第三章 第2节 基因工程的基本操作程序-【创新教程】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程五维课堂同步课件PPT（人教版）

该高中生物学课件聚焦基因工程基本操作程序，涵盖目的基因获取、表达载体构建等核心知识点，通过课标内容要求与核心素养对接导入，以教材梳理、实验操作（如PCR扩增、电泳鉴定）和课时练习为支架，构建“理论-实践-应用”的知识脉络。 其亮点在于融合科学思维与探究实践，通过对比表格（如DNA复制与PCR比较）、互动探究（如引物设计讨论）及实验步骤详解（如感受态细胞法操作），培养学生分析与动手能力。教师可依托系统资源提升教学效率，学生能在实践中深化对基因工程原理的理解。

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科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计 ◆[基础梳理] 1．基因工程的基本操作程序 (1)基因工程的操作步骤 ①eq \x(获取目的基因)—eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\co1(a.从　基因文库　中获取,b.利用　PCR　技术扩增,c.通过化学方法人工合成)) ②eq \x(\a\al(基因表达载,体的构建))—组成eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\co1(a.目的基因,b.　启动子　,c.终止子,d.　标记基因　)) ③eq \x(\a\al(将目的基因,导入受体细胞))—方法eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\co1(a.植物：　农杆菌转化法　、,　基因枪法、　花粉管通道法　,b.动物：　显微注射　技术,c.微生物：感受态细胞法)) ④eq \x(\a\al(目的基因的,检测与鉴定)) eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\co1(a.利用　DNA分子杂交　技术检测,　目的基因的有无,b.利用　分子杂交　技术检测,　目的基因的转录,c.利用　抗原—抗体杂交　技术检测,　目的基因的翻译,d.利用　个体生物学水平　的鉴定检测,　重组性状的表达)) (2)目的基因导入不同受体细胞的过程 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法 受体细胞 　体细胞或受精卵　 　受精卵　 　原核细胞　 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 实验原理 (1)扩增原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够　自动调控温度　的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 (2)电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷　相反　的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为　300_nm　的紫外灯下被检测出来。 实验过程 (1)扩增DNA片段 ①用微量移液器按照下栏中的配方或试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 PCR反应体系的配方： 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL 20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL 20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL 20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL H2O 28～33 μL 1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U 模板DNA 5～10 μL 总体积 50 μL 注：模板DNA的用量为1 pg～1 μg。 ②待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。 ③参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序　变性　　　　　复性　　　延伸 预变性 94 ℃，5 min / / 30次　　 94 ℃，30 s　 55 ℃，30 s　72 ℃，1 min 最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min (2)扩增DNA片段的电泳 ①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖　熔化　。稍冷却后，加入适量的　核酸　染料混匀。 ②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ③待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入　电泳槽　内。 ④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。 ⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 ⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近　凝胶边缘　时，停止电泳。 ⑦取出凝胶置于　紫外灯　下观察和照相。 ◆[基础诊断] (1)基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。( × ) (2)启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用。( × ) (3)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。( × ) (4)将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。( √ ) (5)农杆菌感染植物的机理：Ti质粒上的T－DNA可转移到植物受伤细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起。( √ ) (6)从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。( × ) 疑难点一　利用PCR获取和扩增目的基因 1．PCR的过程 温度控制 目的 循 环 变性 ↓ 复性 ↓ 延伸 90～95℃ 使双链DNA解聚为单链 50℃左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 70～75℃ 在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 2.PCR扩增的计算：理论上DNA呈指数扩增 (1)若开始只有一个DNA 提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为2n个。 (2)若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。 3．PCR技术与DNA复制的比较 项目 DNA复制 PCR技术 区 别 解旋 方式 解旋酶催化 DNA在高温作用下变性解旋 场所 细胞内(主要在细胞核内) 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 酶 DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等 耐热的DNA聚合酶 区 别 温度 条件 细胞内的温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 合成的 对象 DNA分子 DNA片段或基因 联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成； ②原料：均为四种脱氧核苷酸； ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化； ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 ◆[互动探究] 聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，请回答下列问题： 1．PCR的原理、前提分别是什么？ 提示：原理：DNA双链复制的原理。 前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。 2．PCR过程中设计引物时引物碱基间能否互补？ 提示：引物需要分别与模板DNA分子的每一条单链互补，引物间不能互补配对。 3．PCR过程中若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则变性时间会怎样？ 提示：若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则DNA分子中的氢键增多，破裂氢键需要能量增多，变性时间会延长。 4．PCR的复性中引物是不是一定与DNA模板结合？ 提示：复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。 ◆[对点训练] 1．下列对PCR过程的叙述中，不正确的是(　　 ) A．PCR过程中DNA解旋所需的温度最高 B．一次循环可使目的基因的数量增加一倍 C．需要耐高温的DNA聚合酶 D．需要耐高温的解旋酶 解析：D　[PCR过程中DNA解旋所需的温度最高(90℃以上)，A正确；PCR过程中DNA数量呈指数增长，所以一次循环可使目的基因的数量增加一倍，B正确；PCR反应需要高温使DNA变性解旋，所以要用耐高温的DNA聚合酶，C正确；PCR过程中，DNA双链的解开不需要解旋酶，是利用高温使其变性解旋，D错误。] 2．新型冠状病毒的检测可以采用实时荧光RT－PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT－PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是(　　 ) A．过程①以mRNA为模板合成单链DNA B．过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要n个引物B C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 D．游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接 解析：B　[过程①是由mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，A正确；决定实时荧光RT－PCR扩增片段的是引物；过程②、③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测，C正确；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接，D正确。] 疑难点二　基因表达载体的构建 基因表达载体的构建步骤 目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。其过程大体为：用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同一种限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成重组DNA分子(重组质粒)(如图)。 (1)目的基因是指编码蛋白质的基因，其没有启动子，若只将目的基因导入受体细胞中将无法进行转录。 (2)目的基因的表达需要调控序列，因而在载体质粒的插入基因上游需要有启动子，下游需要有终止子。 (3)筛选导入目的基因的受体细胞需要有筛选标记——标记基因。因此，一个基因表达载体的组成应该包括：启动子、终止子、目的基因、标记基因等。 ◆[互动探究] 1．构建基因表达载体的目的是什么？ 提示：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 2．标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？ 提示：标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常见的标记基因为抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因。 3．为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？ 提示：标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。 ◆[对点训练] 1．下列有关基因表达载体构建的说法，错误的是(　　 ) A．基因表达载体的构建是实施基因工程的核心 B．构建基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，并且使目的基因能够表达和发挥作用 C．启动子存在于基因的编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动转录 D．标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因 解析：C　[基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。构建基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子存在于基因的非编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录，最终翻译出蛋白质。载体上标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因。所以只有C项是错误的。] 2．图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是(　　 ) A．在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，则可选EcoRⅠ B．如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRⅠ酶切点有1个 C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理 D．一个图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团 解析：B　[目的基因两侧都有，且质粒也有的限制酶是EcoRⅠ，所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，可选EcoRⅠ，A正确；如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRⅠ酶切点有2个，B错误；为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理，C正确；一个图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，产生两个黏性末端，含有2个游离的磷酸基团，D正确。] ◆[易错警示] 启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 疑难点三　将目的基因导入受体细胞 1．常用的转化方法 受体细 胞类型 方法 说明 特点 植物 细胞 农杆菌 转化法 将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上→目的基因表达 经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物 植物 细胞 花粉管 通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达 简便、经济，我国科学家独创的一种方法 动物 细胞 显微注 射技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物 将目的基因导入动物细胞最为有效的方法 微生物 细胞 Ca2＋处 理法(感 受态细 胞法) 用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子 简便、经济、有效 2.农杆菌转化法分析 (1)构建基因表达载体需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。 (2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，有利于重组质粒的导入。 (3)由导入目的基因的受体细胞培育出完整的植株要用到植物组织培养技术。 [特别提醒]　 (1)将目的基因导入植物细胞培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞和受精卵，因为植物体细胞具有全能性。 (2)将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞是受精卵，不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。 ◆[互动探究] 转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。将目的基因导入受体细胞是实现转化的必要环节。请回答下列问题： 1．将目的基因导入植物细胞的方法主要有哪两种？其中最常用的是哪种？我国科学家独创的方法是哪种？ 提示：农杆菌转化法、花粉管通道法。农杆菌转化法最常见。我国科学家独创的方法是花粉管通道法。 2．农杆菌Ti质粒有何特点？ 提示：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 3．基因工程常用原核生物作为受体细胞的原因是什么？其中以哪种生物最为广泛？ 提示：原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。大肠杆菌应用最为广泛。 ◆[对点训练] 1．在基因工程中，将目的基因导入不同的受体细胞使用的方法不同，下列叙述错误的是(　　 ) A．将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 B．将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法 C．将目的基因导入植物细胞常用的受体细胞是受精卵 D．将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法 解析：C　[将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，A正确；将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，B正确；将目的基因导入植物细胞常用的受体细胞是体细胞，将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵，C错误；将目的基因导入微生物细胞常用感受态转化法，即钙离子处理法，D正确。] 2．如图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是(　　 ) A．过程A需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与 B．过程B通常需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞壁的通透性 C．过程C需要采用植物组织培养技术 D．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达 解析：C　[图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，而不需要DNA聚合酶，A错误；CaCl2处理只能提高农杆菌细胞的细胞壁的通透性，B错误；过程C为由植物细胞得到完整植株的过程，一般要采用植物组织培养技术，C正确；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，D错误。] ◆[知识归纳] 植物和动物受体细胞的区别 (1)将目的基因导入植物细胞培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞和受精卵，因为植物体细胞具有全能性。 (2)将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞是受精卵，不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。 1．转基因动物转基因时的受体细胞是(　　 ) A．受精卵　　　　　　 B．精细胞 C．卵细胞 D．体细胞 解析：A　[由于受精卵的全能性最高，并且能够发育成完整个体，因此转基因动物转基因时的理想的受体细胞是受精卵，A正确；动物的精细胞不能发育成完整个体，因此不用做基因工程的受体细胞，B错误；只有少数动物的卵细胞能够发育成个体，因此不用做基因工程的受体细胞，C错误；由于体细胞的全能性受到限制，因此不用做基因工程的受体细胞，D错误。] 2．关于基因工程的操作步骤，正确的是(　　 ) ①将目的基因导入受体细胞　②目的基因与运载体结合　③提取目的基因　④目的基因的检测与鉴定 A．③①②④ B．②③①④ C．①③④② D．③②①④ 解析：D　[基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的筛选和获取②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测与鉴定。] 3．微生物常被用于基因工程中。下列相关叙述正确的是(　　 ) A．从耐热的细菌中获取PCR所需的DNA连接酶 B．大肠杆菌、酵母菌等是基因工程常用的载体 C．作为运载体细菌质粒需具有合成抗生素的基因 D．常利用土壤农杆菌将目的基因导入植物细胞 解析：D　[从耐热的细菌中获取PCR所需的DNA聚合酶，即热稳定的DNA聚合酶，A错误；大肠杆菌、酵母菌等是基因工程常用的受体细胞，基因工程常用的运载体有质粒、 λ噬菌体的衍生物、噬菌体的衍生物、动植物病毒，B错误；作为运载体细菌质粒不一定需具有合成抗生素的基因，含有荧光等标记基因的质粒也能作为运载体，C错误；将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，D正确。] 4．如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是(　　 ) A．荧光蛋白基因 B．启动子 C．限制酶 D．DNA连接酶 解析：B　[基因表达载体由启动子、终止子、标记基因和目的基因组成。图中有终止子、标记基因(抗生素基因)、目的基因(插入的基因)、复制原点等，还缺少启动子，且启动子位于目的基因的首端，所以X最可能是启动子。] 5．科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如下图所示。根据题意，回答下列问题： (1)基因工程的基本操作程序主要包括的四个步骤是：　____________________　、　__________________　、 　____________________　、　____________________　。 (2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用T－DNA　________________________________________　的特点。 (3)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为　________　。 (4)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是　________________　。 (5)目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是　________________________________________　。 解析：农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法，利用它能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，以及其Ti质粒上的T－DNA能转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上的特点，可以把目的基因插入其Ti质粒的T－DNA中，借助其作用使目的基因成功导入受体细胞。 答案：(1)目的基因的筛选和获取　基因表达载体的构建　将目的基因导入受体细胞　目的基因的检测与鉴定　(2)可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上　(3)转化　(4)农杆菌转化法　(5)目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上 $