专题八 课时3 基因工程-【优化探究】2026年高考生物二轮专题复习配套课件（多选版）

该高中生物学高考复习课件聚焦“生物技术与工程”专题，覆盖基因工程、PCR技术、基因编辑技术等核心考点，依据高考评价体系梳理工具、操作步骤、技术应用等考查维度，通过近五年真题分析明确基因表达载体构建（占比约30%）、PCR引物设计（占比约25%）等高频考点，归纳选择、填空等常考题型，体现备考针对性。 课件亮点在于“真题历练+核心整合+题组递进”策略，如结合2025年安徽卷真题解析限制酶选择技巧，培养科学思维和探究实践素养。通过“核心整合”模块归纳易错点，如启动子与起始密码子的区别，“题组训练”强化答题规范，帮助学生掌握得分技巧，教师可据此精准复习，提升备考效率。

生物技术与工程 专题八 课时3　基因工程 基因编辑技术及其应用 重难突破2 热点情境15 重难突破1 内容索引 NEIRONGSUOYIN 基因工程 PCR技术及其应用 基因工程 重难突破1 核心整合 要点分析 1.基因工程的基本工具 核心整合 要点分析 2.基因工程的操作步骤 (1)目的基因的筛选与获取 核心整合 要点分析 (2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建 核心整合 要点分析 提醒:①启动子和终止子:启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上);终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。 ②目的基因插入位置:启动子与终止子之间。 ③利用乳腺生物反应器生产药物时,应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。 核心整合 要点分析 (3)将目的基因导入受体细胞 核心整合 要点分析 (4)目的基因的检测与鉴定 核心整合 要点分析 提醒:PCR技术不仅可用于获取和扩增目的基因,还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。 核心整合 要点分析 3.蛋白质工程 核心整合 要点分析 4.限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端,如图乙)。 核心整合 要点分析 (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) 核心整合 要点分析 (3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 真题历练 感悟考情 1.(2025·安徽卷,15)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　) A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 答案:C 解析:使用氯化钙处理大肠杆菌,可使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,提高转化效率,即更多的大肠杆菌能吸收质粒,无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落),都可增加筛选平板上菌落数,A正确;如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落是含有质粒的菌株,但不一定含有目的基因,B正确;因质粒K中含两个标记基因,目的基因的插入破坏了β-半乳糖苷酶基因,使其无法表达β-半乳糖苷酶,筛选平板中长出的白色菌落即为导入了重组质粒的菌株,但是否表达目标蛋白,还需要用抗原—抗体杂交技术检测,C错误;若筛选平板中蓝色菌落偏多,说明质粒上的β-半乳糖苷酶基因仍然保持完整并且成功表达出β-半乳糖苷酶,可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌,D正确。 2.(2025·河南卷,21)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题。 (1)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1),对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切,随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有　　　 　酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,原因是__________________________ 　 。  BamHⅠ 重组质粒连接处的序列不再是 原来的限制酶识别序列 解析: E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率很低,其主要连接具有黏性末端的片段,因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶,即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶,而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同,若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割,会出现质粒和目的基因的自连,甚至目的基因倒接,因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个,而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶,又由于转录的方向是由启动子→终止子,且mRNA形成的方向是5'→3',mRNA与DNA的模板链方向相反,因此基因模板链的3'应靠近启动子,故为保证连接准确性和效率, cg转录模板链的5'端最好含有BamHⅠ酶切位点。T4 DNA连接酶既可以 连接平末端,也可连接黏性末端,不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接,由于限制酶的识别序列具有专一性,若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列,则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。 (2)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　,随后在含　　　　和　　　　　的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。  使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素 解析:为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶,使其菌落周围形成透明圈,且重组质粒上含有四环素抗性基因,因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中,培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (3)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性,研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键),如图2所示。根据分析结果,选择第　　　　位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适,原因是 ______________________________________________________________ 　 　 。  44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小 解析:据图2可知,虚线长度代表氨基酸间的空间距离,由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小,因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 【命题延伸　典题重组】 3.判正误 (1)(2023·辽宁卷)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列。(　　) √ (2)(2022·江苏卷)采用基因工程技术调控植物激素代谢,可实现作物改良。其中在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟。(　　) (3)(2021·辽宁卷)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。据此判断正误。 ①N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一。(　　) ②加入连接肽需要通过改造基因实现。(　　) ③检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境。(　　) √ √ √ × 4.练表达 (2023·海南卷)农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是_____________________________________________________   　 。  农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上 题组递进 素能提升 题组1　基因工程的原理及应用 1.(多选)(2025·江苏卷,19)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ 切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为 ,下列相关叙述正确的有(　　) A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型不同 C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致 D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 答案:BD 解析:对比A基因和a基因的序列,A基因中“AAGCTT”变为a基因中“AAGCTG”,是碱基替换(T→G),并非碱基增添,A错误;HindⅢ切割产生黏性末端,AluⅠ切割后产生的是平末端,二者末端类型不同,B正确;观察图中a基因,HindⅢ有2个切割位点,切割后会产生3个片段,AluⅠ有3个切割位点,切割后会产生4个片段,用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小不一致,C错误;因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同,所以产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定,D正确。 2.(2025·山东泰安二模)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达,研究人员构建了如图所示的表达载体,以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是(　　) A.表达载体中GUS基因和LUC基因转录时 使用同一条DNA单链为模板 B.为连入GUS基因,需用SalⅠ和SphⅠ酶切 已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D.通过观察是否出现荧光和蓝色物质检测双向启动子的作用效果 D 解析:转录是从子链(mRNA)5'→3'方向进行的,由题图可知,双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间,所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链,A错误;如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒会破坏LUC基因,B错误;T-DNA中含有潮霉素抗性基因,但不包含壮观霉素抗性基因,因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞,C错误;双向启动子如果正常表达,能合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶,催化底物分别产生荧光和生成蓝色物质,从而确定双向启动子的作用,D正确。 题组2　蛋白质工程基本原理及应用 3.(2025·广东深圳三模)蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时代。如通过蛋白质工程,将干扰素结构上的两个半胱氨酸改为丝氨酸,就可以使其保存半年,而活性不受影响。下列关于蛋白质工程的叙述,正确的是(　　) A.蛋白质工程的操作流程与中心法则的方向相同 B.蛋白质工程需要改造或合成蛋白质的编码基因 C.对干扰素的改造不需要考虑其空间结构 D.蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列 B 解析:蛋白质工程的操作流程与中心法则的方向相反,A错误;蛋白质工程是对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,最终通过基因改造或合成新基因来完成,B正确;对干扰素进行改造需要从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构,C错误;蛋白质工程不需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列,如通过蛋白质工程,将干扰素结构上的两个半胱氨酸改为丝氨酸,就可以使其保存半年,而活性不受影响,D错误。 4．(多选)(2025·江苏徐州模拟)枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成。这些碱性蛋白酶具有重要的应用价值，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。将枯草杆菌蛋白酶分子的Asp(99)和Glu(156)改成Lys，可使其在pH＝6时的活力提高10倍。下列说法不正确的是(　 　) A．完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现 B．该成果体现了蛋白质工程在培育新物种方面具有独特的优势 C.经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状不可遗传 D．蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息 BCD 解析：氨基酸的排列顺序是由基因决定的，因此完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现，A正确；该成果培育了新品种，而不是新物种，B错误；经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶的基因发生了改变，经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状可以遗传，C错误；蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，最终要达到的目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，以满足人类的需求，D错误。 PCR技术及其应用 重难突破2 核心整合 要点分析 1.PCR技术的原理、流程及应用 核心整合 要点分析 提醒:PCR过程的两点提醒 ①复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时,引物与DNA模板的结合是随机的,也存在DNA解开的两条链的结合。 ②PCR反应的产物并不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物,比所需的DNA片段要长,从第三次循环才出现所需的DNA片段,这样的片段存在两种引物。 核心整合 要点分析 2.PCR中设计引物的一般原则 (1)引物长度一般以20~30个核苷酸为宜,过短会降低特异性,过长会引起复性时结合的模板数减少,降低反应效率。 (2)要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。 (3)引物5'末端碱基可添加与模板无关的序列(如限制酶的识别序列、启动子序列等),便于克隆和表达。 (4)引物的碱基序列不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其他序列均应无明显同源性,以免造成不必要的非特异性扩增。 真题历练 感悟考情 1.(2025·广东卷,7)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的(　　) A.1'-碱基　　　　　　 B.2'-氢 C.3'-羟基 D.5'-磷酸基团 C 解析:已知DNA聚合酶催化延伸子链方向是5'→3',原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基,可以结合下一个脱氧核苷酸的5'碳的磷酸基团,故为了确保DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基,使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5'碳的磷酸基团,C正确。 2.(2025·黑吉辽蒙卷,25)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从　　　　　　 　　中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入　　　　和　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用　　　　　　连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后, 质粒pYL对应部分大小基本不变。  基因序列数据库(或GenBank或DNA序列数据库) XhoⅠ XbaⅠ DNA连接酶 解析:可从基因序列数据库中查询基因N的编码序列,设计特定引物。分析图1可知,质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切,由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列,故N基因不能使用SpeⅠ酶切,XbaⅠ与其具有相同的黏性末端,基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ,即N基因两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列;N基因a链为转录模板链,扩增后的目的基因转录模板链上含有引物1,编码链上含有引物2,结合质粒pYL上的启动子和终止子方向,可知应该在引物1的5'端添加XhoⅠ识别序列,引物2需要5'端添加XbaⅠ,PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用DNA连接酶连接DNA片段。 (2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有 　 　　　的污染。初步判断实验组　　　(从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是____________________ _____________________________________________________________ 　                                                                         　 。  外源DNA(或外源基因、基因N) 1 基因N大小为重组质粒大小和质粒pYL大小的差值,约为2.3 kb,对应实验组1的电泳条带(或实验组1电泳条带大小加质粒pYL大小约等 于重组质粒大小) 解析:在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。质粒pYL大小为7.2 kb,重组质粒大小约9.5 kb,构建重组质粒前后质粒pYL对应部分大小基本不变,基因N大小为二者的差值,约为2.3 kb(2~2.3 kb),结合图2电泳结果可知,实验组1的电泳条带大小约为2 300 bp,说明实验组1的质粒中成功插入了基因N。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有　　　 　。  a:5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b:5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c:5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d:5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' GCC 解析: a是诱变第240位脯氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列,与丙氨酸的密码子序列相同),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物,其配对模板与a的配对模板相同,据此分析,除编码第243位苯丙氨酸的碱基序列TTC替换为诱变序列,与丙氨酸的密码子序列相同,其后的编码序列应该与a相同,为TGG/CTG/TTT……,所以该引物是c,其中GCC为第243位诱变序列,故丙氨酸的密码子还可以是GCC。 (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　 　　　含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。  解析:本题旨在通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N并进行改造,提高香树脂醇合酶的催化效率,高效生产香树脂醇,所以检测转基因酵母菌发酵产物香树脂醇的含量并进行比较,可以选出香树脂醇合酶催化效率较高的香树脂醇合酶基因改造方案。 香树脂醇 【命题延伸　典题重组】 3.判正误 (1)(2021·山东卷)我国考古学家利用现代人的DNA序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”,成功将极其微量的古人类DNA从提取自土壤沉积物中的多种生物的DNA中识别并分离出来,用于研究人类起源及进化。设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列。(　　) (2)(2021·湖北卷)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。增加模板DNA的量可减少反应中非特异条带的产生。(　　) √ × (3)(2021·江苏卷)热启动PCR可以提高扩增效率,方法之一是先将除耐高温的聚合酶以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增,与常规PCR相比,热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物。(　　) √ 4.练表达 (2022·山东卷)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________ 　 　　　　　　　　　　　　　　。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的　　　　(填“3'端”或“5'端”)。  能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 题组递进 素能提升 题组1　PCR技术中引物的选择与设计 1.(2025·辽宁抚顺模拟)下列关于PCR技术的叙述,正确的是(　　) A.PCR反应体系中需要添加解旋酶以获得单链模板 B.已知模板DNA的部分碱基序列是设计PCR引物的前提条件 C.在恒温条件下进行PCR扩增以避免温度变化导致酶失活 D.在设计两种引物时,需要让引物和引物之间的碱基序列互补 B 解析:PCR过程中高温会使DNA的双螺旋结构解旋,双链分开,从而获得单链模板,不需要解旋酶,A错误;该技术的引物需要与模板DNA发生碱基互补配对,因此,已知模板DNA的部分碱基序列是设计PCR引物的前提条件,B正确;PCR是变性(95 ℃左右)、复性(50 ℃左右)、延伸(72 ℃左右)不断循环的过程,不是在恒温条件下进行的,C错误;两种引物的碱基间不能互补配对,否则引物之间会相互结合,失去了引物的作用,D错误。 2.为了对重金属污染的土壤进行生物修复,研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接,导入杨树基因组中(如图)。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因,同时避免内源HMA3基因的干扰,在进行PCR扩增时,应选择的引物组合是(　　) A.①+③　　　　　　　　 B.①+② C.③+② D.③+④ B 解析:图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接,导入杨树基因组中,若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子,需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列,同时避免内源HMA3基因的干扰,应选择的引物组合是①+②,B正确。 题组2　PCR技术的应用实例分析 3.(2025·安徽芜湖二模)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.反向PCR应选择引物1和引物4进行PCR扩增 B.设计的引物不宜过短,否则扩增的特异性会下降 C.PCR产物是包含已知序列和所有未知序列的环状DNA分子 D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶 C 解析:DNA子链合成的方向为5'端到3'端,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行反向PCR应选择引物1和引物4进行PCR扩增,A正确;设计的引物不宜过短,否则扩增的特异性会下降,B正确;PCR产物是包含小部分已知序列和所有未知序列的链状DNA分子,扩增产物需要经过限制酶切割后再用DNA连接酶连接才能形成环状,C错误;整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,D正确。 4.(2025·北京昌平二模)如图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图,下列相关叙述错误的是(　　) A.需要设计并合成一段含有突变碱基的DNA引物 B.该技术能够实现特异性地替换任何一个特定碱基 C.通过电泳检测产物大小,即可确认基因突变是否成功 D.利用上述技术能够改造蛋白质的结构和功能 C 解析:定点突变技术通常需要设计并合成一段含有突变碱基的DNA引物,用于引导DNA合成过程中的特定碱基替换,A正确;定点突变技术能够实现特异性地替换任何一个特定碱基,这是该技术的主要优势之一,B正确;通过电泳检测产物大小不能直接确认基因突变是否成功,电泳主要用于检测DNA片段的大小,而确认突变是否成功通常需要进一步的测序分析,C错误;定点突变技术可以通过改变基因的碱基序列来改变蛋白质的结构和功能,这是该技术的重要应用之一,D正确。 基因编辑技术及其应用 热点情境15 (2024·新课标卷,11)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 真题导向 (1)限制酶切割的化学键是　　　　 　　。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是_________________________________________ 　  　 。  解析:限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是不破坏标记基因,保证质粒启动子、终止子完整,使N基因正常表达。 磷酸二酯键 不破坏标记基因,保证质粒启动子、终止子完整,使N基因正常表达 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和　　　　　　　 　　。  解析: RNA的碱基组成为A、U、G、C,DNA的碱基组成为A、T、G、C,向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C、C—G、A—T、U—A。 C—G、A—T、U—A (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是　　　　　 　　;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是　 　　 。  解析:用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因,验证片段甲插入了细菌B1基因组得到含N基因的菌株B2,所用的模板是菌株B2的基因组DNA;用该模板与引物P3和P4进行PCR,因为P3能与菌株B1的基因组结合而不能与B2的基因组结合,实验结果是不能扩增出目的产物。 菌株B2的基因组DNA 无法扩增出目的产物 (4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 　  (答出2点即可)。 解析:与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、能增加土壤养分。 不污染环境、能增加土壤养分 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。 CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补,从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合,并在特定位点切割DNA。 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物,与传统的基因工程相比,其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 情境拓展 1.(2025·黑龙江哈尔滨二模)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应,研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑,剔除猪的相关基因。CRISPR/Cas9系统含有向导RNA(sgRNA),sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割,其机制如图。下列叙述错误的是(　　) 对点演练 A.上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因 B.基因工程常选择动物受精卵作为受体细胞的主要原因是受精卵具有全能性 C.复合体中,sgRNA特异性识别目标DNA,Cas9蛋白作用于磷酸二酯键 D.sgRNA会因错误结合出现脱靶现象,一般sgRNA序列越长,脱靶率越高 答案:D 解析:免疫排斥主要与标明身份的标签蛋白质相关,题述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因,A正确;常选择受精卵作为受体细胞的主要原因是受精卵的全能性高,B正确;由题图可知,Cas9蛋白可以对基因特定位点进行切割,相当于限制酶,即Cas9蛋白作用于磷酸二酯键,C正确;sgRNA序列越短,sgRNA错误结合的概率越高,脱靶率越高,D错误。 2.(2025·湖北宜昌二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA,精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA,相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失,制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9 mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中,获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型,电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物,下列相关分析正确的是(　　) A.核酸酶Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键,引起的变异属于基因重组 B.图2中,4和12个体杂交的子代均为基因敲除杂合子(不考虑性别) C.图2中,3、5、9个体的体内均能检测到PD-1基因,8和10个体则不能检测到该基因 D.欲将基因的2、3、4共3个片段切除,敲除前需要设计2个向导sgRNA 答案:D 解析:图1中,通过删除编码PD-1蛋白功能区的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失,指的是将野生型基因内部的部分碱基剪切,作用在磷酸二酯键,改变的是基因内部的碱基序列,属于可遗传变异中的基因突变,A错误;基因敲除后,其核苷酸数量减少,电泳时移动速度快,距离点样孔远,4和12个体均为敲除纯合子,杂交的子代均为基因敲除纯合子,B错误;3和8个体的基因未敲除,5个体和9个体为基因敲除杂合子,体内均能检测到PD-1基因,10个体为突变基因纯合子,不能检测到PD-1基因,C错误;由图1可知,若将基因的2、3、4共3个片段切除,需要设计2个向导sgRNA,D正确。 $