2026届高三生物一轮复习基础知识读背学案—基因工程

3.1重组DNA技术的基本工具读背学案（划线的内容必背） 基因工程(重组DNA技术)（1）原理：基因重组 （2）优点：克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物的遗传性状 （3）理论基础：①不同生物的基因为什么能拼接？答:基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同 ②目的基因为什么能在受体细胞中表达？ 答：生物遗传信息的传递都遵循中心法则;生物界共同一套遗传密码 一、分子手术刀——限制性内切核酸酶 1.来源：主要从原核生物中分离纯化出来 2.作用（特异性）：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个 核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 3.切割结果：产生黏性末端、平末端 思考：①限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 答：切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 ②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 答：原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 ③为什么切割含目的基因的片段和载体要选用同种限制性内切核酸酶或同尾酶？ 答：选用同种限制性内切核酸酶或同尾酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。（同尾酶:识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶。） ④在实际的基因工程操作时往往用两种限制性内切核酸酶分别切割含目的基因的DNA两端以及载体，这样做有什么好处？ 　答：防止质粒和目的基因自身环化或反向连接 二、分子缝合针——DNA连接酶 1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 2.种类： ①E.coliDNA连接酶:分离自大肠杆菌,能连接黏性末端和平末端,连接平末端的效率远远低于T4 DNA连接酶。 ② T4 DNA连接酶：分离自T4噬菌体，能连接黏性末端和平末端 三、分子运输车——基因进入受体细胞的载体 1.载体的种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子。基因工程中真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 2.载体的必要条件：①具一个或多个限制酶切点，供外源DNA片段(基因)插入； ②能在细胞中自我复制，或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制，使目的基因同步复制并能在受体细胞中稳定存在； ③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选；  ④必须是安全的，对受体细胞无害。 3. 作用：①作为运载工具，将外源基因导入受体细胞中；②在受体细胞内对外源基因进行大量复制。 4、 DNA的粗提取与鉴定 1. 实验原理： （1）提取DNA的原理：DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进行分离。 （2）DNA的鉴定原理：DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色（沸水浴加热）。 2.方法步骤： （1）研磨：称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10ml研磨液，充分研磨。 （2）过滤或离心取上清液：①在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。②或直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中 （3）加酒精，搅拌或离心得DNA：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。①用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。 ②或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干 （4） 鉴定：取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 四、几种相关酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 将双链DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链 RNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端 第2节 基因工程的基本操作程序 读背学案 培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建（核心）、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 1、 目的基因的筛选与获取 1.目的基因的获取方法：人工合成目的基因、利用PCR获取和扩增目的基因、从基因文库中获取。 （1）PCR的概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 （2）PCR的反应条件及作用 参与的组分或条件 作用 高温 使DNA解旋，打开DNA双链 DNA模板（DNA母链） 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 （耐高温的）DNA聚合酶 催化DNA子链的合成 2种引物 （一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的单链核酸，通常长度为20-30个核苷酸） 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 缓冲溶液 提供合适的酸碱度和离子（如添加Mg2+可以激活DNA聚合酶的活性） （3）PCR反应过程：每次循环分为变性、复性、延伸三步。该过程在PCR扩增仪中自动完成 变性：温度超过90°C时，DNA解聚为单链 ↓ 复性：温度下降到50°C左右，引物通过碱基配对与两条单链DNA结合 ↓ 延伸：温度上升到72°C左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基补配对原则合成新的DNA链 （4）PCR反应结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。 （5）PCR反应产物鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳 【思考】：（1）用PCR可以扩增mRNA吗？ 答：mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增 （2）设计引物时，引物自身不能有碱基互补配对的序列：避免引物自连，不能得到目的产物。 （3）设计引物时，两引物之间不能有碱基互补配对的序列：防止两引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率。 （4）PCR扩增循环n次共消耗引物2n+1-2个（2n-1对） 二、基因表达载体的构建（基因工程的核心） 1． 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。  2、基因表达载体的组成 包括：启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点 【注意】1、目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。 2、启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别 位置 作用 启动子 目的基因的上游 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 起始密码子 mRNA首端 翻译的开始 终止子 目的基因的下游 终止转录 终止密码子 mRNA尾端 翻译的结束 三、将目的基因导入受体细胞 1、导入植物细胞 （1）花粉管通道法（我国科学家独创） （2）农杆菌转化法： ①转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 ②农杆菌特点： a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 C.农杆菌转化法的过程：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 （2）导入动物细胞 ①方法：显微注射 ②常用受体细胞：受精卵（具有发育的全能性，很容易发育成动物个体） （3）导入微生物细胞 ①受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌) ②方法：Ca2＋处理法 用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 ③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、易于培养等 4、 目的基因的检测与鉴定（检查基因工程是否成功的一步） （1）分子水平的检测： ①通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA； ②从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译成蛋白质。 （2） 个体生物学水平的鉴定： 例如，采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫的存活情况，来确定抗虫棉的抗虫程度。 【探究.实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、原理 1.DNA体外扩增的原理 PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 2.DNA片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 二、扩增DNA片段的电泳 ①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 ②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。 ⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 ⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 ⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 【注意】1、为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用之前必须进行高压灭菌处理。 2、 PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后放在冰块上缓慢融化。 3、 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。 【结果】DNA片段进行电泳鉴定的结果是1条条带 如果结果不止一条条带，原因可能的原因有：引物设计不合理、退火温度过低、DNA聚合酶的质量不好、它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体等 基因工程的应用 1. ★★乳腺生物反应器或乳房生物反应器：将药用蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需的药物，这个转基因生物称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器（药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的启动子）。 ①应用：在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。 ②缺点：受性别和是否处于泌乳期限制。优点：产量高、质量好、成本低、易提取。 2.为什么可以用猪的器官解决人体移植器官的来源问题？ 原因：①由于猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似 ②而且与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、导致人类疾病的病毒要少得多。 3.用转基因动物作器官移植的供体时，主要的问题是？应采取什么措施？ 实现这一目标的最大难题是免疫排斥。措施：①在器官供体的基因组中导入调控基因表达的DNA序列，以抑制抗原决定基因的表达②或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 4.基因工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。 应用：①构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产酶，获得的工业用酶纯度更高、生产成本低、生产效率高 ②培育“超级细菌”处理环境污染 5.利用转基因工程菌能否直接生产有生物活性的真核生物蛋白类药物？为什么？ 答：不能，因为细菌中只有核糖体，没有内质网和高尔基体等其他细胞器。 6.基因工程的局限性：原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 蛋白质工程 1.蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 概念 基础 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 手段 通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质 目的 获得满足人类生产和生活需求的蛋白质 目标 根据人们对蛋白质功能的特定需求对蛋白质结构进行分子设计 基本流程 预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 2.崛起缘由：①基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 ②天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 3.蛋白质工程为什么需直接改造基因，而不直接改造蛋白质？ 答：任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传的；蛋白质高级结构十分复杂，对基因进行改造比对蛋白质直接改造更容易操作，难度要小得多。 4.基因工程和蛋白质工程是否都遵循中心法则？为什么？ 答：都遵循中心法则。基因工程指导合成天然蛋白质的过程是遵循中心法则的；蛋白质工程操作时，经改造的基因表达所需要的蛋白质仍需遵循中心法则。 5.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？ 答：可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因，对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。 6.科学家对胰岛素进行改造是否要获得相应的目的基因？如何获得？ 答：要获得。应该以现有的胰岛素结构为基础，设计满足新功能需要的新结构，推测出相关的氨基酸序列，然后根据密码子找出相应的DNA序列，再进行人工合成得到目的基因。 生物技术的安全性和伦理问题 1.对微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域。原因：微生物具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等优点。 2.建立人类疾病的转基因动物模型的意义：模拟疾病的发生和发展过程，为研究该疾病的致病机制和开发治疗药物提供依据，如转基因小鼠1型糖尿病模型、转基因小鼠原发性高血压模型等。 3.防止基因污染：①将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播②目的基因导入线粒体或叶绿体DNA、受精时花粉中几乎只提供核基因、不提供目的基因。 4.转基因作为一项技术本身是中性的，由这项技术研发出来的产品需要经过一系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市。 5.生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。我国态度：坚决反对克隆人，不允许进行任何生殖性克隆人实验。四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。 6.治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。我国态度：对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。 7.设计试管婴儿：植入前对胚胎进行遗传学诊断。（指在将体外受精形成的胚胎植入母体前，根据人们的需要，将胚胎的细胞取出，进行特定基因的检测；当检测结果符合人们的需要时，再把胚胎植入母体。一般我们所说的试管婴儿技术，不必经过基因检测这一步骤。） 8.生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等，生物安全是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康以及生态环境所产生的危害或潜在风险。消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面。 9.与常规武器相比，生物武器的传播具有如下特点：传播途径多；传播方法简单，使用方便；传播时具有潜伏期。 学科网（北京）股份有限公司 $