（　　） A. 利用台盼蓝也能有效区分凋亡细胞和正常细胞 B. 细胞中DNA被降解成片段后不再存在蛋白质的合成过程 C. 彗星状的形成与小分子DNA片段在电场中移动速度快有关 D. 细胞正常代谢活动受损或中断引起的细胞死亡属于细胞凋亡 4. 某科研小组以自交不亲和的分蘖洋葱为实验材料，进行了一系列实验。下列相关叙述合理的是（　　） A. 在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后观察颜色以鉴定DNA B. 用低倍镜观察分蘖洋葱鳞片叶表皮临时装片，可见细胞核位于细胞中央 C. 用洋葱管状绿叶做光合色素分离实验时，需将滤液细线浸入层析液进行层析 D. 用该分蘖洋葱做杂交实验时，作为母本的植株必须进行去雄处理 5. 启动子包括组成型启动子（在不同组织细胞中均能持续表达）和诱导型启动子（只有在激活物存在时才表达）。为快速检测水体中的污染物M，科研人员构建了下图所示的基因表达载体（部分结构），将其导入大肠杆菌，通过检测红色荧光的强度即可估计待测水体中M的相对浓度。已知调控蛋白可与M结合形成复合物，该复合物能激活特定启动子。下列说法错误的是（　　） A. 可通过序列数据库获取红色荧光蛋白基因的碱基序列 B. 构建上述基因表达载体时需要使用限制酶和DNA连接酶 C. 启动子1和启动子2应分别选择诱导型启动子和组成型启动子 D. 若想实现M的动态清除，可将红色荧光蛋白基因换成M的降解基因 6. RDX是一种有毒化学物质，能够深入土壤和饮用水中，对生态环境和人类健康构成严重威胁。科研人员从细菌中获得RDX降解酶基因XplA和XpIB，并利用农杆菌转化法将这两个基因插入柳枝稷草染色体中，使柳枝稷草获得降解土壤中RDX的能力。XplA和XpIB基因结构如图1所示，基因表达载体的部分结构如图2所示。下列有关叙述错误的是（　　） A. 为确保XpIB基因定向插入到载体中，PCR扩增时，在引物1、2的两端需分别加入XmaI、BclI的识别序列 B. 若通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否插入XplA和XpIB基因，需选用的引物为引物1、引物2 C. 由于电泳只能区分DNA序列的长度，不能确认是否为目的基因，所以对符合预期的产物片段，需进行基因测序 D. 将XplA和XplB基因成功转入柳枝稷草细胞并获得的转基因植株中，并不是所有个体都具有降解RDX的能力 7. 研究人员欲将青稞的抗冻基因（Dhn4基因，其结构如图1所示）进行PCR扩增，再与图2所示的Ti质粒构建成重组质粒，利用农杆菌转化法转入草莓细胞，培育抗冻草莓植株。下列有关说法正确的是（　　） 注：XhoI、KpnI、PstI为三种不同黏性末端的限制酶识别位点；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。 A. 可构建青稞基因组文库筛选Dhn4基因，经逆转录后作为PCR模板 B. 利用PCR扩增Dhn4基因时应选择引物Ⅱ和引物Ⅲ进行扩增 C. 构建重组质粒时需用PstI和XhoI双酶切Dhn4基因和质粒 D. 将重组质粒导入农杆菌后，需在含氨苄青霉素抗性基因的培养基上筛选农杆菌 8. 石油提炼过程中产生的石油烃会对环境造成严重污染。科研人员通过基因工程培育的石油烃降解菌可降解石油烃。下列叙述错误的是（　　） A. 目的基因可从富含石油烃的环境里筛选出的微生物中获取 B. 基因表达载体需含目的基因、标记基因、启动子和终止子等DNA片段 C. 可用Ca2+处理受体菌改变其生理状态，以利于基因表达载体导入受体菌 D. 在受体细胞中检测到目的基因，说明石油烃降解菌培育成功 9. 在生物学实验中需要合理控制实验处理的时间，否则影响实验结果。下列叙述错误的是（ ） A. 制作洋葱根尖有丝分裂装片时，解离时间过短会导致组织细胞之间无法分离 B. 洋葱鳞片叶外表皮细胞长时间处于蔗糖溶液中，再滴加清水可能会无法复原 C. 用32P标记的噬菌体侵染细菌时，保温时间过长会导致上清液中放射性降低 D. PCR扩增目的基因时，预变性时间过短导致部分DNA未完全解旋成单链DNA 10. 由vbp2基因编码的VBP蛋白参与T-DNA转运。为表征vbp2c启动子的转录活性，科研人员将vbp2启动子控制的vbp2基因替换为红色荧光蛋白基因（rfp基因），并转入根癌农杆菌中。为探究根癌农杆菌其他成分是否干扰荧光检测，将野生型菌与重组菌（含红色荧光蛋白RFP）的粗提液按不同比例混合，测定荧光强度，结果如图所示。下列说法错误的是（　　） A. 用rfp基因替换vbp2基因时，需保证其插入方向与启动子正确匹配 B. 每组实验混合前应保证两种粗提液的来源不变 C. 实验结果说明粗提液中的其他成分对RFP荧光强度测定有显著干扰 D. 实验结果表明重组菌RFP荧光强度能够表征vbp2启动子的转录活性 11. 酒精在日常生活中有消毒的作用，在实验过程中还有其他特殊用途。下列生物学实验中可用到酒精且功能基本相同的是（　　） ①观察细胞内的脂肪 ②叶绿体中色素的提取和分离 ③观察植物细胞有丝分裂 ④DNA粗提取和鉴定 ⑤低温诱导植物细胞染色体数目的变化 ⑥菊花的组织培养 A. ①④ B. ②④ C. ③⑤ D. ⑤⑥ 12. 下图为检测残留在生物组织或环境中四环素水平的大肠杆菌工程菌的作用原理，当四环素存在时，大肠杆菌可以发出绿色荧光。下列叙述错误的是（ ） 注：图中“+”表示促进，“-”表示抑制 A. 图中?处应为“-”，四环素直接解除对启动子2的抑制，使大肠杆菌发光 B. DNA的双螺旋结构是外源基因整合到大肠杆菌DNA上的结构基础 C. 大肠杆菌出现绿色荧光性状受到T基因和绿色荧光基因的共同影响 D. 启动子是基因上游的一段特殊的DNA序列，与RNA聚合酶发生特异性结合 13. 基因PCR定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR是发展最早的定点突变技术，其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（ ） A. 蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质 B. 应将引物1、2与引物3、4置于两个独立的反应体系中 C. 步骤④使用DNA聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸 D. 步骤⑤中如果完成6轮循环一共需要消耗63个引物1 14. OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述错误的是（　　） A. 由EcGCL和TSR基因控制合成的酶可被叶绿体转运肽引导进入叶绿体 B. OsGLO1和EcCAT基因以同一条DNA单链为模板链 C. 成功导入多基因表达载体的农杆菌对潮霉素和卡那霉素均有抗性 D. 成功导入目的基因的愈伤组织细胞的染色体上没有卡那霉素抗性基因 15. 科研人员将ETS1基因中①②之间的片段（图1）切除，从而获得雌雄各一头系统性红斑狼疮（SLE）猪（亲本），并分别使用荧光标记的P1、P2、P3三种探针对两者的个体甲、乙、丙进行基因检测，结果如图2所示，相关基因用E/e表示。下列叙述错误的是（　　） A. 亲本雌雄猪的基因型分别为Ee、Ee B. 图2中Ⅰ、Ⅱ使用的探针分别是P2、P3 C. 只有的乙才是纯合SLE模型猪 D. 中含大条带与小条带的猪占1/2 16. 下列相关实验操作正确的是（ ） A. 在PCR实验中，用无菌水配制相关反应液置于微量离心管中 B. 将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 C. 接种室使用前，应在对其进行紫外线照射同时适量喷洒苯酚 D. 在微生物分离与计数实验中，常用蒸馏水对菌液进行梯度稀释 第II卷（非选择题） 二、综合题（5大题，共60分，请考生按要求作答问题） 17. 限制性核酸内切酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmBⅠ实现多DNA片段无缝连接的技术称为Golden Gate克隆，其过程如图2.请回答下列问题。 （1）由图1可知，BsmBⅠ酶切DNA中的________键，产生________（类型）末端。BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端________（填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。 （2）PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，其原因有________、________。过程②需要的酶有________。 （3）片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为________（接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列________（接头序列用小写字母表示）。 （4）据图1、2分析，GoldenGate克隆技术的优点有________。 a.不受天然酶切位点的限制 b.实现多片段一次性有序连接 c.有利于大片段DNA的高效连接 d.片段1~n之间不会引入外源序列实现无缝连接 18. 对香豆酸（p-HCA）是多酚和黄酮类化合物生物合成中的关键前体，但即使是低浓度的p-HCA也会抑制酵母菌的生长。开发特异性响应p-HCA的生物传感器，可以实现根据细胞内p-HCA水平自主、精确地调节基因表达。回答下列问题： （1）研究者通过PCR技术构建融合启动子（图1），此过程对扩增基因的引物的设计要求是_______，经过该设计，PCR扩增后的产物末端可通过_______结合，再经_______酶的延伸作用可完成融合。 （2）图2是p-HCA生物传感器，据图可知，p-HCA与PadR蛋白结合后，其构象发生改变，无法与中的片段结合，EGFP基因得以表达。据此推测，在中插入基因的目的是___________。 （3）为检测上述生物传感器对酚酸（p-HCA及其类似物CA）的灵敏度和特异性，研究者进行了相关实验，结果如图3所示。 注：为荧光强度与菌液浓度的比值，反映传感器的响应程度，比值越大则响应程度越高。 图3结果表明，该生物传感器具有的特性是_______，依据是_______（从“灵敏度”或“特异性”角度分析，答1点即可）。 （4）番茄红素为红色色素，其生物合成过程如图4所示。 利用上述生物传感器的调控功能，在该设计中，研究者开发了一种基于颜色的构建重组生产菌株的方法：无p-HCA时，菌落不呈现红色而呈现浅黄色或白色；高p-HCA时菌落呈红色。已知野生型酵母菌可将FPP用于合成细胞膜，但不会合成番茄红素，则该方法的设计思路是_______。 19. 土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，通过全基因关联分析，科研人员定位了一个盐碱响应通路中的关键基因AT1，为研究高粱植株中AT1的作用，研究人员拟构建AT1过表达植株(AT1-OE)和AT1基因敲除植株(AT1-KO)。 （1）构建AT1-OE植株：以高粱cDNA为模板，通过PCR获取目的基因。将AT1基因插入Ti质粒的___________片段中，将重组质粒转入农杆菌与高粱愈伤组织共培养，筛选后经___________(填生理过程)获得完整植株。 （2）构建AT1-KO植株：以图1中AT1基因的上、下游片段构建重组质粒(图2)，然后通过同源重组(重组质粒中的上、下游片段分别与高粱基因组中AT1基因上、下游片段配对，并发生交换)敲除高粱植株中的AT1基因。具体构建过程如下： 注：HindⅢ、NotI标注的位点为各限制酶的识别位点 ①以高粱基因组DNA为模板，选择引物___________进行PCR扩增，用限制酶___________对PCR产物进行酶切后电泳，结果如图3.回收片段___________(填字母)，再与HindⅢ酶切后的质粒大片段连接，获得重组质粒。 ②将重组质粒转入高粱愈伤组织，将愈伤组织置于含___________的平板上初步筛选，最终获得高粱植株。 ③初步鉴定：提取高粱植株的核DNA，选择引物1和引物4进行PCR，若电泳获得___________条条带，则对应植株为AT1基因敲除杂合子，通过自交获得敲除纯合子。 （3）检测植株在盐碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株___________，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在盐碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 20. SUMO蛋白具有抗蛋白酶水解的特性，常作为标签与靶蛋白融合，用于提高靶蛋白的性能。抗菌肽是一类具有抗菌作用的小分子多肽，可破坏细菌的细胞膜结构，导致细菌裂解。研究人员将SUMO基因和抗菌肽Cec4a基因进行融合并表达重组抗菌肽，使抗菌肽Cec4a加上SUMO标签，部分流程如图所示。 注：AUG是起始密码子，UGA是终止密码子。HindⅢ、BamHI和EcoRI均表示限制酶。请回答： （1）SUMO基因和抗菌肽Cec4a基因可用_______酶进行连接。为确保融合基因成功表达出重组抗菌肽，需要对SUMO基因②处的序列进行改造，原因是_________________。 （2）构建重组质粒时，目的基因和质粒应选用限制酶_______处理。 （3）研究人员分别用SUMO-Cec4a融合蛋白（甲组）和抗菌肽Cec4a（乙组）进行抗细菌实验，结果发现：短时间内甲乙两组的细菌裂解率接近，但随时间推移，甲组细菌裂解率逐渐高于乙组，其原因是__________________。 （4）为进一步提高抗菌肽的抗菌性能，研究人员在Cec4a的基础上通过AI技术设计了一款更高效的抗菌肽Cec4a-1。二者的部分氨基酸序列见下表： 抗菌肽 部分氨基酸序列 Cec4a ……GWLKKIGKKIERVGQNTR……KGK Cec4a-1 ……GWLKKIGKKIERVGQNTR……KGN 注：一种字母表示一种氨基酸，两者相同位置……处的氨基酸序列相同。 研究人员拟使用蛋白质工程生产抗菌肽Cec4a-1。他们通过设计引物并利用PCR扩增技术将Cec4a基因改造成Cec4a-1基因，请写出基因的改造思路：________________。 21. β—防御素是由S基因编码的一种免疫蛋白，在人体的免疫反应中发挥着重要作用。但是重组酵母中S基因的表达水平低，因此科研人员构建了S基因多拷贝的表达载体，将其转入酵母菌中获得重组菌株，实现了S基因的高表达，载体构建流程如图所示。KEX2蛋白酶能够专一性地识别并切割赖氨酸—精氨酸（对应的密码子分别是AAA、AGA）双碱性氨基酸的羧基端肽键，确保目标蛋白的正确加工和释放。 注：5，AOX1：甲醇诱导型启动子；3，AOX1：终止子；zeocin：博来霉素抗性基因 α-factor：α-信号肽序列，表达的信号肽能引导与其融合的蛋白移动到内质网，信号肽被切除后蛋白才能分泌到细胞外；限制酶及其识别序列： sacⅡ5′—GAGCT↓C—3′ BglⅡ5′—A↓GATCT—3′ XhoⅠ5′—C↓TCGAG—3′ XbaⅠ5′—T↓CTAGA—3′ BamHⅠ5′—G↓GATCC—3′ S基因编码序列：5′ATGCAGTAC……CGGTCTTAG3′ （1）为保证S基因和载体正向连接，并使酵母细胞分泌出β—防御素，利用PCR技术对S基因进行扩增时，使用的S基因的上游引物序列应为5′_______（写出15个碱基）3′，该引物的作用有_______。 （2）S基因表达盒能与只用BamHⅠ酶切后的P—S1质粒连接获得P—S2质粒（含2个拷贝S基因表达盒的P质粒），从限制酶的角度分析，两者能够连接的原因是_______。再利用P—S2质粒重复以上操作获得P—S4质粒（含4个S基因表达盒的P质粒）。用BamHⅠ和BglⅡ双酶切P—S4质粒，可获得长度为_______的DNA片段。 （3）在荧光定量PCR实验中，随着PCR反应的进行，产物不断累积，荧光信号也逐渐增强。当荧光信号达到预设的阈值时，此时所对应的循环数即为CT值。提取分别导入P—S1、P—S、P—S4质粒的酵母细胞的DNA进行荧光定量PCR扩增S基因，则CT值最小的是导入_______的酵母细胞。 （4）为筛选出转化成功的酵母细胞并获取β—防御素，应该在含有_______的培养基中进行培养。 （5）与大肠杆菌相比，酵母作为S基因的受体细胞的优势是_______。 第1页/共1页 学科网（北京）股份有限公司 $ 广西钦州市第四中学2026届高三年级上学期第二十八周考试生物试卷 注意事项: 1.答题前,考生务必将自己的姓名、准考证号填写在答题卡上。 2.回答选择题时,选出每小题答案后,用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。如需改动,用橡皮擦干净后,再选涂其他答案标号。回答非选择题时,将答案写在答题卡上，写在本试卷上无效。 3.考试结束后,将本试卷和答题卡一并交回 一、单选题（共16小题，其中第1-12小题，每小题2分，第13-16小题，每小题4分；共40分） 1. 数字PCR技术称为第三代PCR，可对样本中的目标DNA进行精确计数。该技术通过将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含0-1个拷贝的目标DNA，在每个单元中分别对目标DNA进行PCR扩增，扩增结束后对每个单元的荧光信号进行分析，计算出稀释前初始样本中目标DNA的拷贝数。下列说法错误的是（　　） A. 数字PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制 B. 数字PCR技术更适用于样本中目标DNA含量高的材料 C. 每个反应单元中目标DNA两条子链均从5′向3′延伸 D. 每个反应单元中加入的酶是耐高温的DNA聚合酶 【答案】B 【解析】 【详解】A、数字PCR技术基于PCR扩增，其原理是DNA的半保留复制，通过变性、复性、延伸循环复制目标DNA，A正确； B、数字PCR通过高度稀释将样本分配到独立单元，适用于低含量目标DNA的精确计数，若目标DNA含量过高，稀释后多数单元仍含多个拷贝，反而降低计数准确性，B错误； C、PCR扩增时，DNA聚合酶催化子链合成方向始终为5′→3′，每个反应单元中目标DNA的延伸符合此规律，C正确； D、PCR需在高温（约95℃）下变性DNA，因此每个反应单元必须加入耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶），D正确。 故选B。 2. 某同学使用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术获取cDNA，结果未获得cDNA产物，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 逆转录酶失活，更换新的逆转录酶 B. 酶的用量不足，增加TaqDNA聚合酶的用量 C. RNA模板降解，使用新的RNA模板 D. 引物失效，换用新的引物 【答案】B 【解析】 【详解】A、逆转录酶是逆转录过程的关键酶，若失活则无法合成cDNA，更换新酶可解决，A正确； B、Taq DNA聚合酶用于PCR扩增阶段（需DNA模板），而cDNA未合成说明问题在逆转录阶段，增加Taq酶用量对逆转录无效，B错误； C、RNA模板是逆转录的原料，若降解则无法合成cDNA，更换新模板可解决，C正确； D、逆转录需引物与RNA模板结合以启动合成，引物失效会导致失败，换新引物可解决，D正确。 故选B。 3. 单细胞凝胶电泳实验是通过检测DNA链断裂损伤评估遗传毒性的技术手段。细胞凋亡时，核DNA会被降解成大小不一的片段。将凋亡细胞和正常细胞放于琼脂糖凝胶中，裂解细胞膜后电泳，前者细胞核呈彗星状，后者细胞核保持圆球形。下列叙述正确的是（　　） A. 利用台盼蓝也能有效区分凋亡细胞和正常细胞 B. 细胞中DNA被降解成片段后不再存在蛋白质的合成过程 C. 彗星状的形成与小分子DNA片段在电场中移动速度快有关 D. 细胞正常代谢活动受损或中断引起的细胞死亡属于细胞凋亡 【答案】C 【解析】 【详解】A、台盼蓝染色法可以区分死细胞和活细胞，凋亡细胞和正常细胞都是活细胞，无法区分，A错误； B、细胞凋亡过程中，存在基因的选择性表达，因此细胞中DNA被降解成片段后仍然存在蛋白质的合成过程，B错误； C、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，DNA分子片段越小，移动越快，凋亡细胞中DNA分子被降解，DNA分子片段变小，可知彗星状的形成与小分子DNA片段在电场中移动速度快有关，C正确； D、细胞正常代谢活动受损或中断引起的细胞死亡属于细胞坏死，细胞凋亡是由基因决定的细胞自动结束生命的过程，D错误。 故选C。 4. 某科研小组以自交不亲和的分蘖洋葱为实验材料，进行了一系列实验。下列相关叙述合理的是（　　） A. 在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后观察颜色以鉴定DNA B. 用低倍镜观察分蘖洋葱鳞片叶表皮临时装片，可见细胞核位于细胞中央 C. 用洋葱管状绿叶做光合色素分离实验时，需将滤液细线浸入层析液进行层析 D. 用该分蘖洋葱做杂交实验时，作为母本的植株必须进行去雄处理 【答案】A 【解析】 【详解】A、在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，经沸水浴加热后呈现蓝色，是鉴定DNA的经典实验方法，符合实验原理，A正确； B、分蘖洋葱鳞片叶表皮细胞为成熟植物细胞，中央被大液泡占据，细胞核被挤至细胞边缘（如贴近细胞膜），而非位于中央，B错误； C、进行光合色素分离实验时，滤液细线需置于层析液上方，利用毛细现象使色素在滤纸条上扩散分离。若将细线浸入层析液，色素会直接溶解于层析液，导致实验失败，C错误； D、自交不亲和指同一植株的花粉不能使自身雌蕊受精，因此作为母本时无需去雄（因其天然排斥自花授粉），D错误。 故选A。 5. 启动子包括组成型启动子（在不同组织细胞中均能持续表达）和诱导型启动子（只有在激活物存在时才表达）。为快速检测水体中的污染物M，科研人员构建了下图所示的基因表达载体（部分结构），将其导入大肠杆菌，通过检测红色荧光的强度即可估计待测水体中M的相对浓度。已知调控蛋白可与M结合形成复合物，该复合物能激活特定启动子。下列说法错误的是（　　） A. 可通过序列数据库获取红色荧光蛋白基因的碱基序列 B. 构建上述基因表达载体时需要使用限制酶和DNA连接酶 C. 启动子1和启动子2应分别选择诱导型启动子和组成型启动子 D. 若想实现M的动态清除，可将红色荧光蛋白基因换成M的降解基因 【答案】C 【解析】 【详解】A、在基因工程中，对于已知基因（如红色荧光蛋白基因），可以通过序列数据库获取其碱基序列，然后根据该序列进行引物设计等后续操作，A正确； B、构建基因表达载体时，需要用限制酶切割目的基因（红色荧光蛋白基因等）和载体，以获得相同的黏性末端或平末端，然后再用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来，形成重组表达载体，B正确； C、调控蛋白需持续表达以感知M的存在，故其启动子1应为组成型启动子(持续表达)；红色荧光蛋白需在M存在时才表达，故其启动子2应为诱导型启动子(仅调控蛋白+M时激活)，C错误； D、若想实现M的动态清除，可将红色荧光蛋白基因换成M的降解基因。这样当水体中有M时，调控蛋白与M结合启动M的降解基因表达，对M进行降解，从而实现M的动态清除，D正确。 故选C。 6. RDX是一种有毒化学物质，能够深入土壤和饮用水中，对生态环境和人类健康构成严重威胁。科研人员从细菌中获得RDX降解酶基因XplA和XpIB，并利用农杆菌转化法将这两个基因插入柳枝稷草染色体中，使柳枝稷草获得降解土壤中RDX的能力。XplA和XpIB基因结构如图1所示，基因表达载体的部分结构如图2所示。下列有关叙述错误的是（　　） A. 为确保XpIB基因定向插入到载体中，PCR扩增时，在引物1、2的两端需分别加入XmaI、BclI的识别序列 B. 若通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否插入XplA和XpIB基因，需选用的引物为引物1、引物2 C. 由于电泳只能区分DNA序列的长度，不能确认是否为目的基因，所以对符合预期的产物片段，需进行基因测序 D. 将XplA和XplB基因成功转入柳枝稷草细胞并获得的转基因植株中，并不是所有个体都具有降解RDX的能力 【答案】B 【解析】 【详解】A、为确保XplB基因定向插入载体，需要在引物1、2的两端分别加入XmaⅠ、BclⅠ的识别序列，这样PCR扩增后的片段两端就带有这两种酶的酶切位点，能与载体的对应酶切位点定向连接，A正确； B、若通过PCR检测转基因柳枝稷草中是否插入XplA和XplB基因，需要分别针对两个基因设计引物，检测XplA基因需要引物3、引物4；检测XplB基因需要引物1、引物2。 仅用引物1、引物2只能检测XplB基因，无法检测XplA基因，B错误； C、由于电泳只能区分DNA片段的长度，不能确认片段的碱基序列是否为目的基因，因此对符合预期的产物需要进行基因测序来验证，C正确； D、将XplA和XplB基因成功转入柳枝稷草细胞并获得转基因植株后，由于基因表达受多种因素影响，不是所有个体都能正常表达这两个基因，因此不是所有个体都具备降解RDX的能力，D正确。 故选B。 7. 研究人员欲将青稞的抗冻基因（Dhn4基因，其结构如图1所示）进行PCR扩增，再与图2所示的Ti质粒构建成重组质粒，利用农杆菌转化法转入草莓细胞，培育抗冻草莓植株。下列有关说法正确的是（　　） 注：XhoI、KpnI、PstI为三种不同黏性末端的限制酶识别位点；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。 A. 可构建青稞基因组文库筛选Dhn4基因，经逆转录后作为PCR模板 B. 利用PCR扩增Dhn4基因时应选择引物Ⅱ和引物Ⅲ进行扩增 C. 构建重组质粒时需用PstI和XhoI双酶切Dhn4基因和质粒 D. 将重组质粒导入农杆菌后，需在含氨苄青霉素抗性基因的培养基上筛选农杆菌 【答案】B 【解析】 【详解】A、逆转录的模板是RNA，从青稞基因组文库中筛选的Dhn4基因是双链DNA，可直接作为PCR扩增的模板，无需经过逆转录，A错误； B、PCR扩增的核心要求是一对引物能分别结合到目的基因双链的两端，且延伸方向可覆盖整个基因序列，引物Ⅱ和引物Ⅲ满足这一条件，B正确； C、构建重组质粒时，所选限制酶需保证不破坏目的基因的完整性，同时能让目的基因插入质粒的功能区域，而目的基因内部存在PstI位点，用PstI切割会直接切断目的基因，C错误； D、利用氨苄青霉素抗性基因筛选含重组质粒的农杆菌时，需在培养基中添加氨苄青霉素，抗性基因是质粒的组成部分而非培养基添加物，D错误。 故选B。 8. 石油提炼过程中产生的石油烃会对环境造成严重污染。科研人员通过基因工程培育的石油烃降解菌可降解石油烃。下列叙述错误的是（　　） A. 目的基因可从富含石油烃的环境里筛选出的微生物中获取 B. 基因表达载体需含目的基因、标记基因、启动子和终止子等DNA片段 C. 可用Ca2+处理受体菌改变其生理状态，以利于基因表达载体导入受体菌 D. 在受体细胞中检测到目的基因，说明石油烃降解菌培育成功 【答案】D 【解析】 【详解】A、在富含石油烃的环境中，存在能分解石油烃的微生物，其基因组中可能含有降解石油烃的酶基因（目的基因），可通过筛选获取，A正确； B、基因表达载体必须包含目的基因、标记基因（用于筛选重组细胞）、启动子（RNA聚合酶识别结合位点）和终止子（转录终止信号）等DNA元件，B正确； C、用Ca²⁺处理受体菌（如大肠杆菌）可增加细胞膜通透性，使其处于感受态（易吸收外源DNA的状态），利于载体导入，C正确； D、检测到目的基因仅说明基因已导入受体细胞，但基因需成功转录和翻译（表达出降解酶）才能具备降解功能。未检测功能则不能认定培育成功，D错误。 故选D。 9. 在生物学实验中需要合理控制实验处理的时间，否则影响实验结果。下列叙述错误的是（ ） A. 制作洋葱根尖有丝分裂装片时，解离时间过短会导致组织细胞之间无法分离 B. 洋葱鳞片叶外表皮细胞长时间处于蔗糖溶液中，再滴加清水可能会无法复原 C. 用32P标记的噬菌体侵染细菌时，保温时间过长会导致上清液中放射性降低 D. PCR扩增目的基因时，预变性时间过短导致部分DNA未完全解旋成单链DNA 【答案】C 【解析】 【详解】A、制作洋葱根尖有丝分裂装片时，解离液（盐酸和酒精）的作用是使组织细胞分离。解离时间过短，细胞间果胶未充分分解，导致细胞无法分散，影响观察，A正确； B、洋葱鳞片叶外表皮细胞在蔗糖溶液中长时间质壁分离后，细胞可能因失水过度死亡，原生质层失去选择透过性，滴加清水后无法发生质壁分离复原，B正确； C、用³²P标记噬菌体DNA侵染细菌时，保温时间过长会使子代噬菌体释放至培养液中。离心后子代噬菌体分布在上清液，导致上清液放射性升高（标记的DNA进入子代），而非降低，C错误； D、PCR扩增中预变性（高温）使DNA双链解旋为单链。时间过短会导致部分DNA未完全解链，影响后续引物结合和扩增效率，D正确。 故选C。 10. 由vbp2基因编码的VBP蛋白参与T-DNA转运。为表征vbp2c启动子的转录活性，科研人员将vbp2启动子控制的vbp2基因替换为红色荧光蛋白基因（rfp基因），并转入根癌农杆菌中。为探究根癌农杆菌其他成分是否干扰荧光检测，将野生型菌与重组菌（含红色荧光蛋白RFP）的粗提液按不同比例混合，测定荧光强度，结果如图所示。下列说法错误的是（　　） A. 用rfp基因替换vbp2基因时，需保证其插入方向与启动子正确匹配 B. 每组实验混合前应保证两种粗提液的来源不变 C. 实验结果说明粗提液中的其他成分对RFP荧光强度测定有显著干扰 D. 实验结果表明重组菌RFP荧光强度能够表征vbp2启动子的转录活性 【答案】C 【解析】 【详解】A、rfp基因替换vbp2基因时，为保证rfp基因的正确表达，需要正确插入启动子下游，A正确； B、实验需控制变量，粗提液来源应一致，B正确； C、随着重组菌粗提液比例增加，荧光强度线性增加，且过原点，说明野生型菌粗提液成分对RFP荧光强度测定无显著干扰，C错误； D、重组菌RFP可以产生红色荧光，且和vbp2启动子结合，所以荧光强度可反映vbp2启动子活性，D正确。 故选C。 11. 酒精在日常生活中有消毒的作用，在实验过程中还有其他特殊用途。下列生物学实验中可用到酒精且功能基本相同的是（　　） ①观察细胞内的脂肪 ②叶绿体中色素的提取和分离 ③观察植物细胞有丝分裂 ④DNA粗提取和鉴定 ⑤低温诱导植物细胞染色体数目的变化 ⑥菊花的组织培养 A. ①④ B. ②④ C. ③⑤ D. ⑤⑥ 【答案】C 【解析】 【详解】①观察细胞内的脂肪：实验中用50%酒精洗去浮色，属于漂洗作用； ②叶绿体中色素的提取和分离：实验中用无水乙醇作为溶剂提取色素； ③观察植物细胞有丝分裂：盐酸与酒精（1：1）混合作为解离液用于组织解离，其中酒精的作用是固定细胞形态； ④DNA粗提取和鉴定：实验中用95%酒精沉淀DNA，属于沉淀剂作用； ⑤低温诱导染色体数目变化：冰醋酸与酒精（1：3）混合配制成卡诺氏液用于固定细胞形态，酒精的作用也是固定细胞形态； ⑥菊花的组织培养：酒精用于外植体表面消毒。 综上分析可知，③和⑤对应的实验中用到酒精的功能基本相同，C符合题意。 故选C。 12. 下图为检测残留在生物组织或环境中四环素水平的大肠杆菌工程菌的作用原理，当四环素存在时，大肠杆菌可以发出绿色荧光。下列叙述错误的是（ ） 注：图中“+”表示促进，“-”表示抑制 A. 图中?处应为“-”，四环素直接解除对启动子2的抑制，使大肠杆菌发光 B. DNA的双螺旋结构是外源基因整合到大肠杆菌DNA上的结构基础 C. 大肠杆菌出现绿色荧光性状受到T基因和绿色荧光基因的共同影响 D. 启动子是基因上游的一段特殊的DNA序列，与RNA聚合酶发生特异性结合 【答案】A 【解析】 【详解】A、图中?处应为“-”（T蛋白对启动子2的作用是抑制），但四环素并非直接解除对启动子2的抑制，而是通过抑制T蛋白的活性，间接解除T蛋白对启动子2的抑制，使绿色荧光蛋白基因表达。因此“四环素直接解除对启动子2的抑制”表述错误，A错误； B、DNA的双螺旋结构是不同生物DNA能够重组的结构基础，也是外源基因整合到大肠杆菌DNA（如质粒）上的结构基础，B正确； C、大肠杆菌能否发出绿色荧光，既受T基因（表达的T蛋白抑制绿色荧光基因的启动子2）的调控，也受绿色荧光基因（表达荧光蛋白）的直接控制，因此性状受二者共同影响，C正确； D、启动子是基因上游的特殊DNA序列，能够与RNA聚合酶特异性结合，驱动基因转录，这是启动子的核心功能，D正确。 故选A。 13. 基因PCR定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR是发展最早的定点突变技术，其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（ ） A. 蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质 B. 应将引物1、2与引物3、4置于两个独立的反应体系中 C. 步骤④使用DNA聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸 D. 步骤⑤中如果完成6轮循环一共需要消耗63个引物1 【答案】C 【解析】 【详解】A、蛋白质工程是通过改造基因来设计具有新功能的蛋白质，能够创造自然界中原本不存在的蛋白质，A正确； B、引物1、2用于扩增含突变位点的上游片段，引物3、4用于扩增含突变位点的下游片段。若将四组引物置于同一反应体系，会导致引物交叉结合、干扰PCR产物的特异性，因此需在两个独立的反应体系中分别扩增上下游片段，B正确； C、步骤④使用DNA聚合酶可对分子乙进行延伸，甲不可延伸，C错误； D、PCR过程中，引物的消耗数量为2n+1－2（n为循环数），初始模板不消耗引物。6轮循环后，总产物数为27－2=126，因此消耗的引物1数量为126÷2=63，D正确。 故选C。 14. OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述错误的是（　　） A. 由EcGCL和TSR基因控制合成的酶可被叶绿体转运肽引导进入叶绿体 B. OsGLO1和EcCAT基因以同一条DNA单链为模板链 C. 成功导入多基因表达载体的农杆菌对潮霉素和卡那霉素均有抗性 D. 成功导入目的基因的愈伤组织细胞的染色体上没有卡那霉素抗性基因 【答案】B 【解析】 【详解】A、由题意可知，叶绿体转运肽基因的功能是引导合成的蛋白质进入叶绿体，图中EcGCL和TSR基因分别与叶绿体转运肽基因连接，因此由EcGCL和TSR基因控制合成的酶会携带叶绿体转运肽，进而被引导进入叶绿体，A正确； B、启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，图中OsGLO1、EcCAT基因启动子的位置不同，因而，转录时以DNA的不同单链为模板，B错误； C、基因表达载体上的“潮霉素抗性基因”和“卡那霉素抗性基因”属于标记基因，用于筛选含载体的细胞。农杆菌转化法中，载体进入农杆菌后，农杆菌会携带这两个抗性基因，因此成功导入多基因表达载体的农杆菌对潮霉素和卡那霉素均有抗性 ，C正确； D、农杆菌转化法中，只有T - DNA区域的序列会整合到植物细胞的染色体DNA上。观察图示，“卡那霉素抗性基因”位于T - DNA区域之外，因此成功导入目的基因的愈伤组织细胞的染色体上没有卡那霉素抗性基因，D正确。 故选B。 15. 科研人员将ETS1基因中①②之间的片段（图1）切除，从而获得雌雄各一头系统性红斑狼疮（SLE）猪（亲本），并分别使用荧光标记的P1、P2、P3三种探针对两者的个体甲、乙、丙进行基因检测，结果如图2所示，相关基因用E/e表示。下列叙述错误的是（　　） A. 亲本雌雄猪的基因型分别为Ee、Ee B. 图2中Ⅰ、Ⅱ使用的探针分别是P2、P3 C. 只有的乙才是纯合SLE模型猪 D. 中含大条带与小条带的猪占1/2 【答案】B 【解析】 【详解】A、因e基因是E基因敲除部分外显子得到的，故大条带（分子量大）表示E基因，小条带（分子量小）表示e基因。亲本交配后子代出现不同条带组合，说明亲本都是杂合子，基因型均为Ee，A正确； B、据图1可知，P1与外显子1附近序列结合，P2与外显子6附近序列结合，P3与外显子12附近序列结合，E基因和e基因都含有外显子1和外显子12，所以探针P1、P3与E基因序列结合能形成大条带，与e基因序列结合形成小条带，而e基因因外显子6缺失无法与探针P2结合，图2-Ⅰ中甲只有大条带，丙有大条带和小条带，乙只有小条带，故甲、乙、丙的基因型分别为EE、ee和Ee，因此Ⅰ使用的探针为P1或P3，图2-Ⅱ中甲、丙只有大条带，乙无条带，故Ⅱ使用的探针为P2，B错误； C、乙的基因型为ee，该个体没有正常的基因，因而为纯合的SLE疾病模型猪，C正确； D、亲本基因型为Ee，的基因型理论比为EE∶Ee∶ee=1∶2∶1，故中含大条带与小条带的猪占1/2，D正确。 故选B。 16. 下列相关实验操作正确的是（ ） A. 在PCR实验中，用无菌水配制相关反应液置于微量离心管中 B. 将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 C. 接种室使用前，应在对其进行紫外线照射同时适量喷洒苯酚 D. 在微生物分离与计数实验中，常用蒸馏水对菌液进行梯度稀释 【答案】A 【解析】 【详解】A、PCR实验要求严格无菌，因此配制反应液应使用无菌水，A正确； B、酵母培养基煮沸可初步灭菌，为防止凝固，应在未完全冷却的情况下，在酒精灯火焰旁（无菌区）倒平板符合无菌操作规范，B错误； C、接种室消毒时，在照射前，适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果，C错误； D、微生物稀释需用无菌水进行梯度稀释，蒸馏水不是无菌水，可能含有细菌，会干扰计数，D错误。 故选A。 第II卷（非选择题） 二、综合题（5大题，共60分，请考生按要求作答问题） 17. 限制性核酸内切酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmBⅠ实现多DNA片段无缝连接的技术称为Golden Gate克隆，其过程如图2.请回答下列问题。 （1）由图1可知，BsmBⅠ酶切DNA中的________键，产生________（类型）末端。BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端________（填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。 （2）PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，其原因有________、________。过程②需要的酶有________。 （3）片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为________（接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列________（接头序列用小写字母表示）。 （4）据图1、2分析，GoldenGate克隆技术的优点有________。 a.不受天然酶切位点的限制 b.实现多片段一次性有序连接 c.有利于大片段DNA的高效连接 d.片段1~n之间不会引入外源序列实现无缝连接 【答案】（1） ①. 磷酸二酯 ②. 黏性 ③. 可能相同 （2） ①. 不同PCR反应的退火温度有差异 ②. 不同引物间会互补配对 ③. BsmBⅠ酶、DNA连接酶 （3） ①. 5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3' ②. 5'CGTCTCNgtgcTGTA……3' （4）abd 【解析】 【分析】基因工程中无缝克隆技术的相关知识，涉及到质粒的线性化、目的基因的扩增、酶的作用原理、重组质粒的导入和培养等内容。在基因工程中，质粒是常用的载体，通常为环状双链DNA分子。线性化质粒意味着将环状的质粒打开，形成线性结构。 【小问1详解】 限制性核酸内切酶切割的是DNA中的磷酸二酯键。由图1可知，BsmBⅠ切割后产生的是黏性末端。因为其识别序列及切割位点位于接头序列两侧，如果接头序列相同切割后产生的两个末端是相同的，如果接头序列不相同切割后产生的两个末端是不相同的，所以BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端可能相同。 【小问2详解】 PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，一方面是因为不同片段长度不同，PCR反应条件（如退火温度等）可能不同，在同一体系中难以同时满足；另一方面，不同片段的引物都含有BsmBⅠ识别序列，不同引物之间可能会互补配对，影响PCR的进行。过程②是将片段与质粒连接形成重组质粒，需要的酶是限制酶（BsmBⅠ酶）和DNA连接酶。 【小问3详解】 据图可知片段1和片段2经PCR后需要连接在一起，即R1被切割后形成的黏性末端需和F2被切割后形成的黏性末端互补，据图1可知，限制性核酸内切酶BsmBⅠ切割后的黏性末端为接头序列，由于R1序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列由识别序列和接头序列以及片段2部分序列组成，即5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3'。由R1序列可知本方案接头序列属于片段1的一部分，所以另一套方案中F2中的接头序列可以用片段二的一部分（前4个碱基）即5'CGTCTCNgtgcTGTA……3'，而R1则为5’CGTCTCNgcacCGACCAAAT…3’ 【小问4详解】 a、通过设计接头序列，可以在任意位置引入酶切位点，所以不受天然酶切位点的限制，a符合题意； b、从图2可以看出，多个片段可以一次性有序连接，b符合题意； c、该技术可以实现多片段的连接，有利于小片段DNA的高效连接，c不符合题意； d、片段1~n之间通过接头序列碱基互补原则连接，不会引入外源序列实现无缝连接，d符合题意。 故选abd。 18. 对香豆酸（p-HCA）是多酚和黄酮类化合物生物合成中的关键前体，但即使是低浓度的p-HCA也会抑制酵母菌的生长。开发特异性响应p-HCA的生物传感器，可以实现根据细胞内p-HCA水平自主、精确地调节基因表达。回答下列问题： （1）研究者通过PCR技术构建融合启动子（图1），此过程对扩增基因的引物的设计要求是_______，经过该设计，PCR扩增后的产物末端可通过_______结合，再经_______酶的延伸作用可完成融合。 （2）图2是p-HCA生物传感器，据图可知，p-HCA与PadR蛋白结合后，其构象发生改变，无法与中的片段结合，EGFP基因得以表达。据此推测，在中插入基因的目的是___________。 （3）为检测上述生物传感器对酚酸（p-HCA及其类似物CA）的灵敏度和特异性，研究者进行了相关实验，结果如图3所示。 注：为荧光强度与菌液浓度的比值，反映传感器的响应程度，比值越大则响应程度越高。 图3结果表明，该生物传感器具有的特性是_______，依据是_______（从“灵敏度”或“特异性”角度分析，答1点即可）。 （4）番茄红素为红色色素，其生物合成过程如图4所示。 利用上述生物传感器的调控功能，在该设计中，研究者开发了一种基于颜色的构建重组生产菌株的方法：无p-HCA时，菌落不呈现红色而呈现浅黄色或白色；高p-HCA时菌落呈红色。已知野生型酵母菌可将FPP用于合成细胞膜，但不会合成番茄红素，则该方法的设计思路是_______。 【答案】（1） ①. 扩增BS1基因的引物需包含一段与启动子中间插入区域序列互补的重叠区 ②. 碱基互补配对 ③. 耐高温的DNA聚合 （2）使成为PadR蛋白的靶序列，通过PadR与BS1的结合或解离，实现对下游EGFP基因的“开关”调控 （3） ①. 具有良好的灵敏度 ②. 随着p-HCA浓度升高，传感器的响应程度显著提升（或：具有良好的特异性图中显示该生物传感器对p-HCA有明显响应，而对CA几乎无响应，说明其仅针对特定酚酸产生反应，具有良好的特异性） （4）将含生物传感器质粒中的EGFP基因替换成酶E基因，将酶B和酶I基因插入另一个质粒中，并将此两种质粒导入野生型酵母菌株 【解析】 【分析】基因工程的基本操作程序为四步核心流程，按顺序依次为： 1. 目的基因的获取：从生物基因组中分离/通过PCR扩增/人工合成目标基因。 2. 基因表达载体的构建：将目的基因与运载体（质粒/噬菌体等）用限制酶和DNA连接酶拼接，形成重组DNA，是核心步骤。 3. 将目的基因导入受体细胞：通过农杆菌转化法/显微注射法/感受态细胞法等，将重组DNA导入宿主细胞。 4. 目的基因的检测与鉴定：分子水平检测（DNA分子杂交/PCR/抗原-抗体杂交）+ 个体水平鉴定，验证目的基因是否导入、转录、表达及产生性状。 【小问1详解】 要将BS1插入Pccw12中间，需让BS1引物携带与Pccw12插入位点序列互补的重叠区，保证片段能定向拼接。PCR产物末端的互补重叠区可通过碱基互补配对结合，为拼接提供基础。耐高温的DNA聚合酶的延伸活性可将结合后的片段连接为完整的融合启动子。 【小问2详解】 BS1基因是PadR蛋白的结合位点，将其插入PCCW12后，PadR可通过结合BS1抑制下游基因表达；当p-HCA与PadR结合使其构象改变时，PadR脱离BS1基因，下游基因即可表达，从而实现对基因表达的可控调控。在中插入基因的目的是使成为PadR蛋白的靶序列，通过PadR与BS1的结合或解离，实现对下游EGFP基因的“开关”调控。 【小问3详解】 在灵敏度方面，该生物传感器对p-HCA具有良好的灵敏度，且随着浓度的升高，传感器的响应程度显著升高；在特异性方面，该生物传感器具有底物特异性，仅对p-HCA产生响应，对CA无明显响应。 【小问4详解】 酶E是番茄红素合成的关键起始酶，EGFP是原生物传感器的荧光报告基因，将EGFP基因替换为酶E基因后，生物传感器可通过p-HCA的浓度调控酶E的表达，使番茄红素合成的启动受生物传感器的精准调控；将酶B基因和酶I基因插入另一个质粒，可补充番茄红素合成通路的后续关键酶，确保酶E催化生成的GGPP能继续经酶B、酶I的催化，完整合成番茄红素；将两种质粒导入野生型酵母菌后，让菌株同时获得“生物传感器调控的酶E”与“后续合成酶B、酶I”，使菌株能在生物传感器的调控下合成并积累番茄红素（呈现红色），从而通过颜色筛选重组生产菌株。在该设计中：无p-HCA时，PadR阻遏酶E基因表达，菌落不呈现红色（而呈现浅黄色或白色），而高p-HCA则可解除PadR阻遏，酶E基因表达，合成番茄红素的菌落呈红色。菌落颜色的深浅可以直接反映胞内p-HCA的产量，这一策略使得研究人员能够通过肉眼观察菌落颜色，快速筛选高产菌株。 19. 土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，通过全基因关联分析，科研人员定位了一个盐碱响应通路中的关键基因AT1，为研究高粱植株中AT1的作用，研究人员拟构建AT1过表达植株(AT1-OE)和AT1基因敲除植株(AT1-KO)。 （1）构建AT1-OE植株：以高粱cDNA为模板，通过PCR获取目的基因。将AT1基因插入Ti质粒的___________片段中，将重组质粒转入农杆菌与高粱愈伤组织共培养，筛选后经___________(填生理过程)获得完整植株。 （2）构建AT1-KO植株：以图1中AT1基因的上、下游片段构建重组质粒(图2)，然后通过同源重组(重组质粒中的上、下游片段分别与高粱基因组中AT1基因上、下游片段配对，并发生交换)敲除高粱植株中的AT1基因。具体构建过程如下： 注：HindⅢ、NotI标注的位点为各限制酶的识别位点 ①以高粱基因组DNA为模板，选择引物___________进行PCR扩增，用限制酶___________对PCR产物进行酶切后电泳，结果如图3.回收片段___________(填字母)，再与HindⅢ酶切后的质粒大片段连接，获得重组质粒。 ②将重组质粒转入高粱愈伤组织，将愈伤组织置于含___________的平板上初步筛选，最终获得高粱植株。 ③初步鉴定：提取高粱植株的核DNA，选择引物1和引物4进行PCR，若电泳获得___________条条带，则对应植株为AT1基因敲除杂合子，通过自交获得敲除纯合子。 （3）检测植株在盐碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株___________，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在盐碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 【答案】（1） ①. T-DNA ②. 再分化 （2） ①. 1和4 ②. NotI和HindⅢ ③. b和c ④. 潮霉素 ⑤. 2##二 （3）幼苗长势好、作物产量高 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【小问1详解】 构建AT1-OE 植株：若最终需要将目的基因整合到植物染色体上，则需要将AT1 基因插入Ti 质粒的T-DNA上，因为Ti质粒上的T-DNA可以转移到宿主细胞的染色体DNA上，因此应将重组质粒导入农杆菌；将重组质粒转入农杆菌与高粱愈伤组织共培养，筛选后经再分化得到完整植株。 【小问2详解】 ①以高粱基因组DNA为模板，选择引物1和4进行PCR扩增，获得AT1基因及其上、下游片段；据图2可知，用Not Ⅰ和Hind Ⅲ对PCR产物进行酶切后电泳，可得到三种不同大小的片段，上游片段、下游片段和AT1基因片段。根据片段大小，回收片段b(下游片段)和c(上游片段)，再与Hind Ⅲ酶切后的质粒大片段连接，获得重组质粒。 ②将重组质粒转入高粱愈伤组织，将愈伤组织置于含潮霉素的平板上初步筛选，最终获得高粱植株。 ③选择引物1和引物4进行PCR，若高粱为杂合子，则应有两条条带(2.7 kb和1.1 kb)。 【小问3详解】 因ATI在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用，故敲除后应表现为幼苗长势好、作物产量高。 20. SUMO蛋白具有抗蛋白酶水解的特性，常作为标签与靶蛋白融合，用于提高靶蛋白的性能。抗菌肽是一类具有抗菌作用的小分子多肽，可破坏细菌的细胞膜结构，导致细菌裂解。研究人员将SUMO基因和抗菌肽Cec4a基因进行融合并表达重组抗菌肽，使抗菌肽Cec4a加上SUMO标签，部分流程如图所示。 注：AUG是起始密码子，UGA是终止密码子。HindⅢ、BamHI和EcoRI均表示限制酶。请回答： （1）SUMO基因和抗菌肽Cec4a基因可用_______酶进行连接。为确保融合基因成功表达出重组抗菌肽，需要对SUMO基因②处的序列进行改造，原因是_________________。 （2）构建重组质粒时，目的基因和质粒应选用限制酶_______处理。 （3）研究人员分别用SUMO-Cec4a融合蛋白（甲组）和抗菌肽Cec4a（乙组）进行抗细菌实验，结果发现：短时间内甲乙两组的细菌裂解率接近，但随时间推移，甲组细菌裂解率逐渐高于乙组，其原因是__________________。 （4）为进一步提高抗菌肽的抗菌性能，研究人员在Cec4a的基础上通过AI技术设计了一款更高效的抗菌肽Cec4a-1。二者的部分氨基酸序列见下表： 抗菌肽 部分氨基酸序列 Cec4a ……GWLKKIGKKIERVGQNTR……KGK Cec4a-1 ……GWLKKIGKKIERVGQNTR……KGN 注：一种字母表示一种氨基酸，两者相同位置……处的氨基酸序列相同。 研究人员拟使用蛋白质工程生产抗菌肽Cec4a-1。他们通过设计引物并利用PCR扩增技术将Cec4a基因改造成Cec4a-1基因，请写出基因的改造思路：________________。 【答案】（1） ①. DNA连接 ②. 基因②处序列对应mRNA上的终止密码子， 如果不改造该序列，翻译会在终止密码子处停止，不会得到融合蛋白 （2）HindIII和BamHI （3）短时间内SUMO-Cec4a融合蛋白和Cec4a都未被蛋白酶水解，抗菌活性接近；随时间推移，Cec4a逐渐被蛋白酶水解，裂解细菌的效率降低，而SUMO-Cec4a融合蛋白具有抗蛋白酶水解特性，仍能正常发挥作用 （4）根据抗菌肽Cec4a-1末端的N氨基酸所在序列对应的碱基序列合成一种引物，利用该 引物和另一端的引物以Cec4a基因为模板进行 PCR扩增可获得Cec4a-1基因 【解析】 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品的技术。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【小问1详解】 DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，形成磷酸二酯键，SUMO基因和抗菌肽Cec4a基因可通过DNA连接酶连接起来，基因②处序列对应mRNA上的终止密码子， 如果不改造该序列，翻译会在终止密码子处停止，不会得到融合蛋白为确保融合基因成功表达出重组抗菌肽，故需要对SUMO基因②处的序列进行改造。 【小问2详解】 目的基因需要插在启动子和终止子之间，所以需要用HindIII和BamHI处理目的基因和质粒，确保目的基因与载体定向拼接。 【小问3详解】 由于短时间内SUMO-Cec4a融合蛋白和Cec4a都未被蛋白酶水解，抗菌活性接近；随时间推移，Cec4a逐渐被蛋白酶水解，裂解细菌的效率降低，而SUMO-Cec4a融合蛋白具有抗蛋白酶水解特性，仍能正常发挥作用，导致短时间内甲乙两组的细菌裂解率接近，但随时间推移，甲组细菌裂解率逐渐高于乙组。 【小问4详解】 根据抗菌肽Cec4a-1末端的N氨基酸所在序列对应的碱基序列合成一种引物，利用该引物和另一端的引物以Cec4a基因为模板进行 PCR扩增可获得Cec4a-1基因，即可以将Cec4a基因改造成Cec4a-1基因。 21. β—防御素是由S基因编码的一种免疫蛋白，在人体的免疫反应中发挥着重要作用。但是重组酵母中S基因的表达水平低，因此科研人员构建了S基因多拷贝的表达载体，将其转入酵母菌中获得重组菌株，实现了S基因的高表达，载体构建流程如图所示。KEX2蛋白酶能够专一性地识别并切割赖氨酸—精氨酸（对应的密码子分别是AAA、AGA）双碱性氨基酸的羧基端肽键，确保目标蛋白的正确加工和释放。 注：5，AOX1：甲醇诱导型启动子；3，AOX1：终止子；zeocin：博来霉素抗性基因 α-factor：α-信号肽序列，表达的信号肽能引导与其融合的蛋白移动到内质网，信号肽被切除后蛋白才能分泌到细胞外；限制酶及其识别序列： sacⅡ5′—GAGCT↓C—3′ BglⅡ5′—A↓GATCT—3′ XhoⅠ5′—C↓TCGAG—3′ XbaⅠ5′—T↓CTAGA—3′ BamHⅠ5′—G↓GATCC—3′ S基因编码序列：5′ATGCAGTAC……CGGTCTTAG3′ （1）为保证S基因和载体正向连接，并使酵母细胞分泌出β—防御素，利用PCR技术对S基因进行扩增时，使用的S基因的上游引物序列应为5′_______（写出15个碱基）3′，该引物的作用有_______。 （2）S基因表达盒能与只用BamHⅠ酶切后的P—S1质粒连接获得P—S2质粒（含2个拷贝S基因表达盒的P质粒），从限制酶的角度分析，两者能够连接的原因是_______。再利用P—S2质粒重复以上操作获得P—S4质粒（含4个S基因表达盒的P质粒）。用BamHⅠ和BglⅡ双酶切P—S4质粒，可获得长度为_______的DNA片段。 （3）在荧光定量PCR实验中，随着PCR反应的进行，产物不断累积，荧光信号也逐渐增强。当荧光信号达到预设的阈值时，此时所对应的循环数即为CT值。提取分别导入P—S1、P—S、P—S4质粒的酵母细胞的DNA进行荧光定量PCR扩增S基因，则CT值最小的是导入_______的酵母细胞。 （4）为筛选出转化成功的酵母细胞并获取β—防御素，应该在含有_______的培养基中进行培养。 （5）与大肠杆菌相比，酵母作为S基因的受体细胞的优势是_______。 【答案】（1） ①. CTCGAGAAAAGAATG ②. 引入酶切位点；引入KEX2蛋白酶的切割位点；使DNA聚合酶能够在引物的3’端连接脱氧核苷酸 （2） ①. BamHⅠ 和 BglⅡ 切割后产生相同的黏性末端（-GATC-） ②. 6684bp和2000bp （3）P—S4 质粒 （4）博来霉素和甲醇 （5）酵母菌含有内质网和高尔基体，能够对多肽链进行正确的加工并分泌到细胞外 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取方法有：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：1检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--PCR技术;2检测目的基因是否转录出了mRNA--PCR技术；3检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 引物设计要考虑与目的基因上游序列互补配对，且要保证正确连接和分泌。根据图示位置，sacⅡ在质粒上存在两个酶切位点，不能选用；S基因要导入P-S1质粒，需要用限制酶XhoI和XbaI切割，PCR扩增S基因时，上游引物应添加限制酶XhoI的识别序列，同时a-factor 能引导蛋白分泌，这过程需要KEX2蛋白酶能够专一性地识别并切割赖氨酸-精氨酸（对应的密码子分别是AAA、AGA）双碱性氨基酸的羧基端肽键，确保目标蛋白的正确加工和释放，因 此PCR扩增目的基因时还需要再引物上添加AAAAGA的碱基序列，剩余引物的碱基序列需要与S基因已知序列碱基互补配对，则使用的S基因的上游引物序列应为5'-CTCGAGAAAAGAATG-3'（写出15个碱基）。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，从而引导子链的合成，同时引入酶切位点;引入KEX2蛋白酶的切割位点 。 【小问2详解】 BamHI和BglⅡ切割DNA后产生的黏性末端相同（BamHI切割产生的黏性末端是-GATC，BglI切割产生的黏性末端也是-GATC），所以S基因表达盒能与只用BamHI酶切后的P-S1质粒连接。P-S4质粒含4个S基因表达盒，S基因表达盒长度为1671bp。用BamHI和BglⅡ双酶切，会切下4个S基因表达盒的片段，长度为 1671×4=6684bp。同时还有BamHI和BglⅡ之间的另一个片段，这片段的长度是5342-1671×2=2000bp。 【小问3详解】 P-S4质粒含S基因的拷贝数最多，进行荧光定量PCR扩增S基因时，达到预设阈值所需的循环数（CT值）最小。所以CT值最小的是导入P-S4质粒的酵母细胞。 【小问4详解】 P质粒中含有Zeocin（博来霉素抗性基因），为筛选出转化成功的酵母细胞，应该在含有博来霉素的培养基中进行培养，同时为了获得β-防御素，还需要在培养基中添加甲醇以诱导S基因的表达。 【小问5详解】 与大肠杆菌相比，酵母作为真核生物，有内质网和高尔基体等细胞器，能对蛋白质进行加工和修饰，更有利于β-防御素这种分泌蛋白的正确加工和分泌。 第1页/共1页 学科网（北京）股份有限公司 $