2026届高三生物一轮复习课件：基因编辑技术及PCR

选择性必修3 一轮复习 第08讲 PCR及基因编辑技术 1 知识网络 第一部分 常规PCR技术的基本原理 发明者：PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。 一、常规PCR技术的基本原理 4 一、常规PCR技术的基本原理 (1)概念 PCR技术：PCR是__________________的缩写，是一项根__________________ 的原理，在_________提供参与DNA复制的_____________与_____________， 对__________________________进行______________的技术。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 ①全称：聚合酶链式反应 ②原理：DNA半保留复制 ③前提：一段已知目的基因的核苷酸序列。以便根据这段序列合成引物。 ④条件：模板DNA、一对引物（两种）、耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶)、4 种游离的脱氧核苷酸[dNTP](包括：dATP、dTTP、 dCTP、dGTP，作用：提供原料和能量) ⑤操作环境：体外（PCR扩增仪/PCR仪） ⑥目的：对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 ⑦优点：可以在短时间内大量扩增目的基因 ⑧鉴定：琼脂糖凝胶电泳技术 参与的组分 作用 前提条件 高温 模板DNA 游离的4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 引物 一定的缓冲溶液(Mg2＋) 打开DNA双链 提供DNA复制的模板（目的基因的两条链） 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链（形成磷酸二酯键），取自于水生栖热菌 使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 已知基因的部分核苷酸序列（目的基因做母链） 提供合适的酸碱度和离子，耐高温的DNA聚合酶需要Mg2＋激活 一、常规PCR技术的基本原理 (2)PCR技术所需要的条件及作用 类型 体内DNA复制 PCR 合成子链 一条链连续合成，另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接或两条链均连续合成 分别从两种引物的3′端开始延伸，都是连续合成 过程 循环次数 受生物体自身控制 一般要经历30次 产物 完整DNA 两种引物之间的DNA片段 温度 体内温和条件 需要在不同温度下进（90℃以上变性、50℃左右复性、72℃左右延伸） 边解旋，边复制 （有冈崎片段） 变性 复性 延伸 一、常规PCR技术的基本原理 (3)比较：体内DNA复制与PCR 类型 体内DNA复制 PCR 解旋方式（打开氢键） 解旋酶催化，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90℃以上高温解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 场所 主要在细胞核 PCR仪 延伸用酶（形成磷酸二酯键） DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） 使DNA聚合酶结合在引物的3’端，从而开始连接脱氧核苷酸（引物） 一小段RNA 通常是一小段DNA 时期 细胞分裂前的间期 人工控制，随时进行 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶 一、常规PCR技术的基本原理 (3)比较：体内DNA复制与PCR 类型 体内DNA复制 PCR 合成子链 一条链连续合成，另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接或两条链均连续合成 半保留复制，边解旋边复制，多起点复制，半不连续全链复制。 分别从两种引物的3′端开始延伸，都是连续合成，半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。（半保留全连续局部区域复制） 相同点 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原理均是半保留复制 ③原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ④引物:都需要引物，DNA合成方向都是从子链的5′端向3′端延伸（从引物的3’端合成子链） ⑤都需要在一定环境中进行，都需要能量，都有酶的参与，都遵循碱基互补配对原则 一、常规PCR技术的基本原理 (3)比较：体内DNA复制与PCR 一、常规PCR技术的基本原理 (4)PCR的基本过程 PCR过程包括　　　　、复性和　　　　三步  变性 延伸 过程 说明 图解 变性 当温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链   复性 当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合　   延伸 当温度上升到72 ℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链     一、常规PCR技术的基本原理 (4)PCR的基本过程 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。 引物与模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值，G、C含量高、长的引物，Tm较高，复性温度可设置的最值变大。提高PCR的特异性。复性温度应设置为略低于Tm值 变性温度的一般规律：DNA长度偏长、GC含量偏高、甲基化修饰程度偏高，变性时均需消耗更多能量，则变性温度上升，但高温长时间变性可能导致DNA断裂或酶失活。温度对酶的伤害会随时间和温度积累，为了保持PCR的扩增效率，在不影响结果的情况下，尽可能使PCR的时长缩短。 一、常规PCR技术的基本原理 (5)引物的选择 ①引物的本质是什么？ 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 ②细胞内DNA复制时是否需要引物？为什么？ 需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链，只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3′端，所以在延伸子链前，需要提前合成一小段RNA或DNA作为引物。 ③如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。（反向PCR除外） 一、常规PCR技术的基本原理 (5)引物的选择 ④利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ ❆DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，耐高温的DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，所以引物的碱基序列是不同的。两种引物都结合在DNA模板链的3′端，脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸，子链的延伸方向5’→ 3’ 5’-ACGATTAC······TCCGGATAA-3’（α链） 3’-TGCTAATG······AGGCCTATT-5’（β链） (引物1)5’-ACG-3’ 3’-ATT-5’（引物2） 引物扩增的方向→ ←引物扩增的方向 一、常规PCR技术的基本原理 (5)引物的选择 核心考点 1 引物应位于目的基因两侧，且能顺利扩增出目的基因 2 引物只能与母链的3'端结合。引物只能引导子链从5'端向3'端延伸   3 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，可在引物的5'端加上限制酶的识别序列， 且常在两种引物上设计不同的酶切位点，保证目的基因与载体的正向连接 4 (1)若扩增目的基因序列,则应选择图1中的引物乙、丙; (2)若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点,应设计一个引物与目的基因外部序列(即质粒序列)碱基互补配对,另一个引物与目的基因内部序列碱基互补配对,如图2所示的引物1、2。 一、常规PCR技术的基本原理 (6)引物的设计原则 ①引物设计需考虑的两个因素 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增高效性。 扩增 特异性 扩增 高效性 引物 ❆特异性：只扩增出目标DNA的特性 ❆高效性：单位时间内扩增产物的量 ✹特异性太强，扩增效率就会下降，提高 扩增效率，扩增特异性就会下降 过长会导致其延伸温度高，不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。引物短可与模板链多处进行碱基互补配对。 ③引物G-C含量要适宜 一、常规PCR技术的基本原理 (6)引物的设计原则 ②引物长度要适宜 一般在40%~60%之间，G-C含量过高或过低都不利于引发反应。 ④引物内部不能发生局部碱基互补配对（防止引物自身折叠），两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对（防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合） ❆碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物与模板的复性结合。 第1组：__________________________________________________________ 第2组：__________________________________________________________ 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效 一.目的基因的筛选与获取 (6)引物的设计原则 ④引物内部不能发生局部碱基互补配对（防止引物自身折叠），两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对（防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合） 一、常规PCR技术的基本原理 (6)引物的设计原则 ⑤引物5'端可以修饰，3'端不可修饰，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点。 ❆引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列，引入启动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。在基因工程中，两种引物的5’端添加不同的限制酶的识别序列，以确保目的基因与载体的正向连接。 5'端修饰方法 作用 加入限制酶酶切位点 可以利用限制酶切割产生末端,方便基因重组 放射性同位素、生物素、荧光素等标记物 方便扩增产物的检测 增添、缺失或替换部分碱基 可以产生定点突变 一、常规PCR技术的基本原理 (6)引物的设计原则 ❆复性温度高，扩增特异性强，复性温度低，扩增效率高。如果引物碱基数较少，可以适当提高复性温度，这样可以使PCR的特异性增加，如果碱基数较多，那么可以适当减低复性温度，使DNA双链结合。一对引物的复性温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的复性温度是一样的。 ⑥复性温度适宜 复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。 原因是： ①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 ②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 一、常规PCR技术的基本原理 (7)结果分析与计算 每一条子链都以引物为起点进行延伸,故新合成的子链数=消耗的引物数。 合成DNA的数量: ________ (a:初始数量;n:循环的次数) 合成完整目的基因的数量: _______________ PCR产物的鉴定：常采用 __________________来鉴定 a×2n a×(2n-2n) 琼脂糖凝胶电泳 PCR体系需要两种引物,且两种引物同时使用,故消耗某种特定引物的数量=消耗的引物数/2。 ①PCR中的数量关系汇总 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 共消耗引物的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 含某种特定引物的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 同时含两种引物的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 脱氧核苷酸链等长的（目的基因）DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n DNA分子的链数 4 8 16 2n+1 一、常规PCR技术的基本原理 (7)结果分析与计算 循环次数 1 2 3 n DNA分子种类 2 4 5 5 共消耗引物的DNA分子数 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 2n＋1－2 长链-中长链DNA 2 2 2 2 中长链-短链DNA 0 2 4 2(n-1) 短链-短链DNA（目的基因） 0 0 2 2n-2n 含模板链的DNA分子数 2 2 2 2 第n次复制需要的引物数 2 4 8 2n 一、常规PCR技术的基本原理 (7)结果分析与计算 ①PCR中的数量关系汇总 [(2n - 1)×2]-[(2n-1 - 1)×2] 循环次数 1 2 3 n 长单链数 2 2 2 2 中单链数 2 4 6 2n 短单链数 2 8 2n+1－2-2n 第3轮循环获得了纯目的基因 整个体系有3种链 整个体系有5种DNA分子 一、常规PCR技术的基本原理 (7)结果分析与计算 ①PCR中的数量关系汇总 1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有(　　) A.8个 B.6个 C.4个 D.2个 A 一、常规PCR技术的基本原理 (7)结果分析与计算 ②习题巩固 “X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4次循环后产物中有5种不同的DNA分子，如图2所示。下列叙述错误的是（ ） A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①② 各一个 B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①② ③④各一个 C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中 有4个X基因 D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子 C 一、常规PCR技术的基本原理 (7)结果分析与计算 ②习题巩固 ❆变式训练❆ 2.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是（ ） A.第四轮循环产物中同时含有引物A和引 物B的DNA片段所占的比例为15/16 B.设计引物时需要避免引物之间形 成碱基互补配对而造成引物自连 C.复性温度过高可能导致 PCR反应得不到任何扩增产物 D.用PCR方法扩增目的基因时不必 知道基因的全部序列 A 一、常规PCR技术的基本原理 (7)结果分析与计算 ②习题巩固 一、常规PCR技术的基本原理 (8)重难点 ①复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。复性温度过高,则引物难以与模板链结合,温度过低则易造成引物与模板的结合位点增加,非特异性产物增多。 ②PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。PCR中耐高温的DNA聚合酶只能特异性地复制目的基因的DNA序列，从第3次扩增开始能够获得单纯的目的基因。 ③在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。  ④引物既可以是DNA单链,也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时,也需要引物,一般为RNA片段。PCR引物一般为DNA片段。 ⑤真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲溶液中一般都要添加Mg2+。 一、常规PCR技术的基本原理 (8)重难点 ⑥目的基因能被准确扩增的原因是：目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板，碱基互补配对原则保证复制准确的进行  ⑦变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高。反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 ⑧72℃是Taq 酶的最适温度，Taq 酶结合在引物的3’端 ⑨大肠杆菌细胞内 DNA复制过程具备了边解旋边复制的特点以及半保留复制的方式。而且其中一条子链是连续合成，而另一条子链是不连续合成的，于是就形成了冈崎片段。胞内RNA 引物完成延伸后，被RNA酶水解所形成的缺口再通过DNA连接酶连接起来。 ⑩变性温度过低：DNA双链解旋不完全。复性温度过高：不利于引物与模板的结合，导致PCR过程没有产物。复性温度过低：引物会与模板的结合位点增加，非特异性扩增产物增多。延伸时间过长：非特异性扩增产物增多 一、常规PCR技术的基本原理 (9)PCR技术的应用 ②广泛应用于刑侦破案、基因克隆、亲子鉴定、古生物学、遗传病的诊断和 DNA测序等方面。 ①为了某些需要，需对胚胎的性别进行鉴定。目前最有效最准确的方法是SRY-PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层_，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基作引物，以滋养层细胞DNA为模板进行PCR扩增；与SRY特异性探针出现阳性反应者，胚胎为雄性。 ③扩增目的基因：用模板DNA和目的基因相关引物扩增。 检测目的基因：用待测DNA和目的相关引物扩增。 产生突变基因：可在引物中或引物的5`端引入突变序列。 ④PCR技术还可应用于病毒、细菌等病原体的检测（核酸检测），身份识别（DNA指纹）及包括DNA操作在内的一些科学研究中。 一、常规PCR技术的基本原理 (10)RT-PCR（逆转录PCR） ①先从样本中提取RNA，RNA中可能有某病毒的RNA。 ②先通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA。形成RNA-DNA杂交分子 ③核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA。以单链DNA为模板，在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。 ④检测扩增出的PCR产物即DNA片段。扩增DNA片段能够发出荧光而被仪器检测到。扩增DNA片段的多少很大程度上取决于样本中目标RNA量的多少,而目标RNA量又与样本中病毒的量相关。 电泳可以直观对比 DNA的完整性，分子大小不同的 DNA在凝胶上迁移速率不同，从而产生不同的条带。图是上述实验中提取到的总 DNA 凝胶电泳结果，其中 M是已知大小的不同DNA的混合物。实验结果显示A、B方法提取的总 DNA电泳结果只有一条带，而C方法有明显的"拖尾"现象。 ①只出现一条带的原因是什么?②）出现"拖尾"现象的原因是什么? 总DNA凝胶电泳结果 ①甜菜细胞基因组DNA分子都比较大，不容易分离。 ②DNA发生断裂或降解，形成许多大小不等的DNA片段。 一、常规PCR技术的基本原理 (11)PCR 异常结果的分析 生物总DNA有多种DNA分子，只形成一条带说明完整DNA分子的分子量大，不易分离；若DNA分子发生断裂或降解，生成较多不同大小的相对较小的DNA分子，电泳时略有分离但又不充分，即出现“拖尾”现象。所以答案为∶①甜菜细胞基因组DNA分子都比较大，不容易分离；②DNA发生断裂或降解，形成许多大小不等的DNA片段。 一、常规PCR技术的基本原理 (12)易错易混 ①复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。 ②PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一轮循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第二轮循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。 一、常规PCR技术的基本原理 (13)知识拓展 复性温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。 引物长度越短，引物中G+C的含量越低，所需的复性 温度越低。 根据扩增的长度适当下调复性（退火）温度。 引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值（熔解温度）=4（G+C）+2（A+T） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性温度高，扩增特异性强，复性温度低，扩增非特异性强。复性温度取决于引物的Tm值，一般比两条引物的平均Tm值低3℃为宜。以确保引物能够在复性阶段充分结合到目标DNA上，同时避免过高的温度导致引物与模板DNA的解离 保证引物是过量的，使模板与引物配对结合的概率提高。 大量研究证实，在PCR的复性过程中，当复性温度接近Tm值时，引物与模板链之间形成的氢键稳定，形成的非特异性结合相对较少。 拓展：非特异性结合是指引物部分匹配非目的基因的DNA序列，结合到错误位置。将产生杂带或不能得到目的基因。 一、常规PCR技术的基本原理 (13)知识拓展 引物中GC含量是影响复性温度的核心因素，通常：高GC需提复性高温度（降低taq酶活性），低GC需降低温度（导致非特异性结合或无法稳定结合）。 引物长度越长，越容易形成氢键，出现非特异性结合。通常：为避免出现错配，引物偏长时需要适当提高复性温度，引物偏短时需降低温度。 第二部分 CRISPR/Cas9基因编辑技术 ③CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑。 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 (1)CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理 ②CRISPR/Cas9基因编辑系统是由Cas9核酸酶与单链向导RNA(sgRNA)形成的稳定核糖核蛋白复合物，能识别和切割特定的核苷酸片段，该系统可用于基因的敲除、编辑、表达调控、定点转基因、特异突变引入等诸多领域。 ①基因组编辑的含义:对基因进行定点修改,以改变目的基因的序列和功能,进行基因治疗和物种改良。 ④sgRNA的功能：与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合（即识别作用） 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 (1)CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理 ⑤Cas9蛋白的功能：与短链RNA结合,切割与向导RNA结合的DNA,使DNA双链断裂。 ⑥其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 ①优点 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 (2)CRISPR/Cas9基因编辑技术的优缺点 ②缺点 基因组编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。 对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规,不能违反人类的伦理道德。 1.猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　) 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 (3)习题巩固 B A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染 B.Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割 C.改造后的受体细胞经培养发育到桑葚胚或囊胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植 D.通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因 2.CRISPR/Cas9系统由单链的向导RNA(SgRNA)和内切核酸酶Cas9构成，为高效获得特定基因敲除的斑马鱼系，科研人员利用基因编辑技术(原理如图所示)，用化学方法合成特定的SgRNA，与Cas9 mRNA一起注射到斑马鱼细胞，筛选出特定基因敲除的斑马鱼。下列说法正确的是( 　　 ) A．两种RNA可通过显微注射法导入斑马鱼的肌肉细胞 B．图中SgRNA通过碱基互补配对实现其引导功能 C．Cas9 mRNA能对斑马鱼特定基因位点进行切割 D．基因敲除后的斑马鱼的发育一定会发生异常 B 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 3.研究者利用基因组编辑技术，将Bcl-2(抗凋亡)基因定点敲入FUT8(岩藻糖转移酶)基因，从而改造中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 (1)Cas9蛋白和sgRNA是基因组编辑工具(图1)，为筛选进行高效编辑的sgRNA，需根据_________基因相应序列，设计并合成多个sgRNA链。分别构建sgRNA/Cas9表达质粒，并通过______________法导入CHO细胞。 FUT8 显微注射 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 (2)Cas9蛋白与靶序列结合并将DNA双链切断，随后细胞会通过DNA损伤修复机制，将断裂处两端的序列连接起来，但在缺口处会发生碱基错配。T酶能特异性识别并切割错配的双链DNA，通过T酶的酶切实验检测sgRNA在CHO细胞内编辑效率。对图2电泳结果分析，__________组实现sgRNA的高效编辑。 2、3、4 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 (3)将含目的基因表达框和sgRNA/Cas9表达质粒(1∶1)共转染CHO细胞，实现同步敲入敲除基因，具体过程如图3。 ①目的基因表达框中含基因表达所需的元件，元件顺序依次为：同源序列Ⅰ－________________－同源序列Ⅱ， ___元件导致FUT8基因靶点后序列没 有成功转录。(填选项) a.T2A(连接子) b.启动子 c.转录终止信号 d.Bcl-2基因 e.FUT8基因 f.绿色荧光蛋白基因 b－d－a－f－c c 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 ②选取具有__________特征的细胞，进一步提取基因组DNA，并对图3中片段__________进行PCR，筛选出在FUT8靶基因处成功整合目的基因表达框的单克隆细胞。若PCR扩增产物的电泳结果出现_____________________________ _________，表明筛选出的单克隆细胞为成功定点整合的纯合细胞。 绿色荧光 1、2、3 长度约4 768 bp的(明亮)单一 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 条带 (4)CHO细胞是基因工程中生产抗体的常用受体细胞，FUT8负责将岩藻糖转移至表达抗体上，而岩藻糖的存在会极大地降低抗体的作用。请分析利用改造后的CHO细胞株进行抗体生产的优势：_______________________________________ __________________________________________________________________________________________________________。 改造后的CHO细胞株具有Bcl-2基因不易发生细胞凋亡，利于进行抗体的大规模生产，同时其生产的抗体无岩藻糖修饰，利于发挥抗体的作用。 4.CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如下图所示。回答下列问题： 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是______________。 DNA连接酶　 (2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是_________________。 Ca2＋处理法　 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 (3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是_____ ______________。随后，Cas9蛋白可切割________ _______________________序列。 碱基 互补配对原则 目标 DNA特定的核苷酸 (4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是____________________，基因敲除成功的判断依据是_________________。 DNA分子杂交技术　 不出现杂交带 CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列，从而将该蛋白酶基因插入基因组DNA中。 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程： 二、CRISPR/Cas9基因编辑技术 第三部分 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） ①RT－PCR即逆转录—聚合酶链式反应：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，利用引物和逆转录酶逆转录成cDNA。 ②再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 ③RT－PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能，某些病毒的核酸检测就是依据此原理。 三、逆转录—聚合酶链反应（RT－PCR) (1)原理 ④由于RNA不稳定，因此PCR不能直接扩增RNA；需要先将RNA逆转录得到cDNA，再进行PCR扩增。 1.如图是快速RT-PCR过程示意图,①和②为逆转录酶催化的逆转录过程,③是PCR过程。据图分析,下列叙述错误的是(　　) A.逆转录酶具有DNA聚合酶的能力 B.③PCR过程只需要引物b C.RT-PCR可检测基因表达水平 D.RT-PCR可检测新冠病毒等RNA病毒 B 三、实时荧光定量PCR技术 (3)习题巩固 2.2019－nCoV（2019新型冠状病毒）是一类具有囊膜的＋RNA病毒，基因组编码多种蛋白质，其中有4种主要结构蛋白：S蛋白（刺突糖蛋白，识别宿主细胞受体的一种关键蛋白），M蛋白（膜糖蛋白），核衣壳蛋白N和小包膜蛋白E。请回答下列问题： 2019－nCoV的检测可以采用实时荧光RT－PCR（逆转录聚合酶链式反应）的方法，RT－PCR的具体过程如图： ①该技术用于对微量2019－nCoV病毒的检测，可提高检测的灵敏度，过程Ⅰ需要加入适量缓冲液、模板、原料、           酶和引物A等。 ②过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要           个引物B。该过程中           （填“是”或“不是”）必须有解旋酶才能解开双链DNA。 三、实时荧光定量PCR技术 (3)习题巩固 逆转录 2n－1 不是 第四部分 实时荧光定量RT-PCR技术 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 引物2 5′ 3′ 引物1 5′ 3′ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针对 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，从而精确定量计算样品的初始模板量的方法。 四、实时荧光定量RT-PCR技术 (1)原理 Ⅰ 法：在反应体系中，加入过量 荧光染料，荧 光染料特异性地渗入 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 染料 分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 产物的增加完全 同步。 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 引物2 5′ 3′ 引物1 5′ 3′ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 TaqMan探针是实时荧光定量PCR(qPCR)技术中一种常用探针,其5’端接荧光基团(R),3'端接淬灭剂(Q).探针完整时，R发出的荧光被Q吸收而不发荧光. 四、实时荧光定量RT-PCR技术 病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。 (1)原理 3′ 5′ 引物2 5′ 3′ R 荧光基团 淬灭荧光基团 Q 在该反应中TaqDNA聚合酶的作用： ①形成子链的磷酸二酯键。②水解探针，破坏磷酸二酯键。 PCR过程中,当耐高温的DNA聚合酶(利用5'－3'外切酶活性)遇到探针时会使探针水解,R发出的荧光信号被相应仪器检测到,荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。每扩增一条DNA链就有一个荧光分子产生。 (1)原理 ③荧光信号强度（Rn）与扩增次数（n）之间的关系(R基因荧光强度为a，加入的目的基因为b个)：________________。 Rn=ab（ 2n-1） 四、实时荧光定量RT-PCR技术 四、实时荧光定量RT-PCR技术 (1)原理 该反应体系中并未加入ATP，但新链的合成需要消耗能量，解旋的能量来自于高温，聚合的能量来自于原料。 引物2 R 引物1 Q 引物2 1引物1 Q R 步骤3·探针被切断 步骤4·聚合完成 引物2 报告(荧光)基团 淬灭基团 Q R 引物1 Q R 步骤1·聚合 引物2 引物1 Q R 步骤2·链取代 (1)原理 四、实时荧光定量RT-PCR技术 ❆实时荧光定量RT-PCR（rRT-PCR）——以“新冠病毒核酸检测”为例 ①RT-PCR 因为新冠病毒的核酸为RNA，而RNA极易降解，为了防止RNA在核酸检测过程中降解，要逆转录为更稳定的DNA。RT-PCR是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术。首先经逆转录酶的作用,由RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,在DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段。 (2)应用 ②实时荧光定量PCR（rRT-PCR） rRT-PCR可以分两部分来看，其中r代表实时（real-time），主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。RT表示逆转录（reverse transcription）。荧光强度与病毒初始数量和扩增次数有关。 四、实时荧光定量RT-PCR技术 优点：灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。 (2)应用 ②实时荧光定量PCR（rRT-PCR） 从样本中提取病毒RNA,经逆转录酶作用形成cDNA。然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增（在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监测整个PCR进程）,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，测定样品中病毒核酸量。 四、实时荧光定量RT-PCR技术 在通过实时荧光定量PCR检测新冠病毒感染时,检测到的荧光强度变化如图所示。与指数增长期相比,线性增长期目的基因数量的增长率下降,可能原因有底物浓度下降、酶活性下降等。 (2)应用 ②实时荧光定量PCR（rRT-PCR） 四、实时荧光定量RT-PCR技术 Ct值的含义是指在PCR扩增过程中,每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。 荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。Ct值≤37判定为阳性,Ct值>40或无Ct值判定为阴性。右图所示新冠病毒核酸检测结果应判定为阳性。 四、实时荧光定量RT-PCR技术 (2)应用 ②实时荧光定量PCR（rRT-PCR） 荧光强度主要与扩增次数、病毒初始数量 Taq DNA聚合酶作用:既可以在引物后延伸子链,也可以催化TaqMan探针 的降解。 Ct值:达到荧光检测限(阈值)的最小循环数,Ct值越小,原始模板数越多。 平台期:由于TaqMan探针、引物、原料有限,荧光检测会出现平台期。 DNA检测：只检测存在与否用电泳检测，若检测量进行实时荧光定量PCR） RNA检测：RT-PCR，只检测存在与否电泳检测，若检测量进行实时荧光定量PCR） 1.实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ） (3)习题巩固 A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针 B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增 C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒 D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交 C 四、实时荧光定量RT-PCR技术 2.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量，其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是( 　) A．引物与探针均具有特异性，与模板 结合时遵循碱基互补配对原则 B．反应最终的荧光强度与起始状态模 板DNA含量呈负相关 C．耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5′端到3′端 D．若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶 B (3)习题巩固 四、实时荧光定量RT-PCR技术 3.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针,荧光探针两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团,探针完整时,发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,荧光监测系统接收不到荧光信号。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号。即每扩增一次,就有一个荧光分子生成(如图所示)。 (3)习题巩固 下列相关叙述正确的是(　　) A.扩增过程中引物先于探针结合到模板DNA上 B.在PCR系统中需加入解旋酶 C.荧光信号积累越多,说明PCR循环次数越多 D.若扩增n次,则其需要消耗2n-1个探针 C 四、实时荧光定量RT-PCR技术 4.新冠病毒是一种单链RNA病毒,常用“荧光RT-PCR技术”进行检测,方法是取受检者的mRNA逆转录出cDNA,并大量扩增,用荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测样品中新冠病毒的核酸含量。请回答下列问题。 (1)“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有_________________、 　　　　 　、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。  逆转录酶 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) (3)习题巩固 (2)如果要同时扩增两种基因，则试剂盒中的引物应该有________种。图1为新冠病毒的“ORFlab”基因对应的cDNA片段结构示意图，则与之对应的引物结合的部位应该是图中的________(子链延伸方向为其自身的5′→3′，用图中数字作答)。若已知该基因的一条引物，________(填“能”或“不能”)依据其碱基序列设计出另一条引物，理由是________________________________。 4 4、1 不能 两种引物的碱基序列没有相关性 四、实时荧光定量RT-PCR技术 (2)应用 ③习题巩固 (3)在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断积累，荧光信号的强度也随之增加。根据荧光强度的变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线(如图2)。 ①出现“平台期”最可能的原因是________________ ________________________________________________ ____________________________________________。 试剂盒中的原料、 引物和探针数量一定，超出一定的循环数后，荧光分子不再增加 ②理论上，在检测过程中，有荧光信号出现，则说明检测结果呈________(填“阴”或“阳”)性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本，检测时都出现了如图2所示的曲线，但甲的A点比乙的A点明显左移。请给这种结果作出科学合理的解释(试剂盒合格且正常，操作过程规范且准确)： 阳 甲样本中的新冠病毒核酸含量更高，达到阈值所需的循环数更少 四、实时荧光定量RT-PCR技术 5.新冠病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(见图甲)，通过实时荧光PCR检测新冠病毒感染时，检测到的荧光强度变化见图乙。 甲　　　　　　　　　　　乙 (2)应用 ③习题巩固 四、实时荧光定量RT-PCR技术 (1)与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有_______________________________________________________________________。 (2)Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就________。 (3)某新冠病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图乙所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为________。 (4)阴性结果也不能排除新冠病毒感染。可能产生假阴性的因素有_______。 a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值 b.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 c.病毒发生变异 TaqDNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降　 越小　 阳性　 abc　 (2)应用 ③习题巩固 四、实时荧光定量RT-PCR技术 第五部分 重叠延伸PCR技术 五、重叠延伸PCR技术 (1)原理 ②该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点,引物2和引物3可以碱基互补配对。 ①重叠延伸PCR技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段。 ③分别利用引物1和2,引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起,再在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。 ④最后,用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 ⑤通过测序可以检验定点突变是否成功。 Ⓐ融合基因：融合基因是指两个基因的部分或全部序列首尾相连，形成受同一套调控序列控制的嵌合基因。 启动子 基因1 基因2 基因3 终止子 Ⓒ融合蛋白：是指融合基因的表达产物。 Ⓑ在基因工程技术中常指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套启动子和终止子内部构成的嵌合基因。 (2)应用 ①获得融合基因 五、重叠延伸PCR技术 xxx PCR1 PCR2 链Ｂ 基因Ａ 基因Ｂ 互补 P1 P2 P4 P3 3’- -5’ -3’ 5’- 5’- -5’ 5’- -5’ (2)应用 ①获得融合基因 链Ａ 5’- 3’- -3’ 5’- -3’ -5’ 3’- -5’ 5’- 3’- -3’ -5’ 5’- -3’ 3’- -5’ ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 第一种 第二种 第三种 3’- -5’ 5’- -3’ 第四种 5’- 3’- -3’ -5’ 5’- -3’ 3’- -5’ 5’- -3’ 3’- -5’ 不能PCR 延伸 可以PCR延伸 分别获得PCR1和PCR2 将PCR1和PCR2混合，不加引物 ❆注意❆ 经过PCR1和PCR2获得的两种DNA混合，经高温变性再低温复性后，只有一种情况可以进行PCR延伸。 五、重叠延伸PCR技术 xxx PCR1 PCR2 链Ａ 链Ｂ PCR3 Ａ－Ｂ融合基因 基因Ａ 基因Ｂ 互补 PCR4 P1 P2 P4 P3 3’- -5’ -3’ 5’- 5’- -5’ 5’- -5’ 5’- -3’ 3’- -5’ 分别获得PCR1和PCR2 PCR3不需要引物 PCR4(用P1和P4 扩增融合基因) 将PCR1和PCR2混合，不加引物 (2)应用 ①获得融合基因 五、重叠延伸PCR技术 引物a 引物c 引物b 引物d 产物AB 产物CD AB上链 CD下链 突变产物AD PCR1 PCR2 PCR3 PCR4 大量突变产物AD 至少第2次循环获得 至少第2次循环获得 C G A T 定点突变 (2)应用 ②定点突变 五、重叠延伸PCR技术 引物a 引物c 引物b 引物d 产物AB 产物CD AB上链 CD下链 突变产物AD PCR1 PCR2 PCR3 PCR4 大量突变产物AD 至少第2次循环获得 至少第2次循环获得 (2)应用 ②定点突变 Ⓐ该过程需要______种引物 Ⓑ需要改变的碱基位于引物______和引物 ______上 ⒸPCR1的产物AB是引物________和引物 _______扩增的结果 ⒹPCR2的产物CD是引物________和引物 _________扩增的结果 ⒺPCR2中至少_____个循环才能获得产物CD Ⓕ引物b和引物c之间有什么关系？ Ⓖ首次获得产物AD需要引物吗？ 4 b c a b c d 2 五、重叠延伸PCR技术 引物b和引物c存在互补配对的片段 不需要，由耐高温的DNA聚合酶延伸 引物a 引物c 引物b 引物d 产物AB 产物CD AB上链 CD下链 突变产物AD PCR1 PCR2 PCR3 PCR4 大量突变产物AD 至少第2次循环获得 至少第2次循环获得 (2)应用 ②定点突变 ⒽPCR3中突变产物AD的扩增需要引物 _______和引物________ ⓛPCR1和PCR2反应体系中一次复制后共产生_______种DNA分子 Ⓙ过程①的条件为：___________________ _______________________________________ ⓀAB下链和CD上链结合能得到产物AD吗？ a d 3 先加热至90℃以上 变性，再冷却至50℃左右 五、重叠延伸PCR技术 不能，DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸连接在已有链的3'端 (即新链的延伸只能从5'端到3'端）。 1.重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,经过多次PCR 扩增,获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA 、不同来源的DNA 片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景,下图表示利用重叠延伸PCR 技术扩增某目的基因的过程。 (3)习题巩固 下列叙述正确的是(　　) A.引物中C+G 的含量越低,引物与模板DNA 结合的稳定性越高 B.在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对,因此两者置于不同反应系统中 C.引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后,共产生4种双链DNA 分子 D.在引物1、2组成的反应系统中,经第一阶段要形成图示双链DNA,至少要经过3次复制 B 五、重叠延伸PCR技术 2.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变,可以实现对纤维素酶基因的合理性改造,其过程如图所示。下列说法错误的是(　　 ) A.产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果 B.引物c和引物b上均含有突变的碱基序列 C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右 D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD D 引物a 引物c 引物b 引物d 产物AB 产物CD AB上链 CD下链 突变产物AD PCR1 PCR2 PCR3 PCR4 大量突变产物AD 至少第2次循环获得 至少第2次循环获得 (3)习题巩固 五、重叠延伸PCR技术 3.PCR技术的实用性和极强的生命力使其成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用，请根据资料回答下列问题。 (1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获 得目的基因的方法。利用该技术可以实 现基因的定点诱变。它在需要诱变的位 置合成两个带有变异基因碱基的互补引 物，然后分别与引物a和引物d做PCR， 这样得到的两个PCR引物产物都带有变 异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位 进行重组PCR就能得到诱变PCR产物， 如图所示： (3)习题巩固 五、重叠延伸PCR技术 ①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCR1应选择图1中引物__________，大量扩增突变产物AD则应选择引物__________。 a和b a和d (3)习题巩固 ②重叠延伸PCR通过______________________实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是_________________________________________ 在引物b和c上引入突变 引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效 ③若正常基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别，请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因： 用限制酶DpnⅠ分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD，然后进行电泳,若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带，则为突变基因 五、重叠延伸PCR技术 4.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。 (3)习题巩固 五、重叠延伸PCR技术 ①若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为_____________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为_________(假设引物为单链DNA)。 T－A或C－G A或G 四、重叠延伸PCR技术 (3)习题巩固 ②在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为: 3 引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用 ③利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是: M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段 (3)习题巩固 五、重叠延伸PCR技术 第六部分 大引物PCR技术 引物a C G A T 定点突变 引物b 产物AB PCR1 引物c 大引物AB PCR2 至少第2次循环获得 至少第2次循环获得 突变上游引物 常规下游引物 常规上游引物 注意：PCR2利用PCR1的产物作为引物，因此两轮PCR不能同时进行。 六、大引物PCR技术 ①大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 ②第一步：利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段。 ③第二步：利用第一轮扩增产物片段中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA 引物a 引物b 产物AB PCR1 引物c 大引物AB PCR2 至少第2次循环获得 至少第2次循环获得 (1)原理 突变上游引物 常规下游引物 常规上游引物 六、大引物PCR技术 引物a 引物b 产物AB PCR1 引物c 大引物AB PCR2 至少第2次循环获得 至少第2次循环获得 (1)原理 突变上游引物 常规下游引物 常规上游引物 ①该过程共需要____种引物进行___轮PCR。 ②第一次PCR的产物是___________引物和__________引物扩增的结果。 ③第一次PCR中至少_____个循环才能获得产物。 ④第二次PCR以_______________为模板。 ⑤突变上游引物和大引物的关系： ⑥第二次PCR的产物是___________引物和_____________________________________扩增的结果。 3 2 突变上游 常规下游 2 原始DNA分子 常规上游 大引物(第一轮扩增产物中的一条链) 六、大引物PCR技术 大引物是突变上游引物的互补链 引物a 引物b 产物AB PCR1 引物c 大引物AB PCR2 至少第2次循环获得 至少第2次循环获得 (1)原理 突变上游引物 常规下游引物 常规上游引物 ⑦第二次PCR中至少_______个循环才能获得产物。 ⑧为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的复性温度，第二次PCR的复性温度应该比第一次PCR _____ ⑨PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，该定点诱变产物需具备________________等结构才能进行转录和翻译。 2 高 启动子和终止子 六、大引物PCR技术 1.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变需进行两轮PCR反应即可获得,过程如图所示。下列叙述不正确的是( ) A.第一轮PCR过程中复性所用的温度与第二轮PCR复性的温度不一样 B. PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状,该定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 C.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 D.将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),属于蛋白质工程 C (2)习题巩固 六、大引物PCR技术 2.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题。 (2)习题巩固 六、大引物PCR技术 ①利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要____个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的______(填“①”或“②”)。 2 ② (2)习题巩固 六、大引物PCR技术 ②为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是__________________________________________________________ _________。为将改良基因构建在质粒上，还需要_____________________等酶。 SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末 端连接 BglⅡ、DNA连接酶 (2)习题巩固 六、大引物PCR技术 ③在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述组件的溶液加入大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和_____________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是_______________________________________________________________________ __________________________________________________。 β-半乳糖苷 构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能 分解β-半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色 (2)习题巩固 六、大引物PCR技术 1.利用引物中引入突变位点——在目的基因一端引入突变位点 (1)两个引物均从内部扩增，在某一引物引入突变位点 提醒　若两个引物均从内部扩增，其中一个引物引入突变位点，则至少第3次扩增后才可获得双链等长的DNA片段，第n轮扩增后可获得2n－2n个突变DNA。 六、大引物PCR技术 (1)知识拓展 (2)一个引物从内部扩增，另一个引物从侧翼扩增，在某一引物引入突变位点 若一个引物从内部扩增，另一个引物从侧翼扩增，其中一个引物引入突变位点，则至少第2次扩增可获得双链等长的DNA片段，第n轮扩增后可获得2n－(n＋1)个突变DNA。 六、大引物PCR技术 (1)知识拓展 2.利用环状质粒PCR引入突变位点——在目的基因一端或内部引入突变位点 (1)在两个引物中引入突变位点 在两个引物中同时引入突变位点时，经n轮扩增。共产生M1P1、M2P2和P1P2三种DNA；其中含突变碱基对的DNA(P1P2)有2n－2个。 六、大引物PCR技术 仅在一个引物中引入突变位点时，经n轮扩增，共产生M1P1、M2P2、P1P2和P1P2四种DNA；其中含突变碱基对的DNA(P1P2)有2n－(n＋1)个。 六、大引物PCR技术 2.利用环状质粒PCR引入突变位点——在目的基因一端或内部引入突变位点 (2)在一个引物中引入突变位点 第七部分 反向PCR技术 ①当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。 七、反向PCR技术 (1)原理 ④选择限制酶时，要保证其在已知序列内部没有限制酶切割位点。 ⑤选择引物时，要选择反向引物对(相对于已知序列)，若选择的是相向引物对，则扩增的是已知序列。 ②原理是用限制酶切割该DNA（形成黏性末端），随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。 ③以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。 已知序列 未知序列 未知序列 用EcoRⅠ限制酶切割 已知序列 未知序列 未知序列 自身环化 已知序列 未知序列 未知序列 引物3 引物2 引物1 引物4 (1)原理 七、反向PCR技术 热点2　PCR技术的应用 100 已知序列 未知序列 未知序列 自身环化 引物1 引物2 引物3 引物4 引物1 引物2 引物3 引物4 (1)原理 七、反向PCR技术 热点2　PCR技术的应用 101 1.常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(　 　) D A.酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列 B.PCR技术的操作步骤依次是高温变性、低温复性、中温延伸 C.图中引物应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对 D.PCR扩增时，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状 (2)习题巩固 七、反向PCR技术 热点1　RT－PCR与反向PCR 2.反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的有（ ） A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增 B.设计的引物中GC碱基含量越高，退火温度越低 C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 D.在环化阶段，可选E.coliDNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶 A (2)习题巩固 七、反向PCR技术 103 3.反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。 ①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是____________ ______________________________。 序列未知，无法设计引物 DNA两端 (2)习题巩固 七、反向PCR技术 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是_______(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物_____(填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位点。 逆时针 含有 (2)习题巩固 七、反向PCR技术 4.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题： (1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种__________酶,它通过识别特定的______________切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成____________,PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得___________,Taq DNA聚合酶的作用是催化___________________________ ________ 限制　 核苷酸序列　 磷酸二酯键　 以DNA为模板的DNA链的 DNA单链　 (2)习题巩固 延伸　 七、反向PCR技术 (3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。 ②④　   DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列 PCR 引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′ ②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′ ③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′ ④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′ (2)习题巩固 七、反向PCR技术 (4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是_____ A.5′—AACTATGCG…AGCCCTT—3′ B.5′—AATTCCATG…CTGAATT—3′ C.5′—GCAATGCGT…TCGGGAA—3′ D.5′—TTGATACGC…CGAGTAC—3′ B　 (2)习题巩固 七、反向PCR技术 第八部分 巢式PCR技术 ①巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（如图所示），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。 ②首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。 ③然后使用第二套引物(内引物，也称巢式引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。 八、巢式PCR技术 (1)原理 八、巢式PCR技术 (1)原理 ④优点 Ⓐ提高特异性 巢式PCR的好处在于，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。巢式PCR的扩增特异性更强。 Ⓑ增强灵敏度 第二轮PCR的扩增产物通常较短，这意味着它可以从低拷贝的起始DNA样本中扩增出更多的产物，从而克服了单次PCR扩增的灵敏度限制。通过两轮PCR，可以从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物，这对于从低浓度的DNA样本中检测目标基因非常重要。 八、巢式PCR技术 (2)习题巩固 1.为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR进行了改良，发明了巢式PCR，其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15～30次循环)，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段(即目的基因)，最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　) A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段 B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物 C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低 D．与巢式PCR相比，普通PCR特异性更强，错误率更高 D 二 轮 专 题 复 习 八、巢式PCR技术 (2)习题巩固 2.巢式 PCR 是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为:先以比目的基因大的 DNA 片段为模板用外引物(F1，R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2，R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是( ) A.两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链 DNA片段 B.第二轮 PCR 反应能否进行，是对第一轮PCR 反应正确性的鉴定 C.由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 D 二 轮 专 题 复 习 第九部分 不对称PCR技术 (1)原理 九、不对称PCR技术 Ⓐ不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别为限制性引物（数量较少）与非限制性引物（数量较多），其最佳比例一般为1：50～1：100。 Ⓑ在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA(dsDNA)，可以增加模版DNA的数量。 Ⓒ但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA（ss—DNA）。 ss—DNA 的产生量主要受限制性引物和非限制性引物的比例的影响。 Ⓓ因为双链DNA和单链DNA的相对分子质量（碱基数量）不同，可通过电泳方法将其分离。 九、不对称PCR技术 (2)习题巩固 1.不对称PCR技术是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1/50～1/100。PCR反应的最初若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA (dsDNA)，在限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列说法正确的是（ ） A.两种引物与模板链结合时，需将温度控制在72 ℃左右 B.PCR扩增时，在DNA解旋酶的作用下双链DNA解聚为单链 C.通过不对称PCR技术最后大量获得的ssDNA的碱基序列与图中甲链的相同 D.PCR扩增时，子链分别沿限制性引物的5'端、非限制性引物的3'端延伸 C 九、不对称PCR技术 (2)习题巩固 2.反应体系中原来有1个模板DNA分子,最初25个循环扩增产生双链 DNA,后15个循环均只扩增一条链,则需要非限制性引物 个。 229-1 ❆前25次需要非限制性引物和需要限制性引物一样,也是=225-1个,后15次,需要利用前25次扩增到的DNA为模板,需要非限制性引物= 225 ×15,所以一共需要非限制性引物为225-1 ＋ 225 ×15 =225×16-1=229-1(个)。 3.假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物 __________ 个，需要非限制性引物 ____________________ 个。 （210-1）a  （ 21⨉210-1）a  第十部分 交错延伸PCR技术 十、交错延伸PCR技术 (1)原理 Ⓐ交错延伸(stagger extension process, StEP)是在一个PCR反应体系中，以两个（或多个）相关的DNA片段（即同源性DNA片段）为模板进行PCR反应，引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性的过程。在每一轮PCR循环中，之前延伸的小片段均会随机的与一个模板碱基互补配对继续延伸，由于模板的转换而实现不同模板间的重组，最终实现全长基因片段的获得。（每一轮只复制一段就停止） 十、交错延伸PCR技术 (1)原理 Ⓑ基本步骤： ⓵变将不同来源的DNA模版（如野生型雨突变型基因)混合，高温变性使双链解离。降温复性，引物与模板链结合 ⓶短暂延伸形成小片段 ⓷新生小片段在下一轮变性中释放，与模板随机结合作为引物（template switching）并继续延伸（退火温度应该稍低，毕竟特异性在降低） ⓸重复上述过程直至全长基因形成即最终得到新组合的基因 十、交错延伸PCR技术 (2)习题巩固 1.某科研小组从土壤菌株A、B中分离到同源性为93%的Bt1抗虫基因和Bt2抗虫基因的编码序列,并运用交错延伸PCR技术获得了抗虫性能强的重组Bt基因,且转入烟草获得成功,过程如图所示。 注:①交错延伸PCR中,基因Bt1和Bt2均作为模板,所需引物相同,图中仅为其中一条链的延伸情况。 ②启动子Prla可在烟草叶肉细胞中特异性启动基因的转录。 ③图2中生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的DNA片段,可使植物细胞合成生长素。 ④抗草甘膦基因(aroA)正常表达可使植物对除草剂草甘膦有较好抗性,抗卡那霉素基因(Kanr)正常表达 可使细菌对卡那霉素有较好抗性。 ①在愈伤组织发育成转基因烟草过程中,愈伤组织经历了再分化,需要依次经过____________________________两种培养基才能成长为一个植株,在这两种培养基中均添加了生长素与细胞分裂素,两种培养基中,生长素占比较低的是______________。  ②在产生转基因烟草的过程中,将Bt重组基因整合到烟草染色体DNA上的过程是图中的______(填序号),图中所示Ti质粒部分至少含有______个启动子,复制原点是__________识别和结合的位点。  十、交错延伸PCR技术 (2)习题巩固 生芽培养基、生根培养基 生芽培养基 ④ 3 解旋酶 ③在培养愈伤组织的培养基中添加__________可以筛选含有Bt重组基因的细胞。图中生长素合成酶基因是否能促进愈伤组织生芽?作出判断并解释。 十、交错延伸PCR技术 (2)习题巩固 草甘膦 因为生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的,自身无启动子,而启动子Prla在愈伤组织中不能启动转录。 ④交错延伸PCR中延伸过程和普通PCR__________(填“相同”或“不相同”)。已知交错延伸PCR中所用引物片段均为30个核苷酸,Taq DNA聚合酶在72 ℃下的扩增速度为1 000个碱基/min,本实验的循环扩增条件为:95 ℃变性 30 s,50 ℃复性15 s,72 ℃延伸15 s,共80个循环,第二轮循环后所得重组型子链长度为________个核苷酸。若将复性温度调成55 ℃,则无法得到扩增产物,原因是_________________________________。通过交错延伸PCR获得的重组Bt基因,同时具有Bt1和Bt2基因序列的原因是：  十、交错延伸PCR技术 (2)习题巩固 不相同 530 引物分子无法与模板DNA结合 第一轮以Bt1(Bt2)为模板合成的子链片段在第二轮复制时作为引物结合到Bt2(Bt1)的模板上继续合成子链,经多轮交错循环扩增,可以使产物同时含有两种基因的序列 十、交错延伸PCR技术 (2)习题巩固 2.交错PCR能实现同源基因的重组（如图，仅示单链）。第一轮延伸15s，获得短产物①②。在第二轮开始时（95℃）产物①②与原来模板分开，然后（55℃）随机地与不同模板交错结合，延伸15s，合成交错产物③④。每一轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物-模板”交替结合、延伸，最终扩增出交错重组基因产物。相关叙述正确的是（　 　） A.交错PCR原理是DNA半保留复制 B.交错PCR延伸温度设定为55℃可增加交错次数 C.上一轮交错产物需与模板链严格配对才能继续下一轮扩增 D.若交错循环20轮，一共产生220个DNA分子 AB 十、交错延伸PCR技术 (2)习题巩固 3.研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1产生的LA1酶可耐高温，菌株2产生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因，生产出了更高效的酶。 十、交错延伸PCR技术 (2)习题巩固 ①交错延伸PCR技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是               __________________________________________。已知过程①起始引物片段均为25个核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s、复性15s、延伸15s，经过80轮交错循环后，可获得PCR混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为_______个核苷酸。 使DNA 聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 625 十、交错延伸PCR技术 (2)习题巩固 ②获得的重组LA基因中，同时具有LA1和LA2基因序列的原因是__________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ _________。 ③过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-突变基因、E为复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶，asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP依赖。为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸PCR过程中引物的5'端需引入____________________酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程③中应采用asd基因_______的受体菌。从含有PM质粒、重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路为________________________________________________________________ _________________________________________________________________________。 模板合成子链，该片段在第二轮复制时作为引物，结合到LA2（LA1）的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列 以LA1为 Xho Ⅰ和BamH I 缺失    将正常培养基上分离出的受体菌单菌落，平移印制到含氯霉素的培养基上，在 含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM质粒的受体菌 第十一部分 易错PCR技术 ①易错PCR是在采用耐高温的DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。 ②其关键在于对合适突变频率的选择，突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变;突变频率太低则会导致文库中全是野生型群体。理想的碱基置换率和易错的最佳条件主要依赖于突变的DNA片段的长度。 ③通常，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR，即将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。 十一、易错PCR技术 (1)原理 ④由于易错PCR涉及的遗传变化只发生在单一分子内部，故属于无性进化。它虽然可以有效的产生突变，且操作方法简单，但其一般只适用较小的基因片段，应用范围较为有限。 十一、易错PCR技术 (1)原理 十一、易错PCR技术 (2)习题巩固 1.从自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。科研人员对酶的改造包括理性设计方法和非理性设计方法。理性设计方法通过定点诱变来改变蛋白质中的个别氨基酸，以产生更加理想的酶，非理性设计方法主要通过易错PCR技术实现（如图所示）。易错PCR的原理是利用低保真的TaqDNA聚合酶和改变PCR的反应条件，降低DNA复制的保真度，在新DNA链的合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变。下列相关叙述正确的是（      ） A.理性设计方法实现了基因的定向变异，属于蛋白质工程 B.构建重组质粒需要用到的工具有限制酶和DNA连接酶 C.步骤②应使受体菌处于感受态，可采用抗原—抗体杂交技术筛选突变酶 D.低保真的TaqDNA聚合酶会增加新DNA链合成过程中碱基的错配率 ACD 2.易错PCR是利用低保真的Taq DNA聚合酶和改变PCR的反应条件，降低DNA复制的准确性，使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。Taq DNA聚合酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2+可以提高该错配区的稳定性。下列说法正确的是（     ） A.PCR反应体系中需要加入模板、引物、原料、Taq DNA聚合酶、ATP B.Taq DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到引物5'端 C.与普通PCR相比，易错PCR体系中应适当提高Mn2+和Mg2+浓度 D.易错PCR可用于蛋白质工程，生产自然界中不存在的蛋白质 十一、易错PCR技术 (2)习题巩固 CD 十一、易错PCR技术 (2)习题巩固 (1)PCR反应体系中需要添加引物，引物的作用是__________________________ _________________________。PCR扩增过程中需要加入Taq DNA聚合酶，这是因为Taq DNA聚合酶具有_________的特点。步骤①采用易错PCR进行扩增的目的是__________________________。 (2)图中步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用______处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。步骤③筛选具有高催化效率的突变酶采用的方法是_________________________________________________。 (3)请阐述易错PCR技术改造天然酶与通过蛋白质工程改造天然酶的本质区别 ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 使DNA聚合酶从引物的3’ 端开始连接脱氧核苷酸 耐高温 获得突变的天然酶基因  Ca2+  抗原-抗体杂交技术（或根据酶的催化效率筛选） 易错PCR技术是利用基因突变的原理来改造天然酶，是不定向的,而蛋白质工程是改造天然酶，是定向的。 第十二部分 降落PCR（TouchDown PCR)技术 十二、降落PCR（TouchDown PCR)技术 (1)原理 ①复性温度高，引物结合的特异性好，复性温度低，引物结合的特异性差。开始先设定一个比较高的复性温度，每个循环复性温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的复性温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳复性温度的工作。 ②通过“温度梯度递减”策略，让引物与模版在高温下优先完成精准配对，初始变性温度比Tm值高，每个循环逐步降低，直至到最佳温度，高温阶段仅完全匹配的引物能结合模版，抑制非特异性扩增，低温阶段则加速特异性产物的积累。 十二、降落PCR（TouchDown PCR)技术 (2)应用 ①无需精准Tm值，适用于未知基因片段的扩增，省去优化复性温度的繁琐步骤。 ②在同源序列干扰下（如检测病原体变异株），高温初始循环可以排除非特异性结合。 ③病毒载量低时（如早期新冠检测），减少引物二聚体的干扰，提升阳性检出率。 第十三部分 “双脱氧法”基因测序 ①一号碳可连接含氮碱基 ②五号碳连有羟基，未来连接磷酸基团形成磷酸酯键 ③核糖二、三号碳均连有羟基，脱氧核糖三号碳连有羟基，双脱氧核糖二、三号碳均不含羟基 双脱氧核糖 ddNTP(结合PCR与sanger测序) 脱氧核糖 DNA及dNTP 核糖 RNA及ATP 十三、“双脱氧法”基因测序 (1)五碳糖的结构 十三、“双脱氧法”基因测序 (2)ddNTP(双脱氧三磷酸核苷酸) ①可脱去两个磷酸基团形成焦磷酸和双脱氧核苷酸并释放能量。 ②因为ddNTP缺少3’-OH，不能与另外的dNTP连接形成磷酸二酯键，因此，双脱氧核苷酸可使DNA子链延伸终止。即ddNTP 的碱基可代替dNTP与模板链上的碱基互补配对，但该位点之后不能延伸子链） 十三、“双脱氧法”基因测序 (3)原理 Ⓐ双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。 Ⓑ每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入单链模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。 ⒸPCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。 Ⓓ序列读取:由于PCR形成子链的方向是从5'端到3'端,能够使得延伸终止的一个ddNTP出现在3'端,所以离点样孔最近条带为新合成子链的最后的核苷酸,由离点样孔的远近(或电泳的方向)依次读出相应的核苷酸,即为子链3'端到5'端的核苷酸序列,上图中子链顺序为3'-AGTTGCTA-5' Ⓔ子链数量:在T泳道除了显示的3条DNA子链,还包含一个没有掺有ddTTP的全长的核苷酸链,共4条子链,同理C、G泳道分别含有2、3条子链,而A泳道条带离点样孔最近,则腺嘌呤核苷酸为3'端最后一个核苷酸,此条带为全长的条带,故A泳道含有2条子链。 十三、“双脱氧法”基因测序 (3)原理 分4组PCR，都含有4种dNTP，每组一种ddNTP，即每组4+1原料 得到特定碱基为末端的片段 电泳分析，或电泳后检测荧光图谱 ⓵化学法DNA测序 DNA末端标记，再对某种碱基进行化学处理（如甲基化、N化、环化、去除）等，使DNA序列在特定部位断裂（类似于ddNTP处理) ⓶自动化测序 原理同PCR链终止法，只是用不同颜色荧光标记不同ddNTP，在一个泳道中直接得到四色图谱曲线 ⓷芯片测序 十三、“双脱氧法”基因测序 (3)原理 (4)其它测序方法 十三、“双脱氧法”基因测序 (5)习题巩固 1.双脱氧核苷酸常用于DNA测序，其结构与脱氧核苷酸相似，能参与DNA的合成，且遵循碱基互补配对原则。 DNA合成时，在DNA聚合酶作用下，若连接上的是双脱氧核苷酸，子链延伸终止；若连接上 的是脱氧核苷酸，子链延伸继续。在人工合成体系中，有适量的序列为GTACATACATG的单链模板、胸腺 嘧啶双脱氧核苷酸和4种脱氧核苷酸。则以该单链为模板合成出的不同长度的子链最多有（ ） A.2种 B.3种 C.4种 D.5种 D 2.双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） 与脱氧核苷三磷酸（dNTP） 的结构如图所示。已知ddNTP按碱基互补配对的方式加到正在复制的子链中后，子链的延伸立即终止。某同学要通过PCR技术获得被32 P标记且以碱基“C”为末端的、不同长度的子链DNA片段。在反应管中已经有单链模板、引物、 DNA聚合 酶和相应的缓冲液等，还需要加入下列哪些原料？( ) ① dGTP， dATP， dTTP， dCTP ② dGTP， dATP， dTTP ③ α“ 位32 P标记的ddCTP ④ γ 位 32 P标记的ddCTP A. ①③ B. ①④ C. ②③ D. ②④ A 十三、“双脱氧法”基因测序 (5)习题巩固 3.(多选)最早的双脱氧测序法是在 PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷 三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP 或 ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则， 以加入 ddATP 的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止,若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸,PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下 列叙述正确的是( ) A.上述 PCR 反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C.5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基 C 突变为 G AC 十三、“双脱氧法”基因测序 (5)习题巩固 ①在测序的PCR中需要添加缓冲液,缓冲液中含有Mg2+,Mg2+的作用是:____ __________________________,延伸温度一般设置在72 ℃,原因是______________ _____________________  引物 序列 A 5'-GCCCTCTACTCCCCGGTCTTG-3' 5'-GCCCATCTGCAAGTTATCCTA-3' B 5'-GGGATT-3' 5'-AATCCC-3' 十三、“双脱氧法”基因测序 (5)习题巩固 这是Taq DNA 激活耐高温的DNA聚合酶 聚合酶的最适温度 ②上表是某研究小组设计的两组引物,其中不合理的引物是______,理由是____________________________________________________________________。  B 引物太短、特异性弱,且两个引物的碱基互补,会配对形成二聚体 ③用放射自显影法显示后结果如图所示,据图分析,下列说法正确的是(　　) A.图中X含有11个碱基,在所有单链中相对分子质量最大,电泳速度最慢 B.待测单链DNA片段中胸腺嘧啶数与鸟嘌呤数相等 C.在含 ddTTP的试管中含有2种子链DNA片段 D.待测单链DNA模板的序列为5'-CTTGACGACGA-3' 十三、“双脱氧法”基因测序 (5)习题巩固 B ④第二代测序又称为高通量测序。第二代测序在 DNA 复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记(一般为荧光分子标记)来确定DNA的序列。这就要求在测序时,DNA分子必须同步复制,来增强荧光信号强度从而读出DNA序列。据此分析,第二代测序技术不适合测量较______(填“长”或“短”)的DNA序列,原因是________________________________________________ ___ 长 DNA分子越长,基因复制的同步性越低,导致测序质量下降 第十四部分 电泳与遗传、基因工程 (1)原理 十四、电泳与遗传、基因工程 ①电泳与遗传 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团带有正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。不同大小的DNA片段迁移速率不同，凝胶中的DNA分子通过染色可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。因此琼脂糖凝胶电泳能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段。等位基因由基因突变而来，若一对等位基因A、a经过限制酶切割后形成的DNA片段分子量不同，则在电场作用下移动距离不同，最终使得A、a得以分开，形成不同的条带。 ②电泳与基因工程 十四、电泳与遗传、基因工程 (2)习题巩固 1.植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变体Cer1(纯合体)，其颖壳蜡质合成有缺陷(本题假设完全无蜡质)。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致(本题假设完全阻断)，符合孟德尔遗传规律，回答下列问题。 ①在C基因两侧设计引物，PCR扩增， 电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分 别是突变体Cer1与野生型(WT，纯合 体)。据图判断，突变体Cer1中c基因 的突变类型是______________________。 碱基对的缺失 十四、电泳与遗传、基因工程 (2)习题巩固 ②将突变体Cer1与纯合野生型杂交，F1全为野生型，F1与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道_____和泳道_____(从1～5中选择)中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为_______。 3 1 1∶1 十四、电泳与遗传、基因工程 (2)习题巩固 ③进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因(位于另一条染色体上)也发生了突变，产生了基因d1，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是_____________。 密码子的简并 ④假设诱变过程中突变体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因d2。CCDD与ccd2d2个体杂交，F1的表型为野生型，F1自交，F2野生型与突变型的比例为_______，完善以下表格： 9∶7 F2部分个体基因型 棕榈酸(填“有”或“无”) 16-羟基棕榈酸(填 “有”或“无”) 颖壳蜡质(填“有”或“无”) Ccd2d2 有 ①_____ 无 CCDd2 有 有 ②_____ 有 有 2.由苯丙氨酸羟化酶基因突变引起的苯丙氨酸代谢障碍，是一种严重的单基因遗传病，称为苯丙酮尿症(PKU)，图1 是某患者的家族系谱图，其中Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3 及胎儿Ⅲ1(羊水细胞)的 DNA 经限制酶 MspⅠ消化，产生不同的片段(kb 表示千碱基对)，经电泳后用苯丙氨酸羟化酶 cDNA 探针杂交，结果见图2。 请回答下列问题: Ⅰ1、Ⅱ1 的基因型分别为_____________。 Aa、aa 十四、电泳与遗传、基因工程 (2)习题巩固 3.下图是某患者的家族遗传系谱图，其中部分成员的相关基因经扩增、电泳分离后结果见图2。已知人群中该病的发病率为1/225，不考虑基因突变及其他变异情况。下列分析不正确的是（　　） A.该病的遗传方式为常染色体隐性遗传 B.个体Ⅱ2与一个基因型为纯合子的正常个体婚配，生育的孩子为杂合子的概率为1/3 C.个体Ⅱ1与人群中某正常女性婚配，生育患病孩子的概率为1/32 D.对个体Ⅱ3的相关基因进行电泳后，会出现1条19kb条带 B 十四、电泳与遗传、基因工程 (2)习题巩固 4、肾上腺脑白质营养不良（ALD）是一种单基因遗传病，相关基因用A/a表示。某患ALD家系的遗传系谱图如图1所示，用某种限制酶处理此家系部分个体的有关该病的基因，得到大小不同的片段后进行电泳，电泳结果如图2所示，其中条带表示检出的特定长度的酶切片段，数字表示碱基对的数目。（不考虑X、Y染色体的同源区段）下列叙述正确的是（ ） A.该病的遗传方式是伴X染色体隐性遗传 B.Ⅱ1、Ⅲ1的基因型与Ⅲ3相同的概率为1/2 C.若个体Ⅱ₃和Ⅱ4再生一个男孩，患病的概率是1/4 D.若个体Ⅲ5为正常女孩，Ⅲ5相关基因经酶切、电泳后产生2种条带 AB 十四、电泳与遗传、基因工程 (2)习题巩固 5.先天性肾性尿崩症(CNDI)主要与AQP2和AVPR2基因有关,两基因中任一突变均可致病,其中一个基因位于X染色体上。现有甲、乙两个CNDI家系如图a,对两家系部分成员的AQP2基因检测结果如图b。不考虑其他因素的影响,下列判断错误的是(　　) 图a 图b A.由基因AVPR2突变引起的CNDI属于伴X染色体隐性遗传 B.就AQP2基因而言,甲Ⅱ-1与乙Ⅰ-1基因型相同的概率为2/3 C.乙Ⅱ-2产生的每个次级精母细胞含有0或2个致病基因 D.若甲Ⅱ-3与乙Ⅱ-1结婚,其子代男孩患CNDI的概率是1/3 D 十四、电泳与遗传、基因工程 (2)习题巩固 6.SSR是DNA中的简单重复序列，非同源染色体上的SSR重复单位不同，不同品种的同源染色体上的SSR重复次数不同，因此常用于染色体特异性标记。育种工作者发现一株花粉粒数目减少，部分花粉粒败育的突变体玉米，为研究其突变基因的遗传特点，利用玉米3号、4号染色体上特异的SSR进行PCR扩增，亲本、F1和F2的部分突变体SSR电泳分析结果如下图。 据图判断该突变基因位于_____号染色体上 3 3号染色体SSR扩增结果与亲本突变型3号染色体SSR扩增结果相同，所以突变基因位于3号染色体上。 十四、电泳与遗传、基因工程 (2)习题巩固 7.某科研小组将抗菌肽基因与大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因连接，组成融合基因，通过质粒构建基因表达载体并导入大肠杆菌中，以获得大量的抗菌肽。图1图2分别为融合基因和该实验所用质粒的结构示意图，请回答下列问题： 为构建重组质粒并保证基因能定向插入质粒中，需选择限制酶__________________________切割质粒和含融合基因的DNA片段；为确定重组质粒是否构建成功，用上述选择的限制酶分别对融合基因PCR产物、质粒和重组质粒进行完全酶切，再进行电泳，结果如图3所示。若重组质粒构建成功，请在图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 BamⅡ和HindⅢ 十四、电泳与遗传、基因工程 (2)习题巩固 $